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1、(10)申请公布号 CN 103386127 A (43)申请公布日 2013.11.13 CN 103386127 A *CN103386127A* (21)申请号 201310346315.7 (22)申请日 2013.08.09 A61K 39/17(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12N 7/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 浙江美保龙生物技术有限公司 地址 321017 浙江省金华市婺城区宾虹路二 段 298 号 308 室 (72)发明人 李阳 闫艳丽 刘雪 王二先 徐晓艳 盛璐丝 (74)专利代理机构 杭州浙。
2、科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33213 代理人 吴秉中 (54) 发明名称 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫 病毒制备疫苗的方法 (57) 摘要 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫 病毒制备疫苗的方法， 属于兽用生物制品技术领 域。其包括以下步骤 ： 1） 种细胞的传代与培养 ； 2） 细胞适应毒种的繁殖 ； 3） 繁殖病毒用细胞的悬 浮培养 ； 4） 病毒的培养与收获 ； 5） 鸡新城疫活疫 苗制备 ； 6） 鸡新城疫灭活疫苗制备。采用该方法 制备疫苗生产工艺简单且稳定、 易操作， 病毒含量 高、 批间差异小， 质量易控， 可显著提高疫苗产量 和质量， 生产出的鸡新城疫疫苗安。
3、全性好、 免疫效 力高， 对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护 作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 103386127 A CN 103386127 A *CN103386127A* 1/1 页 2 1. 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征在于包括 以下工艺步骤 ： 1） 种细胞的传代与培养 ： 鸡胚传代细胞系 DF-1 经胰酶细胞分散液消化传代， 以细胞生 长液继续培养， 形成良好单层时， 用于继续传代或接种病毒 ；。
4、 2） 细胞适应毒种的繁殖 ： 取细胞适应的新城疫病毒毒种， 接种于步骤 1） 中已长成单层 的鸡胚传代细胞 DF-1 中， 置 37 38继续培养， 细胞病变率达 75% 以上时收获病毒悬液 ； 3） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 将步骤 1） 培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中， 吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养 ； 4） 病毒的培养与收获 ： 将步骤 2） 得到的细胞适应的新城疫病毒悬液接种于生物反应 器中， 换用维持液进行培养， 接毒后实时监测糖耗情况， 当糖耗接近 0 时， 即开始收获病毒， 收获病毒后， 反复冻融灌注袋， 收获全悬病毒液， 经检验合格后置于 -20保。
5、存 ； 5） 鸡新城疫活疫苗制备 ： 将步骤 4） 中得到的病毒液进行无菌检验、 病毒含量测定， 检 验合格后经配苗、 分装和冻干制成鸡新城疫活疫苗 ； 6） 鸡新城疫灭活疫苗制备 ： 将步骤 4） 中得到的病毒液进行无菌检验、 病毒含量测定， 检验合格后进行甲醛灭活， 灭活检验合格后进行乳化分装制成鸡新城疫灭活疫苗。 2. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的步骤 3） 中生物反应器为激流灌注式生物反应器。 3. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的步骤 3） 中生。
6、物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片， 使用前用灭 菌 PBS 浸泡过夜。 4. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的步骤 3） 中悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量为 4 8109个细胞。 5. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的步骤 3） 中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生 长液， 确保残糖不低于 1g/L。 6. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的。
7、 方法， 其特征在于所述的步骤4） 中培养条件为 ： 温度3738， pH7.47.6， 溶解氧30% 50%。 7. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的步骤 4） 中病毒接种量为 0.5%。 8. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗 的方法， 其特征在于所述的步骤 5） 中病毒液的病毒含量测定方法为鸡胚半数组织感染量 EID50， 每 0.1ml 病毒含量应 108.5EID50。 9. 如权利要求 1 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的 方法， 其特征在于所述的细。
8、胞生长液含90%DMEM/F12、 810%胎牛血清、 90100U/ml抗生 素， pH 7.2 7.4， 溶解氧为 30% 60%， 含糖 4.0g/L ； 所述维持液含 98%DMEM/F12、 2% 胎牛 血清、 90 100U/ml 抗生素， 其 pH 7.2 7.4， 溶解氧为 30% 50%， 含糖 4.0g/L。 权 利 要 求 书 CN 103386127 A 2 1/7 页 3 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗 的方法 技术领域 0001 本发明属于兽用生物制品技术领域， 具体涉及用鸡胚传代细胞系和生物反应器培 养新城疫病毒制备疫苗的方法。 背景技术 00。
9、02 新城疫 (Newcastle disease， ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus， NDV) 引起的一种烈性病毒性传染病， 是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一， 也是我 国所有鸡病中危害最大的一种， 被国际兽医局 (OIE) 列为 A 类传染病。目前， 新城疫在我 国全国范围内发病仍然比较普遍， 它制约着我国养禽业的发展及禽产品的出口， 也对食品 安全及人类健康存在潜在的危害。 对于该病的控制， 在发达国家以捕杀强毒感染群为主， 同 时结合疫苗接种 ； 而对于广大发展中国家， 疫苗接种仍是控制该病的主要手段。 随着我国养 禽业的迅猛发展， 对新。
10、城疫的防治越来越重要。 因此研制出高效、 安全、 生产工艺简单、 价格 低廉、 适用的新城疫疫苗有重要意义。 0003 我国目前鸡新城疫活疫苗的生产主要采用传统的鸡胚培养或者转瓶原代细胞培 养病毒液制备疫苗。直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制， 同时采用胚体 繁殖病毒， 由于培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白会给疫苗制备带来安全隐患， 另外胚体 废弃物处理不当也会存在散毒的危险。转瓶原代细胞培养技术虽然比较成熟， 但是制备原 代成纤维细胞工序繁琐， 并且批次间差异较大， 培养的病毒量小毒价低， 同时也存在胚体源 外源病毒污染的生物安全隐患。 0004 专利公开号为 CN10260046。
11、5A 的专利申请， 公开了一种鸡新城疫活疫苗的生产方 法及其产品， 该专利培养新城疫病毒的方法所采用的细胞系包括 MDCK 细胞系、 vero 细胞 系、 marc-145 细胞系、 ST 细胞系、 BHK 细胞系或 MDBK 细胞系， 而采用鸡胚传代细胞系培养新 城疫病毒制备活疫苗的方法并未见报道。上述细胞系针对于禽来说种间差异大， 由此制备 得来的疫苗对于鸡异源性程度较高， 易引起更大的刺激。 相对于哺乳动物细胞， 鸡胚源传代 细胞系更适宜新城疫病毒的增值， 制备的疫苗对于鸡更加安全， 应激更小。 0005 近年来， 生物反应器和微载体技术培养细胞、 繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。 与传。
12、统的胚体和转瓶培养工艺相比， 悬浮培养技术有着巨大的优势 ：（1） 单位体积内有效 工作细胞数量增加 ；（2） 全密闭、 管道化系统生产流程及过程自动化监控、 控制技术， 不仅 减少了污染细胞的机会， 而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响 ；（3） 生物反 应器容积的扩大， 提高了产品的均一性， 也提高了产品的产量和质量 ；（4） 生产疫苗所用的 成本远低于传统胚体培养工艺与转瓶培养工艺， 综合成本大大降低。我国的生物反应器悬 浮培养技术起步较晚， 但近几年该技术在国内的发展非常快。 发明内容 0006 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供用鸡胚传代细胞系和生物 说 明 。
13、书 CN 103386127 A 3 2/7 页 4 反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法的技术方案， 采用该方法制备疫苗生产工艺简单且 稳定、 易操作， 病毒含量高、 批间差异小， 质量易控， 可显著提高疫苗产量和质量， 生产出的 鸡新城疫疫苗安全性好、 免疫效力高， 对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。 0007 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于包括以下工艺步骤 ： 1） 种细胞的传代与培养 ： 鸡胚传代细胞系 DF-1 经胰酶细胞分散液消化传代， 以细胞生 长液继续培养， 形成良好单层时， 用于继续传代或接种病毒 ； 2） 细胞适应毒种的。
14、繁殖 ： 取细胞适应的新城疫病毒毒种， 接种于步骤 1） 中已长成单层 的鸡胚传代细胞 DF-1 中， 置 37 38继续培养， 细胞病变率达 75% 以上时收获病毒悬液 ； 3） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 将步骤 1） 培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中， 吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养 ； 4） 病毒的培养与收获 ： 将步骤 2） 得到的细胞适应的新城疫病毒悬液接种于生物反应 器中， 换用维持液进行培养， 接毒后实时监测糖耗情况， 当糖耗接近 0 时， 即开始收获病毒， 收获病毒后， 反复冻融灌注袋， 收获全悬病毒液， 经检验合格后置于 -20保存 ； 5） 鸡新城疫。
15、活疫苗制备 ： 将步骤 4） 中得到的病毒液进行无菌检验、 病毒含量测定， 检 验合格后经配苗、 分装和冻干制成鸡新城疫活疫苗 ； 6） 鸡新城疫灭活疫苗制备 ： 将步骤 4） 中得到的病毒液进行无菌检验、 病毒含量测定， 检验合格后进行甲醛灭活， 灭活检验合格后进行乳化分装制成鸡新城疫灭活疫苗。 0008 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 3） 中生物反应器为激流灌注式生物反应器。 0009 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 3） 中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片， 使用前用。
16、灭菌 PBS 浸泡过 夜。 0010 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 3） 中悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量为 4 8109个细胞。 0011 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 3） 中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液， 确保残 糖不低于 1g/L。 0012 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 4） 中培养条件为 ： 温度 37 38， pH7。
17、.4 7.6， 溶解氧 30% 50%。 0013 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 4） 中病毒接种量为 0.5%。 0014 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的步骤 5） 中病毒液的病毒含量测定方法为鸡胚半数组织感染量 （EID50） ， 每 0.1ml 病毒含量应 108.5EID50。 0015 所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法， 其特征 在于所述的细胞生长液含90%DMEM/F12、 810%胎牛血清、 90100U/ml抗生素， pH 7.2 7.。
18、4， 溶解氧为 30% 60%， 含糖 4.0g/L ； 所述维持液含 98%DMEM/F12、 2% 胎牛血清、 90 说 明 书 CN 103386127 A 4 3/7 页 5 100U/ml 抗生素， 其 pH 7.2 7.4， 溶解氧为 30% 50%， 含糖 4.0g/L。 0016 本发明具有积极有益的效果 ： 1、 本发明采用 DF-1 鸡胚传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养， 避免了用鸡胚和原代细 胞生产时胚体培养中大量杂蛋白的影响。 0017 2、 本发明采用 DF-1 鸡胚传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养， 避免了采用异源性 细胞生产新城疫病毒制备的疫苗免疫时应激较大的不良效果。
19、。 0018 3、 本发明采用 DF-1 鸡胚传代细胞系进行鸡新城疫病毒培养， 不含因胚体带来的 外源病毒， 也消除了对环境造成的安全隐患。 本发明制备的病毒抗原纯净、 品质均一、 稳定， 使用安全无污染。 通过原材料和培养条件的严格控制， 保证生产出来的疫苗纯粹， 确保疫苗 的安全性。 0019 4、 采用本发明培养的新城疫病毒液各批间质量差异小， 提高了疫苗质量， 又克服 了疫苗大量生产受制于鸡胚的供应， 节省了生产成本。另外还具有生产工艺简单、 稳定、 易 操作、 产量大、 成本低等特点， 因而有很好的经济效益和应用前景。 0020 5、 本发明采用了先进的悬浮培养设备与技术 ：（1） 。
20、以糖耗为技术指标以及先进的 控制系统 ；（2） 在细胞培养方面增加了细胞密度 ；（3） 在培养病毒时提高了病毒滴度 ；（4） 可使后续制备的疫苗效价大大提高， 同时降低了疫苗的副反应。 （5） 采用了连续、 完全封闭 的细胞与病毒培养方式， 完善了生产过程中的可控性， 确保病毒悬液的稳定性。 具体实施方式 0021 为了使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下列实施例中未提及的具体实 验方法， 通常按常规实验方法进行。 0022 实施例 1 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备活疫苗， 包括以下。
21、 步骤 : （1） 生物反应器的选择 ： 激流式反应器 AP-20， 体积为 7L。 0023 （2） 细胞的选择 ： 鸡胚传代细胞系 DF-1， 适合鸡新城疫病毒生长的传代细胞系， 无 致癌性， 购于美国菌种保藏中心 ； （3） 病毒毒株的选择 ： 选用鸡新城疫病毒 La sota 株， 可在中国兽医药品监察所购得。 0024 （4） 种细胞的培养 ： 利用方瓶进行 DF-1 细胞的培养， 一般按 1:3 1:5 传代， 待细 胞长满单层后消化、 计数， 用于细胞的大规模培养。 0025 （5） 细胞适应毒种的繁殖 ： 取细胞适应的新城疫病毒毒种， 接种于步骤 （4） 中已长 成单层的鸡胚传。
22、代细胞DF-1中， 置3738继续培养， 细胞病变率达75%以上时收获病毒 悬液。 0026 （6） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 首先准备生物反应器 ： 检漏激流袋和灌注袋 ； 采 用灭菌PBS浸泡微载体过夜 ； 校正温度电极、 pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌 ； 组装生物 反应器， 注入细胞生长液， 循环 24 小时进行系统的无菌检验。验证合格后， 步骤 （4） 培养得 到的细胞悬浮液经酶消化后接种反应器进行悬浮培养， 悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量为 4 8109个细胞。每天监测培养液中葡萄糖 含量， 计算葡萄糖消耗。控制。
23、培养液中含糖量， 当残糖低于 1g/L 时， 全部换液一次。 说 明 书 CN 103386127 A 5 4/7 页 6 0027 （7） 所述步骤 （6） 细胞生长液含 90% DMEM/F12、 10% 胎牛血清、 100U/ml 抗生素， 细 胞生长液的 pH 为 7.2 7.4， DO 为 30% 60%， 含糖 4.0g/L。 0028 （8） 病毒的培养与收获 ： 当细胞的葡萄糖消耗量最大时， 视为细胞长至最大密度， 按 0.5% 新城疫细胞适应病毒悬液接种， 换用维持液进行培养， 培养条件为温度 37 38， pH7.4 7.6， 溶解氧 30% 50%。种毒在灌注袋中的细胞上。
24、吸附 1h 后开始循环。培养 12h 开始取样， 每 2h 取一次样， 测定葡萄糖消耗和病毒滴度， 并及时补充培养基和葡萄糖。当糖 耗为 0 时， 视细胞绝大多数已病变， 收获病毒， 冻融灌注袋内细胞 2 次 （裂解细胞） ， 测定病毒 毒价。 0029 （9） 所述步骤 （8） 中的细胞维持液含 98% DMEM/F12、 2% 胎牛血清、 100U/ml 抗生素， 维持液的 pH 为 7.2 7.4， DO 为 30% 50%， 含糖 4.0g/L。 0030 （10） 制苗用病毒液的检测 无菌检验 ： 将收获的病毒悬液每瓶分别取样， 按 中华人民共和国兽药典 附录进行检 验， 结果无细菌。
25、、 霉菌等生长。 0031 病毒含量测定 ： 用灭菌生理盐水将病毒悬液作 10 倍系列稀释， 取 10-7、 10-8、 10-9三 个稀释度各尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚 5 个， 每胚 0.1ml， 置 36 37继续孵育， 48 小 时以前死亡的鸡胚弃去不计， 在 48 120 小时死亡的鸡胚随时取出， 收获鸡胚液， 同一稀 释度的鸡胚液等量混合， 按稀释度分别测定红细胞凝集价， 至 120 小时， 取出所有活胚， 逐 个收获鸡胚液， 分别测定红细胞凝集价， 凝集价 1:160（微量法 1:128） 者判为感染， 计算 EID50， 病毒含量应 109.0EID50/0.1ml。
26、。 0032 试验表明， 利用鸡胚传代细胞系 DF-1 细胞， 将鸡胚培养法和转瓶成纤维细胞培养 病毒液改为转瓶 DF-1 细胞培养新城疫病毒液， 其毒价可提高 100 倍以上。 0033 （11） 配苗、 分装及冻干 ： 将检验合格的病毒悬液加一定比例的 5% 蔗糖脱脂牛奶作 为保护剂， 同时加入适宜抗生素， 充分摇匀， 定量分装 ； 分装后迅速进行冷冻真空干燥后制 成成品， 每羽份病毒含量应 107.0EID50。 0034 按本实施例共制备出 3 批鸡新城疫活疫苗 （La sota 株） ， 批号分别为 H201301、 H201302、 H201303， 制备的疫苗物理性状、 无菌检验。
27、、 安全检验、 效力检验等均达到要求。 0035 实施例 2 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备灭活疫苗， 包括如 下步骤 : （1） 生物反应器的选择 ： 激流式反应器 AP-20， 体积为 7L。 0036 （2） 细胞的选择 ： 鸡胚传代细胞系 DF-1， 适合鸡新城疫病毒生长的传代细胞系， 无 致癌性， 购于美国菌种保藏中心。 0037 （3） 病毒毒株的选择 ： 选用鸡新城疫病毒 La sota 株， 可在中国兽医药品监察所购 得。 0038 （4） 种细胞的培养 ： 利用方瓶进行 DF-1 细胞的培养， 一般按 1:3 1:5 传代， 待细 胞长满单层后消化、 计数， 。
28、用于细胞的大规模培养。 0039 （5） 细胞适应毒种的繁殖 ： 取细胞适应的新城疫病毒毒种， 接种于步骤 （4） 中已长 成单层的鸡胚传代细胞DF-1中， 置3738继续培养， 细胞病变率达75%以上时收获病毒 悬液。 0040 （6） 繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ： 首先准备生物反应器 ： 检漏激流袋和灌注袋 ； 采 说 明 书 CN 103386127 A 6 5/7 页 7 用灭菌PBS浸泡微载体过夜 ； 校正温度电极、 pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌 ； 组装生物 反应器， 注入细胞生长液， 循环 24 小时进行系统的无菌检验。验证合格后， 步骤 （4） 培养得 到的细胞悬浮液经酶消。
29、化后接种反应器进行悬浮培养， 悬浮培养条件为 ： 温度 37 38， pH7.0 7.6， 溶解氧 30% 60%， 接种量为 4 8109个细胞。每天监测培养液中葡萄糖 含量， 计算葡萄糖消耗。控制培养液中含糖量， 当残糖低于 1g/L 时， 全部换液一次。 0041 （7） 所述步骤 （6） 细胞生长液含 90% DMEM/F12、 8% 胎牛血清、 90U/ml 抗生素， 细胞 生长液的 pH 为 7.2 7.4， DO 为 30% 60%， 含糖 4.0g/L。 0042 （8） 当细胞的葡萄糖消耗量最大时， 视为细胞长至最大密度， 按 0.5% 新城疫细胞 适应病毒悬液接种， 换用维。
30、持液进行培养， 培养条件为温度 37 38， pH7.4 7.6， 溶解 氧 30% 50%。种毒在灌注袋中的细胞上吸附 1h 后开始循环。培养 12h 开始取样， 每 2h 取 一次样， 测定葡萄糖消耗和病毒滴度， 并及时补充培养基和葡萄糖。当糖耗为 0 时， 视细胞 绝大多数已病变， 收获病毒， 冻融灌注袋内细胞 2 次 （裂解细胞） ， 测定病毒毒价。 0043 （9） 所述步骤 （8） 中的细胞维持液含 98% DMEM/F12、 2% 胎牛血清、 90U/ml 抗生素， 维持液的 pH 为 7.2 7.4， DO 为 30% 50%， 含糖约 4.0g/L。 0044 （10） 制苗。
31、用病毒液的检测 无菌检验 ： 将收获的病毒悬液每瓶分别取样， 按 中华人民共和国兽药典 附录进行检 验， 结果无细菌、 霉菌等生长。 0045 病毒含量测定 ： 用灭菌生理盐水将病毒悬液作 10 倍系列稀释， 取 10-7、 10-8、 10-9三 个稀释度各尿囊腔内接种 10 日龄 SPF 鸡胚 5 个， 每胚 0.1ml， 置 36 37继续孵育， 48 小 时以前死亡的鸡胚弃去不计， 在 48 120 小时死亡的鸡胚随时取出， 收获鸡胚液， 同一稀 释度的鸡胚液等量混合， 按稀释度分别测定红细胞凝集价， 至 120 小时， 取出所有活胚， 逐 个收获鸡胚液， 分别测定红细胞凝集价， 凝集。
32、价 1:160（微量法 1:128） 者判为感染， 计算 EID50， 病毒含量应 109.0EID50/0.1ml。 0046 （11） 病毒悬液灭活与检验 ： 灭活时甲醛的终浓度为 0.2%， 37下灭活 16 小时， 灭 活后按常规方法进行灭活检验。 0047 （12） 乳化、 分装 ： 按常规方法制备油相， 取灭活检验合格的病毒液 96 份， 加入高压 灭菌冷却后的吐温 -80 4 份， 充分搅拌， 直至吐温 -80 完全溶解， 制得水相 ； 取油相 2 份置 乳化罐中进行搅拌， 3060s 内将水相 1 份缓缓加入油相进行乳化， 加完后以 3000rpm 搅拌 20min， 乳化后分。
33、装制成鸡新城疫灭活疫苗。 0048 按本实施例共制备出 3 批鸡新城疫灭活疫苗 （La sota 株） ， 批号分别为 M201301、 M201302、 M201303， 制备的疫苗物理性状、 无菌检验、 安全检验、 效力检验等均达到要求。 0049 试验例 1 新城疫病毒细胞适应驯化 一 材料 1、 病毒 ： 鸡新城疫病毒 La sota 株， 购自中国兽医药品监察所。 0050 2、 细胞系 ： DF-1 细胞系， 购自 ATCC。 0051 3、 试剂及培养基 ： DMEM/F12， 购自 GIBCO ； 血清， 购自武汉三利 （优级胎牛血清） ； 0.25% 胰酶 （GIBCO 27。
34、250） +0.02%EDTA ； 7.5% 碳酸氢钠 ； 4、 器材 康宁 6 孔细胞培养板， 移液器、 生物安全柜等。 0052 二 方法 说 明 书 CN 103386127 A 7 6/7 页 8 1、 6 孔细胞板制备 将方瓶长满单层的 DF-1 细胞经胰酶消化分散， 按每孔 30 万个细胞将细胞悬液铺至 6 孔板， 长满单层后备用。 0053 2、 病毒接种 将新城疫弱毒株 La sota 株接种至长满单层的 DF-1 细胞系， 吸附 1 小时后， 加入含胰 酶的维持液， 六孔细胞加入的胰酶终浓度分别为 0.05g/ml、 0.2g/ml、 0.5g/ml、 1g/ ml、 5g/。
35、ml、 0g/ml， 加维持液后置 37 38培养 30 45 小时， 收获病毒液。 0054 3、 传代培养 将上述收获的细胞毒液冻融一次后， 按相同方法进行一次培养和收获， 如此连续进行 培养。当六孔板中出现病变时， 收获病变细胞液， 继续按相同胰酶量进行传代培养， 直至各 代次病变稳定。 0055 4、 去胰酶培养 将上述胰酶处理各代次稳定出现病变的细胞毒液进行去胰酶化处理。 处理方法为将原 胰酶浓度梯度降低， 并进行传代培养， 直至胰酶浓度为 0， 依此筛选出出现稳定病变的细胞 毒。 0056 三 结果 1、 细胞毒传代培养结果 将新城疫弱毒株 La sota 株接种至长满单层的 DF。
36、-1 细胞系， 吸附 1 小时后， 加入含胰 酶的维持液， 六孔细胞加入的胰酶终浓度分别为 0.05g/ml、 0.2g/ml、 0.5g/ml、 1g/ ml、 5g/ml、 0g/ml， 加维持液后置 37 38培养 30 45 小时， 收获病毒液。冻融一次 后继续按相同方法进行传代培养， 结果表明， 胰酶终浓度为 5g/ml 最早出现病变， 1g/ ml 次之、 0.5g/ml 最后出现病变， 0.05g/ml、 0.2g/ml 均没有出现病变， 详见下表。 0057 表各胰酶浓度出现病变的代次 2、 去胰酶培养结果 将上述胰酶处理各代次稳定出现病变的细胞毒液进行去胰酶化处理。 处理方法。
37、为将原 胰酶浓度梯度降低， 并进行传代培养， 直至胰酶浓度为 0， 依此筛选出出现稳定病变的细胞 毒。 结果表明， 5g/ml组和1g/ml组在胰酶梯度化处理传代过程中逐渐失去致细胞病变 的特性。而 0.5g/ml 组在胰酶终浓度为 0 时仍保持良好的致细胞病变特性， 无胰酶传代 培养表明这种致细胞病变特性至少可保持 10 代。且各代次均表现出良好的血凝性， 血凝价 均 10log2。将细胞适应毒株建立种子批， 冻存作为种毒备用。 0058 试验例 2 新城疫病毒最佳接毒量的研究 一 材料 1、 病毒 ： 鸡新城疫病毒 La sota 株， 购自中国兽医药品监察所。 说 明 书 CN 1033。
38、86127 A 8 7/7 页 9 0059 2、 细胞系 ： DF-1 细胞系， 购自 ATCC。 0060 3、 试剂及培养基 ： DMEM/F12， 购自 GIBCO ； 血清， 购自武汉三利 （优级胎牛血清） ； 0.25% 胰酶 （GIBCO 27250） +0.02%EDTA ； 7.5% 碳酸氢钠 ； 200g/L 葡萄糖 ； 葡萄糖检测试剂 盒， 南京建成生物工程研究所 ； 4、 仪器设备 ： 紫外分光光度计， 上海精密科学仪器 721 型 ； 细胞载体， Amprotein 聚酯 纤维纸片 ； 生物反应器， Amprotein AP-20C。 0061 二 方法 1、 细胞培。
39、养 ： 转瓶培养细胞经酶消化后接种反应器。 每天监测培养液中葡萄糖含量， 计 算葡萄糖消耗。控制培养液中含糖量， 当残糖低于 1g/L 时， 全部换液一次。当细胞的葡萄 糖消耗量最大时， 视为细胞长至最大密度， 按不同比例接种新城疫细胞适应毒。培养条件 ： 37 ； DO 30% 60% ； pH 7.2 7.3。 0062 2 病毒繁殖 ： 种毒在灌注袋中的细胞上吸附 1h 后开始循环。培养 12h 开始取样， 每 2h 取一次样， 测定葡萄糖消耗和病毒滴度， 并及时补充培养基和葡萄糖。当糖耗为 0 时， 视细胞绝大多数已病变， 收获病毒， 冻融灌注袋内细胞 2 次 （裂解细胞） ， 测定病毒毒价。培 养条件 ： 37 ； DO 30% 50% ； pH 7.4 7.6。 0063 三 结果 当细胞生长至最大密度时按 4%、 3%， 2%、 1%、 0.5%、 0.1% 的不同比例接种新城疫细胞适 应毒， 同样培养条件下收毒， 检测结果表明， 当接种量在 0.5% 时， 收获的病毒液毒价最高且 稳定， 结果见下表。 说 明 书 CN 103386127 A 9 。