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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510190955.2 (22)申请日 2015.04.21 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104771752 A (43)申请公布日 2015.07.15 (73)专利权人 中国人民解放军第三军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30号 (72)发明人 徐文岳 朱锋 周桃莉 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (51)Int.Cl. A61K 39/015(2006.01) A61P 33。
2、/06(2006.01) 审查员 江涵 (54)发明名称 疟疾红内期灭活全虫疫苗的新用途 (57)摘要 本发明公开了一种疟疾红内期灭活全虫疫 苗的新用途， 具体为疟疾红内期灭活全虫疫苗作 为传播阻断型疫苗的应用。 本发明通过将疟原虫 红内期免疫血清应用到疟原虫的蚊期传播阶段， 发现用于红内期的全虫疫苗表现出一定的阻断 蚊期传播效果， 扩大了全虫疫苗的使用范围， 不 仅对免疫个体起到预防和治疗作用， 还能够大幅 降低疟疾在群体间的传播机会。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 104771752 B 2018.01.05 CN 104771752 B 1.疟疾红内期灭活全虫疫苗在制备预防。
3、疟疾的传播阻断型疫苗中的应用， 其特征在 于， 所述红内期灭活全虫疫苗为NSM虫株虫体抗原的PBS悬液与氢氧化铝佐剂按1:1的体积 比混合而成； 所述虫体抗原的PBS悬液中虫体抗原浓度为1108个/50 L； 所述PBS的pH值为 7.4， 浓度为0.1mol/L； 所述NSM虫体抗原为用疟原虫NSM虫株感染鼠后分别于第4天和第9天 收集的NSM原虫。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104771752 B 2 疟疾红内期灭活全虫疫苗的新用途 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗， 具体涉及一种预防和治疗疟疾的红内期灭活全虫疫苗的新 用途。 背景技术 0002 疟疾是由疟原虫属(P。
4、lasmodium)引起的严重危害人类健康的全球性虫媒传染性 疾病， 与结核病、 艾滋病并称三大传染病。 根据疟原虫的种类不同， 疟疾分为间日疟、 恶性 疟、 三日疟和卵形疟。 对抗恶性疟疾传统手段主要依靠抗疟药物预防与治疗， 并配合杀虫剂 和清除蚊虫孽生地等卫生措施清除传疟蚊媒。 但由于疟原虫对抗疟药物以及按蚊对杀虫剂 逐渐产生抗性， 疟疾疫苗的研制依然是全球当前研究关注的重点。 0003 目前疟疾疫苗主要分为三类， 红前期疟疾疫苗、 红内期疟疾疫苗和传播阻断型疫 苗 。 其 中 ， 红 前 期 疫 苗 主 要 针 对 恶 性 疟 原 虫 子 孢 子 阶 段 的 环 子 孢 子 蛋 白 (c。
5、ircumsporozoiteprotein， CSP)； 而红内期疫苗多数都是基于裂殖子表面抗原和/或涉及 入侵红细胞过程的抗原。 此类抗原免疫接种有望刺激免疫者产生抗体， 并在血液阶段阻断 疟原虫入侵新的红细胞和抑制其在红细胞内的裂体增殖， 从而降低临床发病的风险或严重 性； 与前两种疫苗不同， 传播阻断型疫苗并不能阻止受试者免于感染， 而是主要通过阻断疟 疾的传播、 防止患者将疾病带到非流行区或者旅行者从疫区将恶性疟疾带回本地区造成流 行。 该类疫苗以疟原虫配子体或蚊期阶段的特异分子为靶标， 阻断蚊虫体内疟原虫生长， 从 而阻断传播。 例如针对配子母细胞表面抗原Pfs230和Pfs48/。
6、45的疫苗， 其抗体可以阻止按 蚊中肠内动合子形成。 还有一类针对按蚊中肠抗原的传播阻断疫苗， 抑制病原体对蚊胃壁 的吸附， 限制动合子穿越蚊胃上皮细胞和子孢子进入唾液腺。 0004 然而通常情况下传播阻断型抗原的免疫原性较弱且活性维持时间较短， 部分免疫 佐剂也因安全隐患问题而限制了其应用。 虽然痘病毒载体系统和酵母表达系统改善了原核 表达传播阻断抗原的诸多不足， 但重组蛋白不能复性至其天然构象， 导致产生的抗体对病 原体亲和性偏低。 另外， 现有的疟疾传播阻断型疫苗也面临诱导抗体水平较低和免疫佐剂 引起的不良反应等问题。 更为重要的是， 由于传播阻断型疫苗并不能保护被免疫者， 因此不 易被。
7、人群所接受， 从而严重影响了其推广应用。 因此， 与单纯的 “利他型疫苗” 相比， 既能预 防免疫者感染又能阻断疟疾传播的疫苗或许可以作为疟疾疫苗发展的新方向。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供预防和治疗疟疾的红内期灭活全虫疫苗的一种新用途， 即 将其作为传播阻断型疫苗应用于疟疾的传播阻断。 0006 本发明采取的技术方案如下： 0007 1、 疟疾红内期灭活全虫疫苗作为传播阻断型疫苗的应用。 0008 灭活全虫疫苗是以疟原虫全部虫体成分为抗原， 辅以氢氧化铝等佐剂制备的红内 期疫苗， 包含了红内期原虫的全部成分(蛋白、 核酸以及多糖等)， 现有技术中动物实验表明 说 明 书 1/4 。
8、页 3 CN 104771752 B 3 灭活全虫疫苗能显著降低疟原虫再次感染时的原虫血症， 减轻宿主的症状， 缩短宿主患病 时间。 0009 进一步， 所述红内期灭活全虫疫苗是以疟原虫全部虫体成分作为抗原， 辅以佐剂 制备的红内期疫苗。 0010 进一步， 所述疟原虫为间日疟原虫、 恶性疟原虫、 三日疟原虫、 卵形疟原虫、 约氏疟 原虫、 伯氏疟原虫、 夏氏疟原虫或文氏疟原虫。 0011 进一步， 所述红内期灭活全虫疫苗为NSM虫株虫体抗原的PBS悬液与氢氧化铝佐剂 按1:1的体积比混合而成； 所述虫体抗原的PBS悬液中虫体抗原浓度为1108个/50 L； 所述 PBS的pH值为7.4， 浓。
9、度为0.1mol/L。 0012 进一步， 所述NSM虫体抗原为用疟原虫NSM虫株感染鼠后分别于第4天和第9天收集 的NSM原虫。 0013 常用的全虫疫苗抗原获取仅在单个时间点收集虫体抗原(比如感染后第4天)， 然 而由于疟原虫具有很强的逃避宿主免疫的能力， 比如var基因不同的修饰和编码顺序使得 疟原虫不断产生新的抗原逃避宿主体内抗体的识别和杀伤。 为此， 本发明选择在多个时间 点进行虫体抗原收集， 以便获取更丰富的抗原类型。 需要说明的是， 收集原虫的时间不限于 虫株感染后第4和第9天， 还可有其它的时间点设置。 0014 2、 疟疾红内期灭活全虫疫苗在制备预防或治疗疟疾的传播阻断型药物。
10、中的应用。 0015 本发明的有益效果在于： 本发明通过将疟原虫免疫血清应用到疟原虫的蚊期传播 阶段， 发现用于红内期的全虫疫苗表现出一定的传播阻断效果， 扩大了全虫疫苗的使用范 围， 不仅对个体起到预防和治疗， 还能够防止疟疾在个体间相互传播。 0016 红前期遗传减毒子孢子疫苗(Genetic attenuated sporozoite， GAS)作为一种多 效性疟疾疫苗既可以保护免疫者抵御子孢子感染， 又能保护免疫者免于低剂量的红内期疟 原虫感染， 具有良好应用前景和潜在的市场价值。 然而， 受蚊媒饲养和感染平台以及子孢子 来源、 纯化及运输等问题制约， 减毒子孢子疫苗在实际推广应用中受。
11、到明显限制。 0017 相对而言， 红内期疟原虫可以通过体外培养获得， 更具有可操作性。 本发明研究发 现， 红内期全虫疫苗免疫小鼠的血清可以抑制疟原虫在按蚊体内的发育： 通过尾静脉将免 疫血清过继至感染疟原虫的小鼠体内， 按蚊叮吸上述处理小鼠后， 其卵囊数量较对照组减 少45.695.9(表1)； 通过纯化免疫血清中特异性IgG抗体和在小鼠体内添加抗CD4+T细 胞抗体拮抗CD4+T细胞功能实验证实， 特异性抗体成分是红内期全虫疫苗发挥蚊期传播阻 断效果的主要因素。 附图说明 0018 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图： 0019 图1全虫免疫血清在红内。
12、期的保护效果图。 具体实施方式 0020 下面以约氏疟原虫NSM虫株为例， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。 实施例 中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 0021 实施例1灭活全虫疫苗制备 说 明 书 2/4 页 4 CN 104771752 B 4 0022 首先复苏液氮中保存的疟原虫NSM虫株， 然后将复苏的NSM感染8-10只Balb/c小 鼠， 并分别在感染后第4天和第9天收集NSM原虫作为虫体抗原。 虫体抗原获取过程主要流程 为： 通过心脏取血获取小鼠血液成分， 并加入含有肝素的离心管中避免发生凝血； 上述血细 胞经pH值为7.4， 浓度为。
13、0.1mol/L的PBS清洗3次除去肝素后， 添加终浓度为0.5的皂素以 裂解红细胞释放出胞内虫体抗原； 上述组分经PBS清洗3次除去血红素后， 通过反复冻融方 式使原虫细胞裂解， 以获取可供实验用抗原； 将按上述操作获得的第4天和第9天抗原分别 以PBS重悬至最终浓度为5107个/25 L； 上述两种抗原各取25 L混合成为含1108个/50 L 的悬液， 此悬液即为最终抗原。 0023 取50 L上述最终抗原与50 L氢氧化铝佐剂混合， 注射器反复抽吸使其充分混匀形 成100 L乳液， 此即为1只Babl/c小鼠的免疫用量。 采用皮下多点注射的方式(50 L/次)免疫 Balb/c小鼠， 。
14、并于2周和4周后分别做第2次和第3次免疫， 最后收集免疫血清-80保存， 供 后续使用。 0024 实施例2全虫免疫血清对红内期保护效果 0025 复苏液氮中保存的疟原虫虫株NSM， 按1106个原虫/只的用量感染3只实施例1中 3次免疫后的Balb/c小鼠， 并以3只正常Babl/c小鼠作对照； 间隔24h取尾尖血制作血涂片统 计原虫血症。 实验结果见图1， 其中M1-M3为对照小鼠， M4-M6为全虫免疫小鼠。 由图1可知， 全 虫免疫Balb/c小鼠获得对大剂量红内期疟原虫感染的良好保护效果： 受免疫小鼠最大原虫 率降低75以上， 原虫清除时间缩短至7天， 这是由于全虫疫苗包含了疟原虫红。
15、内期的所有 抗原， 故能诱导宿主的免疫系统产生更强的免疫反应。 0026 实施例3灭活全虫疫苗阻断蚊期传播 0027 首先用疟原虫感染按蚊： 复苏液氮中保存的疟原虫虫株NSM， 按1106个/只的计 量感染6只Balb/c小鼠， 4天后血涂片评价疟原虫配子体情况， 从中选取配子体情况相当的 小鼠供后续实验应用。 0028 通过过继全虫免疫血清的方式观察灭活全虫疫苗免疫血清在蚊期传播阻断中的 作用； 通过Protein-a蛋白亲和层析凝胶分离得到全虫免疫血清中的特异性IgG抗体， 通过 IgG过继方式观察特异性抗体在蚊期传播阻断中的作用(表1)； 通过往小鼠体内注射抗CD4+ T细胞抗体以拮抗抑。
16、制CD4+T细胞产生以干扰素(IFN-)为主的炎症因子的方式， 观察细胞 因子在蚊期传播阻断中的作用(表2)。 0029 取实施例1中的全虫免疫血清、 IgG抗体、 对照血清(正常血清)分别按200 L/只的 计量尾静脉注射至配子体情况相当的小鼠中， 然后将小鼠固定以供按蚊 “血餐” 。“血餐” 30min后的按蚊在23饲养7天后， 解剖蚊胃并统计卵囊数量， 实验结果见表1-2。 0030 表1.全虫免疫血清及其IgG成分对蚊期疟原虫发育抑制率 说 明 书 3/4 页 5 CN 104771752 B 5 0031 0032 注： a.在按蚊吸血量一定的前提下， 过继免疫成分对疟原虫感染抑制率。
17、受疟原虫 感染基数影响。 在自然条件下， 恶性疟原虫在按蚊体内的感染量通常为十几到几十个卵囊。 因此我们预期， 全虫免疫疫苗对恶性疟的传播阻断抑制率将达到90以上。 0033 表2.全虫免疫疫苗中CD4+T细胞对蚊期疟原虫发育的影响 0034 0035 CD4+T细胞主要介导免疫反应中INF-等炎症因子的产生， 抗体拮抗使CD4+T细胞 功能失活并没有改变全虫免疫血清的蚊传阻断效果。 结合表1中结果说明， 特异性IgG是全 虫疫苗发挥传播阻断效果的主要因素。 0036 实验表明， 全虫免疫血清可以有效的抑制疟原虫在蚊期内的发育： 卵囊数量较对 照组减少45.695.9(表1)； 通过纯化免疫血。
18、清中特异性IgG抗体和在小鼠体内添加抗 CD4+T细胞抗体拮抗CD4+T细胞功能实验证实， 特异性抗体成分是红内期全虫疫苗发挥蚊期 传播阻断效果的主要因素， 全虫免疫血清可以抑制45.695.9的蚊期疟原虫发育(取决 于蚊媒感染情况)。 同时特异性抗体IgG是抑制疟原虫蚊期发育的主要成分。 根据疫区环境 中蚊媒自然感染疟原虫呈现感染程度偏低的特点(通常为050卵囊/按蚊)， 我们预期此传 播阻断疫苗具有90或以上的阻断蚊期传播效果。 0037 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104771752 B 6 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 104771752 B 7 。