本分案申请是基于申请号为201080051551.0，申请日为2010年9月16日，发明名称为“植物提取物，含所述提取物的组合物，其提取方法及其用途”的原始中国专利申请的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及植物提取物，含有所述提取物的组合物，所述提取物的提取方法及其用途。
【背景技术】
桑树叶在亚洲国家，尤其是中国具有长的医药使用历史。近年来，植物化学家从桑树叶分离了许多亚氨基糖成分，诸如1-脱氧野尻霉素(DNJ)，fagomine及N-甲基-DNJ。亚氨基糖的化学结构类似于单糖的化学结构，通常是具有5～6-元环的聚羟基杂环化合物。2者之间的关键差异位于杂环的杂原子。前者含有氮原子(N)，而后者含有氧(O)。
已显示，自桑树叶的亚氨基糖成分呈现对α-葡萄糖苷酶I和II的特定抑制性活性，它们之中DNJ显示最强活性。进一步药理学实验揭示，DNJ作用于抑制导致黑色素产生的减少的TYR的成熟过程的黑色素细胞。(Genji Imokawa,Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition.The Journal of Investigative dermatology,1990,95(1):39-49；Ju Young Park,hyunjung Choi,Jae Sung hwang,Junoh Kim,Ih-Seop Chang,Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells,Journal of Cosmetic Science,2008,59:139-150)。
本发明的发明人进行一组酶实验，并发现，在本发明的提取物描述的自桑树叶的总亚氨基糖提取物(如通过1脱氧野尻霉素(DNJ)，N-甲基-DNJ及fagomine的含量测量)对α-葡萄糖苷酶I和II相比纯 化学DNJ具有更有力的抑制性活性。此发现使得使用该桑树提取物达到用更低浓度的DNJ抑制α-葡萄糖苷酶I和II成为可能，由此减少可能的不利的药物反应(ADR)的可能性，并使得结束的产物使用起来更安全。此外，如在本发明中描述，由于产生桑树提取物的成本比获得纯化学DNJ的少得多，治疗过度色素沉着相关的疾病的成本可大大减少。
由此，自该提取物制造的化妆品和药物相比含有纯化学品诸如DNJ的那些，在功效，安全性及花费上具有巨大的优势，其结构如下：
1-脱氧野尻霉素(DNJ)的结构
在过去，曾有许多试着将用于增白及斑点-减小的桑树提取物在美容产品市场商业化的中国或国外的研究者。但是，通过比较，本提取物具有相当地不同的特征，并提供许多优势。
中国专利ZL99123894X公开了用于治疗皮肤色素沉着的植物提取物的组合物，其由3种主要成分的组合组成，即自桑属(Morus)植物的提取物，自黄芩属(Scutellaria)植物的提取物和水杨酸的衍生物。该发明的桑属(Morus)提取物从桑树根得到，其主要含有桑酮，且无提取物的清楚的说明。
US专利申请No.347884公开了用于相同的化妆目的自桑树枝的提取物的用途，提取物中的活性成分是氧基白藜芦醇和桑皮苷。相比这2个发明，本发明具有下列优势和特征：
1.原材料优势。在本发明中使用的原材料，桑树叶更容易再生，及相比根和枝提供更可持续的资源。其也相比上述2个发明提供相对更低成本。
2.不同作用机理。在上述2发明中，通过对TYR的竞争性抑制实现活性。在本发明中，作用机理是通过抑制α-葡萄糖苷酶，导致欠成熟(及少/无活性)TYR来减少黑色素产生。
3.不同有效成分。在以上提及的专利中，有效成分是类黄酮，例如桑酮或二苯基类乙烯，例如氧基白藜芦醇和桑皮苷。相反，本发明的有效成分是亚氨基糖，及采用不同制备方法来分离富含这些亚氨基糖的提取物。
4.独特制备方法。方法设计为确保活性成分的最佳提取和纯化以改善例如提取物的物理性质，使得其更适合用于，例如，化妆品产品。
黑色素是决定人皮肤颜色的最重要因子。其在位于表皮基层的黑色素细胞的黑色素体中生物合成。在正常生理条件下，黑色素保护皮肤免于UV轻损伤。当黑色素合成代谢被外部因素，激素病症，老年过程，等扰乱时，在表皮基层的黑色素会增加和皮肤颜色会变黑。此进而会导致色素沉着疾病或病症，诸如雀斑，黄褐斑，妊娠纹，老年斑和黑色素瘤。此外，有大数的渴望更白皮肤的爱美的人，由此有对皮肤光泽，增白及斑点减少剂和化妆品的需求。
简言之，黑色素的生物合成包括下列步骤：
酪氨酸酶(TYR)，一类含有离子铜的糖蛋白，且是黑色素的生物合成的关键酶。其催化将酪氨酸转化为多巴和多巴醌的反应。TYR被认为是减少色素沉着的重要靶，且常在有增白皮肤及减少斑点的功能的产品的研究领域中使用。
目前，靶向TYR的主要方式是抑制其形成和减少黑色素产生的活性。含有TYR抑制物的当前产品包括1,4-二羟基苯(氢醌)和其衍生物，曲酸和其衍生物，及熊果苷。
而1,4-二羟基苯和其衍生物能抑制TYR的100％活性，它们也刺激黑色素细胞及显示细胞毒性。与暴露于光偶联的延长的使用可造成外源色素斑点。它们因此在护肤产品中被禁止。
曲酸非常稳定，且在通过螯合铜离子而降低TYR的活性来减少色素斑点中具有良好效应。但是，曲酸的长期使用可造成导致皮肤疾病的细胞毒性。日本研究者展示，曲酸可导致肝癌(Tamotsu Takizawa,Toshio Imai,Jun-ichi Onose,Makoto Ueda,Toru Tamura,Kunitoshi Mitsumori,Keisuke Izumi and Masao Hirose.Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine.Toxicological Sciences 200481(1):43-49)。
熊果苷被认为是具有非常少副作用的增白及斑点-减少美容产品，但其高度光-敏感，结果，需要将大量的日光保护剂加入最终产品，其增加皮肤负担，由此加速其老年过程。
以上缺点局限了现有产品在增白皮肤及减少斑点的美容产品的市场中的应用。
TYR是有糖链的蛋白(糖蛋白)。现代生物化学中的研究揭示，在其产生过程(及成熟)中，原糖链必需经历一系列修饰，以便将新产生的TYR转化为具有正常生物学功能的成熟TYR。α-葡萄糖苷酶I和II是此过程中的关键酶。α-葡萄糖苷酶I主要负责在糖链远端“切割”具有α-1,2连接的葡萄糖部分，而α-葡萄糖苷酶II会，在2步骤中，切割余下2个通过α-1,3连接连接的葡萄糖部分。(Mehta A,Zitzmann N,Rudd PM,Block TM,Dwek RA.α-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents，FEBS Letters,1998,430(1):17-22)。
相信当抑制α-葡萄糖苷酶I和II时，糖蛋白的糖链的修饰被延缓导致无成熟TYR产生。随着“未成熟的TYR”，黑色素产生因而按比例减少。(Hiroyuki Takahashi,Peter G.Parsons,Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells,The Journal of Investigative dermatology,1992,98(4):481-487.)。
因此，其会是通过抑制α-葡萄糖苷酶I和II而最小化成熟TYR 的形成来减少黑色素产生和进而皮肤色素沉着的高度可行的方法，如在图4中例证，其显示抑制黑色素合成的建议的作用机理。通过导致无活性酪氨酸酶形成的桑属(Morus)提取物抑制被α-葡萄糖苷酶催化的酪氨酸酶的必要的修饰。
【发明概述】
根据本发明，提供了植物提取物，其获自桑属(Morus)植物叶，其具有以小于90μg/ml的浓度抑制α-葡萄糖苷酶I的IC50值。
优选植物具有以小于70μg/ml和更优选5～60μg/ml和再更优选5～40μg/ml的浓度抑制α-葡萄糖苷酶I的IC50值。
IC50可如实验1中所述测定。
提取物活性超过纯分离的DNJ的改善被认为是由于提取物中存在的其他亚氨基糖的活性。如通过定量HPLC和/或LC-MS(液相层析/质量光谱法)测量，优选提取物包含5～40％(w/w)总亚氨基糖。测量的亚氨基糖包括1脱氧野尻霉素(DNJ)，N-甲基-DNJ及fagomine。
更优选提取物会包含8～30％(w/w)总亚氨基糖，再更优选15～20％(w/w)总亚氨基糖。
通过精确地控制特征化学成分的含量，有效控制产品质量成为可能，由此提供对产品的化妆或治疗效果的特定保证。
最优选提取物会还包含亚氨基糖1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇(DAB)，2-O-α-D-半乳吡喃糖基-DNJ(GAL-DNJ)和打碗花精B(calystegin B)。
DAB(其为糖原磷酸化酶抑制物)的存在，可对构成本发明的再一方面的应用的控制糖代谢中的提取物使用来说重要。
除了亚氨基糖之外，提取物优选包含20～70％(w/w)总氨基酸。
更优选，提取物含有30～60％(w/w)总氨基酸，再更优选40～50％(w/w)总氨基酸。
存在于提取物中的氨基酸包括人身体不能产生的8种必要的氨基 酸并包括精氨酸，亮氨酸，赖氨酸和苯丙氨酸，其促进胰岛素分泌。如熟知，氨基酸对维持皮肤的湿度和弹性而言必要。氨基酸缺乏会减弱皮肤代谢及加速皮肤老年过程。(Marty J.P.,NMF and cosmetology of cutaneous hydration.Annales de Dermatologie et de Vénéréologie,2002,129(1Pt 2):131-136.)。本发明的提取物由此也会发挥辅助维持皮肤健康的功能。
本发明的提取物从桑科(Moraceae)，桑属(Morus)的桑树叶得到，所述桑属(Morus)选自：
(a)桑(Morus alba L.)、
(b)鲁桑(Morus alba var.multicaulis L.)、
(c)黑桑(Morus nigra)、及
(d)鸡桑(Morus australis Poir.)。
本发明的发明人进行了常见的桑属(Morus)植物的叶的化学成分的化学分析，并发现，以上-提及的全部物种的叶相比其他物种含有相对更高亚氨基糖含量，且桑(M.alba)叶具有最高亚氨基糖含量。
更优选，将亚氨基糖含量根据DNJ标准化，其存在量为：基于提取物总重量计算1～20％(w/w)的(DNJ)，更优选基于提取物总重量计算2～10％(w/w)的(DNJ)，且依赖于旨在的用途，基于提取物总重量计算4～6％(w/w)的(DNJ)或基于提取物总重量计算1～3％(w/w)的(DNJ)。DNJ也是存在的主要(最高产生)亚氨基糖。
本发明的提取物在许多方面与当前桑树提取物不同，包括：
◆其颜色-其是浅黄色，
◆其溶解度-其易溶于水，
◆其pH-其在1％水溶液中具有5.5～6.5之间的pH值，以及
◆其UV光谱-其在218nm和263nm处显示最大吸收。
提取物可使用构成本发明的再一方面的方法包含3个基本步骤的新提取和纯化方法产生。
根据本发明的第2方面，提供从桑属(Morus)植物叶生产提取 物的方法，所述提取物具有以小于90μg/ml的浓度抑制α-葡萄糖苷酶I的IC50值，所述方法包括下列步骤：
(a)进行从叶材料用水或醇的提取步骤；
(b)进行使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析纯化步骤，用水洗涤，及用氨溶液洗脱，收集洗脱液，并从中去除氨；
(c)使用大孔吸附树脂使洗脱液经历柱层析，收集溶液；以及
(d)浓缩并干燥提取物。
优选植物叶经烘干，并制造成粗粉，且
(a)用5～18倍的0～40％低分子量醇/桑属(Morus)植物叶(w/w)量进行提取步骤，并重复达5次，
(b)用柱体积的1～2倍的水洗涤柱并去除洗涤液，以柱体积的1～3倍/小时的洗脱速度，用柱体积的2～8倍的0.2～1.0N氨水溶液洗脱柱，并收集9.0和11.0之间的pH值的洗脱液，
(c)用20:1～5:1之间的溶液和柱之间的体积比洗脱柱，以及
(d)将干燥的提取物粉碎而经过80目筛。
获得本发明的提取物的提取处理的更全细节如下：
提取(步骤1)：植物叶经烘干并制造成粗粉。用原材料的5～18倍的量(w/w)的0～40％低分子量醇提取1～5次，优选用原材料的10～13倍的量(w/w)的20～30％低分子量醇和更优选用原材料的11倍的量(w/w)的25％低分子量醇提取粉，而获得液体提取物。
纯化1(步骤2)：使用阳离子交换树脂的柱层析：在步骤(1)中获得的液体提取物的过滤之后，使溶液通过填充强酸性阳离子树脂的柱。用柱体积的1～2倍，优选1.5倍的水洗脱柱，及去除洗脱液。还用柱体积的1～3倍/小时，优选1.5倍/小时的洗脱速度，用柱体积的2～8倍的0.2～1.0N氨水溶液，优选5倍的0.7N氨水溶液洗脱柱。收集具有9.0和11.0之间的pH值的洗脱液。
纯化(步骤3)：使用大孔吸附树脂的柱层析：从步骤(2)中的洗脱液去除氨，并调整到pH7。使得溶液通过填充大孔吸附树脂的柱。溶液和柱之间的体积比应是20:1～5:1，优选15:1～10:1和更优选 13:1。浓缩经过柱而收集的流体，并干燥浓缩物，然后粉碎而经过80目筛而获得本发明的提取物。
基于步骤(1)的上述提取方法，所述低分子量醇应是具有不多于4个碳原子的直链烷基醇，优选，甲醇或乙醇。回流提取所述提取1～3小时，优选1～2小时和更优选2小时。
在步骤(1)中获得的液体提取物的过滤之后，还可适应量度而去除更多杂质，改善提取物的生物活性及将提取物脱色。那些量度包括醇沉淀，絮凝沉淀和对于蛋白，单宁和多糖去除适当的其他量度。沉淀物可通过离心或过滤去除。本文中优选的纯化方法是醇沉淀及离心：将输注物浓缩到原体积的1/4，添加1～3倍的95％乙醇，搅拌半小时，并使得其静置8～12小时，以12000r/min离心15min。保持上清液用于进一步纯化。
基于本文所述的提取方法，步骤(2)的液体提取物的总体积应是阳离子交换树脂柱的2～20倍，优选10～15倍和更优选13倍。
在这些条件下，活性成分可通过辅助增加活性化学品的含量的阳离子交换树脂有效吸附。
本文所用的强酸性阳离子树脂可选自下列类型：001X7(#732)，Amberlite IR-120，Dowex-50，Lewatit-100，Zrolit 225或Diaion SK-1，等，其中001X7(732)由于其浓缩活性的成分更佳吸收性质和更低成本而最优选。
在使用氨水的阳离子交换树脂柱的洗脱期间，洗脱液的pH值逐渐增加。洗脱液的生物学和化学分析揭示，pH9～11的级分的内容物显示最高活性，因此仅收集pH9～11的那些级分。
基于本文所述的提取方法，步骤(3)中的流速应是柱体积的1～4倍，优选2倍/小时。此确保被确保良好脱色的大孔树脂的着色的杂质的最大吸收。
4种类型的大孔树脂可选择用于上述柱层析：AB-8，HP20，S-8和YWD03F4。处理比较和有效性之后，发现树脂S-8产生最佳脱色结果，由此，S-8型树脂是优选的大孔树脂材料。
根据以上方法获得的桑树叶提取物在UV扫描下在218.3nm处具有最大吸收峰及颜色是浅黄色，其可与目前市场上可利用的其他桑树叶提取物区分。市场上的美容产品中使用的多数桑树叶提取物具有更深色彩，即黄色或褐黄色，导致着色的最终产品，其不认为是理想外观。
本发明中描述的提取物易溶于水，且此提供活性成分的更佳扩散和在靶向的区上的吸收。美白产品中目前使用的桑树提取物含有类黄酮(例如桑酮)和二苯基类乙烯(例如氧基白藜芦醇和桑皮苷)，且作为结果它们具有平均扩散率的相对差水溶解度，其在实践中需要使用低分子量醇来改善溶解度，由此增加皮肤的负担。
本发明中描述的提取物在1％水溶液中具有5.5～6.5的pH值。此稍微酸性pH接近4.5～6.6的皮肤表面上的皮脂膜的pH。当所述提取物制造成护肤产品时，由活性成分导致的皮肤刺激因此减少。
本发明的提取物可配制用作皮肤光泽剂，或用作减少皮肤过度色素沉着的药物或化妆品，或作为控制血糖水平的药物，营养物或食品或饮料成分。由此，其可用于，例如，治疗2型糖尿病或用于降低食品或饮料的血糖指标。
根据本发明的第3方面提供本发明的第1方面的植物提取物或根据本发明的第2方面的方法的产物，其用作化妆品或药物以治疗由色素沉着导致的病情。
优选化妆或治疗性应用是减少黑色素产生，包括治疗由过度色素沉着导致的疾病或病症，所述疾病或病症包括：雀斑，黄褐斑，妊娠纹，老年斑和黑色素瘤。
使用本发明的桑树叶提取物的药理学实验揭示，所述提取物相比纯DNJ的定量相当样品以更高效力有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性。其需要仅DNJ的一半浓度的提取物就达到与纯DNJ相同的效应。当在细胞系中测试时，所述提取物在黑色素瘤细胞系A375和B16中显示针对黑色素形成的显著抑制效应，且效力相比销售的美白产品中常使用的成分，诸如熊果苷和L-抗坏血酸基-2-磷酸镁更高。本发明的桑 树叶提取物的作用机理不同于熊果苷和L-抗坏血酸基-2-磷酸镁。后来的2种直接和竞争性地抑制TYR的活性，而所述桑树叶提取物主要抑制成熟，活性TYR的形成。所述桑树叶提取物的优势包括更高效力和更长作用。因为不同作用机理，所述本发明的提取物可单独使用或与以上提及的TYR抑制物一起使用。人临床研究确认了此体外数据，及0.2％或0.5％桑树叶提取霜制剂的28天的局部应用之后有显著减小皮肤色素沉着(P<0.001)并显著光泽皮肤(P<0.001)。
根据本发明的第4方面提供本发明的第1方面的植物提取物或根据本发明的第2方面的方法的产物，其用于控制血糖水平。
用于控制血糖的提取物优选还包含糖原磷酸化酶抑制物。
在动物实验中使用威斯塔大鼠模型，及人临床研究，本发明的桑树叶提取物展示显著血糖降低效应。
由于受益于活性的组合，本发明的提取物特别良好。由此，亚氨基糖成分，诸如DNJ，抑制肠中的α-葡萄糖苷酶，导致糖的吸收的减小(Asano N.,Glycosidase inhibitors:update and perspectives on practical use.Glycobiology,2003,13(10):93R-104R.)。另一亚氨基糖1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇(D-AB1)，发现具有针对肝糖原磷酸化酶的强抑制性活性，也抑制肝糖原的体内分解。结果，其抗-高血糖。此外，氨基酸诸如精氨酸，亮氨酸，赖氨酸和苯丙氨酸的存在，具有促进胰岛素分泌的功能。
由此，可使用本发明中描述的提取物来控制膳食后血糖水平及调整血糖平衡。
该提取物可配制而用作用于控制血糖的药物或健康产品(诸如食品添加剂或补充物)。
为了提供第3方面，提取物可制成包含赋形剂和任选地一种或更多替代性的活性物的化妆品或药物。
为了用作皮肤光泽剂，其他活性剂可选自，例如，维生素C和其衍生物，诸如维生素-磷脂酸镁，曲酸，熊果苷，二乙酰波尔定碱，壬二酸，十八碳烯二酸，十一碳烯酰苯丙氨酸(DEP-11)，甘草提取物， 芦荟属(Aloe)提取物，水田芥(Nasturtium officinale)提取物，叶藻属(Ascophyllum)提取物(泡叶藻(Ascophyllum nodosum))，啤酒花(Humulus lupulus)提取物，谷胱甘肽，蜕皮素和/或鞣花酸。
优选的化妆品或药物包含：本发明的提取物和维生素C衍生物，L-抗坏血酸基-2-磷酸镁(VC-PMG)。
优选地，在组合产品中，提取物是以提取物与其他皮肤光泽剂10:1～1:1，更优选5:1的比存在。
当使用本发明的桑树叶提取物或也含有其他成分的组合物生产用于皮肤疾病的化妆品或药物时，可使用药剂学中可接受的全部常见的基质，其包括水溶性基质，诸如甘油，聚乙二醇，纤维素衍生物，等，和脂溶性基质，诸如脂肪，脂质，烃，等。下列赋形剂也是通常使用的，及包括防腐剂，诸如尼泊金，三氯叔丁醇和山梨酸；抗氧化剂，诸如亚硫酸钠，亚硫酸氢钠，BHT，等；增稠剂，诸如硬脂酸，蜂蜡，石蜡，月桂基醇，羧甲基纤维素(CMC)，等；乳化剂诸如三乙醇胺，单硬脂酸甘油酯，Tweens，等；防晒剂，诸如甲氧基肉桂酸辛酯，二苯甲酮-3，等；保湿剂，诸如甘油，丙二醇，山梨糖醇，等；除臭剂，芳香和着色剂，等。本领域技术人员已知以上提及的赋形剂的量。
当所述提取物用于用于减少黑色素产生的化妆品时，最终产品中的建议的量应是0.05～2％，优选0.1～1％和更优选0.2～0.5％(wt/wt)。
为了提供第4方面，提取物可配制进药物或营养物，添加到食品或饮料或提供作为用于以有效量添加到其中的补充物。
在食品或饮料中，其发挥降低血糖指标的功能。在该情况中，可使用50～600mg/次(依赖于大小)的剂量。
当生产用于控制血糖水平的口服药物时本发明的桑树叶提取物可使用用于口服药物的常见的赋形剂配制，诸如，解离剂(例如干淀粉,羧甲基淀粉钠,L-HPC,交联的-PVP,等)；润滑剂(例如硬脂酸镁,滑石粉,苯甲酸钠,聚乙二醇4000,等)和粘合剂(例如CMC)。
当所述提取物用于控制血糖水平时，基于提取物中活性成分的浓 度，建议的剂量是25～600mg每次，3次每天；优选100～300mg每次，3次每天；更优选50～150mg每次，3次每天。
常规上，可制造下列形式的产品作为用于皮肤疾病的化妆品或药物。这些形式包括含有水，水-醇或油的溶液，含有水或油的凝胶/胶体，微-乳剂，稀释剂或浓乳剂，松弛或密粉剂，在微粒子诸如聚合物粒子的辅助下形成的水相中与油的分散剂，和胶囊，及最好是全部，离子或非-离子脂质囊。
当使用桑树叶提取物或组合物生产用于皮肤疾病的化妆品或药物时，它们可呈现具有相对流动性的下列“剂型”：霜剂，软膏，洗液，乳状液体，乳剂流体，胶浆，糊剂，泡沫，气雾剂和无水固体制剂(例如杆-形)。
当使用本发明的桑树叶提取物生产控制血糖水平的口服药物时，它们可制造成通常使用的口服剂型，诸如片剂，胶囊和粉剂。
【附图说明】
本发明的实施方式还在下文参照附图描述，其中：
图1是实施例1的植物提取物的HPLC指纹。上图是DNJ的标准HPLC，下图是实施例1的植物提取物的HPLC指纹；
图2是实施例1的植物提取物的UV光谱；
图3是现有技术提取物的UV光谱；
图4是例证色素沉着减小背后的作用机理的示意图；
图5a和b显示由桑属(Morus)提取物(5a)和DNJ(5b)的α-葡萄糖苷酶抑制水平；
图6是DNJ，熊果苷和桑属(Morus)提取物对酪氨酸酶的比较效应；
图7是DNJ，VC-PMG和桑属(Morus)提取物对黑色素合成抑制的比较效应；
图8a，b和c显示DNJ(a)，VC-PMG(b)及桑属(Morus)提取物(c)的比较细胞毒性；
图9是在威斯塔大鼠中桑属(Morus)提取物的葡萄糖降低效应；
图10是在人中桑属(Morus)提取物的葡萄糖降低效应；以及
图11a和b是在人中桑属(Morus)提取物的皮肤光泽效应。
【发明详述】
使用下列设置获得图1的HPLC：
●仪器：Waters(USA)HPLC设备w600-2420-717，Empower数据处理系统。
●柱：旧Shodex Asahipak NH2P-50E(250×4.65μm)柱，反向使用。
●试剂：含有6.5nmol乙酸铵的乙腈-水。
●柱：温度40℃
●流速：1.0ml/min
●检测器：W2420 ELSD
●增益：100；漂移管温度50℃；喷雾器加热水平60％
●移动相：乙腈:水(含有6.5nmol乙酸铵)(84:16)
使用下列设置获得图2和图3的UV光谱：
●仪器：UNICO UV-2100分光光度计
●扫描波长：200-600nm
●样品浓度：1mg/ml
本发明的植物提取物可通过参照实施例1～5描述的方法，及使用参照实施例6～9例证的不同桑树叶来获得。
得到的植物提取物可配制如参照实施例10～16例证的用作化妆品或药物或作为食品或饮料补充物或添加剂。
提取物的不同活性还通过实验1～8的方式例证。
【实施例】
【实施例1】
粉碎100kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用 12倍的30％乙醇(相比原材料重量)提取3次(1小时每次)。将提取物浓缩到给定体积，并使其通过填充强酸性阳离子树脂，诸如001X7的柱。柱的体积是提取的液体的1/14。用水(1.5倍的柱体积)洗涤柱，以1.5倍的柱体积/小时的流速使用0.7N氨水(5倍的柱体积)将目的组分(亚氨基糖)从柱释放。收集9～11的pH的氨水洗脱液。洗脱液浓缩到给定体积，去除铵及pH调整到pH7。洗脱液然后经过填充大孔树脂，诸如S-8的柱。柱的体积是洗脱液液体的1/10和流速是2倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得1.4kg的浅黄色粉，其含有5.8％DNJ，21％总亚氨基糖和48％总氨基酸。
使用下述检定测定亚氨基糖含量及结果显示于图1，其下图显示主要亚氨基峰的HPLC层析谱(上图中显示DNJ标准物)。
(a)精确地称重适当的量的DNJ作为对照，添加甲醇以制备0.1mg/ml的溶液及振摇孔。将精确地测量的1ml的溶液转移到25ml体积测定瓶，向其中添加1ml的0.4mol/L硼酸-氯化钾缓冲溶液(pH8.5)和2ml的无水乙腈中的5mmol/L FMOC-CI。于室温超声处理20min之后，立即向体积添加2ml的0.2mol/L甘氨酸溶液和0.1％乙酸，振摇良好以获得对照样品溶液。
(b)将0.3g的提取物溶解到适当的量的水及经过预处理的聚酰胺柱。用盐酸溶液(pH3)洗脱。收集洗脱液，然后将其在真空下浓缩到约10ml。将溶液放入预处理的阴离子交换树脂柱。用水洗涤柱并收集洗脱液。在真空下浓缩到约30ml之后，将洗脱液转移到50ml体积测定瓶和将水添加到体积。将精确地测量的1ml的溶液转移到25ml体积测定瓶，并根据以上(a)中开始于“向其中添加1ml…”的过程，以获得测试溶液。
(c)使溶液如下通过HPLC，并由其测定亚氨基含量(由Empower)。吸收剂：C18-ODS；移动期：乙腈：0.1％乙酸(30:70)，通过30min，将移动相改变为乙腈：0.1％乙酸(70:30)通过10min。在注射下一样品之前使用原移动相平衡系统。层析谱记录时间是 30min，检测波长在265nm处。分别将20μl，精确地测量的对照溶液和测试溶液注射到HPLC设备，并使通过而获得HPLC结果。
使用标准氨基酸分析仪器检定总氨基酸含量。
【实施例2】
粉碎100kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用18倍的水(相对原材料重量)提取3次(1小时每次)。使提取物经过填充强酸性阳离子树脂，诸如Dowex-50的柱。柱的体积是提取物的1/20。以3倍的柱体积/小时的流速用水(2倍的柱体积)之后是0.5N铵水(8倍的柱体积)洗涤柱。收集具有9～11的pH的铵水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵及调整到pH7。使洗脱液通过填充大孔树脂，诸如，HP20的柱。柱的体积是洗脱液的1/20，流速是4倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得1.4kg的浅黄色粉，其含有4.3％DNJ，19％总亚氨基糖和40％总氨基酸。
UV光谱示于图2。2个不同峰将所述提取物与含有更高比例的杂质的其他桑属(Morus)提取物(见图3)区别开。这些杂质导致峰之间无区别，且可导致降低水平的功效。
【实施例3】
粉碎20kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用相对原材料重量5倍的40％乙醇提取3次。过滤组合的提取物，向其中添加等同体积的乙醇，以恒定速度搅拌半小时并静置过夜。通过以12000r/min离心15min来去除沉淀，回收乙醇到给定体积。使上清液经过填充强酸性阳离子树脂，例如001X7型的柱。柱的体积是液体的1/3。用水洗涤柱(与柱体积相同的量)，并用柱体积/小时的流速用1.0N氨水(2倍的柱体积)洗脱。收集pH9～11的氨水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵及调整到pH7。使洗脱液经过填充大孔树脂，诸如S-8的柱。柱的体积是洗脱液的1/13，流速是，柱体积/小时。然后 将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得0.11kg的近白色粉末，其含有9.1％DNJ，29％总亚氨基糖和32％总氨基酸。
【实施例4】
粉碎50kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用相对原材料重量12倍的40％乙醇提取3次。过滤组合的提取物并添加沉淀剂，硫酸铝钾，至pH3，及搅拌30min。静置2小时之后，通过离心去除沉淀。调整上清至pH7。使上清经过填充阳离子树脂，001X7的柱。柱的体积是液体的1/13。用水洗涤柱(2倍的柱体积)，并以柱体积/小时的流速用0.2N氨水(8倍的柱体积)洗脱。收集具有9～11的pH的铵水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵及调整到pH7。放的洗脱液液体通过填充大孔树脂AB-8的柱。柱的体积是洗脱液的1/20，流速是，2倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，将干燥的产物粉碎并经过80目筛。获得0.12kg的近白色粉末，其含有18.6％DNJ，39％总亚氨基糖和21％总氨基酸。
【实施例5】
粉碎50kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用相对原材料重量11倍的25％乙醇提取4次。过滤组合的提取物，然后使其通过填充Amberlite IR-120(H+)类型的阳离子树脂柱。柱的体积是液体的1/15。用水洗涤柱(1.5倍的柱体积)，并用0.7N氨水(5倍的柱体积)，以1.5倍的柱体积/小时的流速洗脱。收集9～11的pH的氨水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵并调整到pH7。使洗脱液通过填充S-8大孔树脂的柱。柱的体积是洗脱液的1/5，流速是柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得0.46kg的浅黄色粉，其含有5.6％DNJ，24％总亚氨基糖和48％总氨基酸。
【实施例6】
粉碎5kg的物种鲁桑(Morus alba var.multicaulis L.)的干桑树叶，并在回流下提取3次用相对原材料重量11倍的25％乙醇。过滤组合的提取物，然后使其通过填充阳离子交换树脂类型001X7的柱。柱的体积是液体的1/13。用水(2倍的柱体积)之后是0.5N氨水(5倍的柱体积)用1.5倍的柱体积/小时的流速洗脱柱。收集9～11的pH的氨水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵并调整到pH7。使洗脱液通过填充大孔树脂HP20的柱。柱的体积是洗脱液液体的1/10，流速是4倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得48g的浅黄色粉，其含有2.1％DNJ，8.3％总亚氨基糖和65％总氨基酸。
【实施例7】
粉碎5kg的物种黑桑(Morus nigra)的干桑树叶，并在回流下用相对原材料重量8倍的80％乙醇提取3次。过滤组合的提取物，并将其浓缩到约6L，向其中添加约12L的乙醇。以恒定速度搅拌半小时并静置过夜。通过以12000r/min离心15min来去除沉淀，回收乙醇到给定体积并添加适当的量的絮凝剂，诸如硫酸铝。完全沉淀之后，通过留出，通过离心去除沉淀。使上清液经过填充阳离子交换树脂，诸如001X7的柱。柱的体积是液体的1/10。用水(与柱体积相同的量)之后是0.5N氨水(4倍的柱体积)用3倍的柱体积/小时的流速洗涤柱。收集9～11的pH的氨水洗脱液。浓缩到定义的体积，去除铵并调整到pH7。使洗脱液通过填充大孔树脂HP20的柱。柱的体积是洗脱液的1/15，流速是，4倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得40g的近白色粉末，其含有3.9％DNJ，15％总亚氨基糖和58％总氨基酸。
【实施例8】
粉碎5kg的物种鸡桑(Morus australis Poir.)的干桑树叶，并在 回流下用原材料重量8倍的80％乙醇提取3次。过滤组合的提取物，然后使其通过填充Amberlite IR-120(H+)类型阳离子树脂的柱。柱的体积是液体的1/10。用水(1.5倍的柱体积)之后是0.7N氨水(5倍的柱体积)以1.5倍的柱体积/小时的流速洗脱柱。收集pH9～11的氨水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵并调整到pH7。使洗脱液通过填充AB-8大孔树脂的柱。柱的体积是洗脱液的1/13，流速是，2倍的柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得42g的浅黄色粉，其含有1.4％DNJ，5.2％总亚氨基糖和68％总氨基酸。
【实施例9】
粉碎50kg的物种桑(Morus alba)的干桑树叶，并在回流下用原材料重量的10倍的30％乙醇提取一次。过滤提取物，然后使其通过填充Amberlite IR-120(H+)类型阳离子树脂的柱。柱的体积是液体的1/13。用水(1.5倍的柱体积)之后是0.7N氨水(7倍的柱体积)用2倍的柱体积/小时的流速洗脱柱。收集9～11的pH的氨水洗脱液。浓缩到给定体积，去除铵并调整到pH7。使洗脱液通过填充AB-8大孔树脂的柱。柱的体积是洗脱液的1/15，流速是柱体积/小时。然后将收集的流体在真空下干燥，并将干燥的产物粉碎而经过80目筛。获得0.5kg的浅黄色粉，其含有4.2％DNJ，22％总亚氨基糖和46％总氨基酸。
【实施例10】
混合8部分的硬脂酸，5部分的单硬脂酸甘油酯，3部分的液体石蜡，8部分的鲸蜡，1部分的蜂蜡和5部分的硅油，及加热到75℃(形成“基液1”)。混合0.7部分的三乙醇胺，5部分的甘油，0.05部分的羟苯甲酯及加热到75℃(形成“基液2”)。向组合的基液1和2，添加3部分(w/w)的实施例1的桑树叶提取物，良好混合并将水添加到100ml。当冷却时添加充足的量的芳香，以产生含有所述桑树叶提 取物的美白霜剂。
【实施例11】
混合7部分(w/w)的甘油，4部分的丙二醇，0.2部分的30％NaOH和0.1部分的山梨酸钾。添加蒸馏水到100ml以获得水相。独立地混合10部分的硬脂酸，8部分的硬酯酸丁酯，1部分的单硬脂酸甘油酯和3部分的硬脂基醇并加热以获得油相。将上述水相加热到95℃。伴随连续搅拌将油相缓慢添加到相同的温度的水相。在约45℃，将2部分的实施例4的桑树叶提取物和0.4部分的L-抗坏血酸基-2-磷酸镁，及少滴的芳香添加到混合物，及保持搅拌直到2相混合。冷却以获得糊剂。
【实施例12】
混合7部分(w/w)的甘油，4部分的丙二醇，0.2部分的30％NaOH和0.1部分的山梨酸钾。添加蒸馏水到100ml以获得水相。独立地混合10部分的硬脂酸，8部分的硬酯酸丁酯，1部分的单硬脂酸甘油酯和3部分的硬脂基醇并加热以获得油相。将上述水相加热到95℃。伴随连续搅拌将油相缓慢添加到相同的温度的水相。在约60℃，将2部分的实施例1的桑树叶提取物和0.2部分的DEP-11添加到混合物。添加少滴的芳香及保持搅拌直到2相良好混合。冷却以获得糊剂。
【实施例13】
向0.4部分(w/w)的实施例5的桑树叶提取物添加0.1部分的羟苯乙酯，0.5部分的硫酸氢钠，0.1部分的依地酸二钠和9部分的甘油，并添加蒸馏水到100ml以获得洗液。
【实施例14】
将5kg的实施例1的桑树叶提取物与1.8kg的淀粉，1.5kg的微晶纤维素，0.45kg的交联PVP，0.55kg的CSM-Na，及适当的量的硬酯 酸镁和硅微-粉良好混合。制造20,000片剂，称重各约0.5g。
【实施例15】
将1.0kg的在实施例3中的桑树叶提取物与适当的量的淀粉混合，填充到10,000胶囊以制备各含有100mg的提取物的胶囊。
【实施例16】
向1.0kg的实施例3的桑树叶提取物添加0.5kg的维生素C，1.0kg的柠檬酸，0.8kg的碳酸氢钠，0.08kg的甘露糖醇，PVP，PEG 6000，调味剂及粘合剂以制备泡腾颗粒剂。
【活性测试实验】
【实验1.桑树叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定】
研究的目的是本发明中的桑树叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。试剂和设备如下：
(1)实施例1的桑树叶提取物，
(2)DNJ标准参照化学品，
(3)α-葡萄糖苷酶(I型自Bakers酵母,EC232.604.7)，使用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)制造成0.42U/ml溶液
(4)pNPG，使用0.1mol/L磷酸缓冲液制造成5mmol/L溶液
(5)pNP，使用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)制造成200μmol/L溶液
(6)Multiskan Ascent酶标仪(Thermo Electron Co.,USA)
方法如下：
【标准曲线】
使用0.1mol/L磷酸缓冲液将200μmol/L pNP溶液分别稀释成100μmol/L，50μmol/L，25μmol/L，12.5μmol/L，6.25μmol/L和3.125μmol/L。自各稀释的溶液取200μl用于在405nm处OD测量，并使用OD值绘制标准曲线。
【测试样品测定】
(1)将80μl不同浓度的各测试样品放入微平板的个孔，并将80μl磷酸缓冲溶液作为安慰剂。
(2)向各孔，添加30μl酶(0.42U/ml)，放置在台上30s，于37℃与底物(pNPG)一起温育15min及接通酶标仪，温度设置在37℃，测量模式为动力学和间隔10s。读数13次(总2min.)。
(3)向各孔添加90μl底物(5mmol/L pNPG)在台上振摇30s，放入酶标仪，施压开始，于37℃连续测量OD值。
(4)用pNP的浓度为X轴和OD值为Y轴，绘制标准曲线。使用步骤(3)中获得的OD值针对标准曲线以获得反应产物的相关的量。
(5)对不同浓度的安慰剂及测试样品，取时间为X轴和产物量为Y轴而绘制反应进展曲线。直线斜率是反应速度。
(6)用测试样品的浓度为X轴和反应速度为Y轴，建立测试样品浓度曲线及获得IC50。抑制活性(U/μg)＝(各孔的0.5×酶活性)/(各孔样品的IC50×体积)＝(0.5×0.42×0.03)/(IC50×0.08)＝0.07875/IC50。
【结果和讨论】
以上实验的结果显示，实施例1中的桑树叶提取物的IC50在抑制α-葡萄糖苷酶中具有13.6μg/ml的IC50值，而纯DNJ的是70μg/ml。此展示，前者的活性比后者大得多。考虑到在实施例1中的桑树叶提取物的DNJ含量仅为3.5％，其使得使用所述提取物达到相同的或更佳活性而减少通过使用更高浓度的纯化合物导致的可能不利的反应成为可能。见图5a和b分别显示，初始反应速度对比浓度，由桑属(Morus)提取物和DNJ的α-葡萄糖苷酶的体外抑制。
【实验2：桑树叶提取物和熊果苷对TYR的抑制活性测定】
目的是研究在黑色素瘤细胞系B16中测试样品对TYR活性的冲击和作用机理。试剂和设备如下：
(1)实施例1的桑树叶提取物
(2)DNJ标准参照化学品
(3)熊果苷标准参照化学品
(4)pH6.8磷酸缓冲液中的L-多巴溶液1mg/ml，使用之前现制备
(5)WIP细胞裂解缓冲剂
(6)细胞培养板(24孔和96孔)
(7)光学显微镜检
(8)离心机
(9)微平板读取器
方法如下：
用磷酸盐缓冲液洗涤B16黑色素瘤细胞，并在离心管中收集。离心之后，将含有苯基-甲磺酰基氟(PMSF)的WIP-裂解缓冲剂加入细胞沉淀而裂解细胞，并使溶液在冰上静置30分钟。随后将溶液以12000g，于4℃离心10min，保留含有细胞组分的上清液(细胞提取物)用于检定目的。
为了测定DNJ，熊果苷和桑属(Morus)提取物对酪氨酸酶催化性活性的直接效应，将60μl DNJ，熊果苷或桑属(Morus)提取物(改变使用的化合物浓度)添加到96-孔微平板中的60μl细胞提取物。将板于37℃温育1小时，然后将80μl L-多巴加入各孔。于37℃使用酶标仪以5分钟间隔记录各孔的吸光度(492nm)30分钟。
为了测定DNJ，熊果苷和桑属(Morus)提取物对酪氨酸酶催化性活性的间接效应，在提取和评定之前将B16黑色素瘤细胞与不同浓度的DNJ，熊果苷或桑属(Morus)提取物培养3天。提取后，将40μl细胞提取物，120μl磷酸盐缓冲液(pH6.8)，及40μl的L-多巴(2mg/ml)放入96-孔微平板，及于37℃使用酶标仪以5分钟间隔记录各孔在492nm处的吸光度30分钟。
【结果和讨论】
测定的结果可见于图6。浅色柱显示DNJ，熊果苷和桑属(Morus)提取物对细胞提取物中的酪氨酸酶活性的直接效应，而深色柱显示化合物对酪氨酸酶活性的间接效应的结果。
在直接活性测定中，熊果苷以剂量-依赖性方式减少酪氨酸酶的活性，而DNJ和桑属(Morus)提取物显示对酪氨酸酶活性无效应。但是，在间接活性测定中，在使细胞在测试化合物的存在下温育3天温育之后，在DNJ和桑属(Morus)提取物组中有酪氨酸酶活性的剂量-依赖性降低，但与熊果苷温育的细胞显示对酪氨酸酶活性无效应。
这些发现与报道的文献一致，并支持α-葡萄糖苷酶抑制物，DNJ和桑属(Morus)提取物的建议的不同作用机理。在直接活性测定中，熊果苷与酪氨酸酶直接相互作用，与活性位点结合及灭活酶，因此减少L-多巴氧化成o-多巴醌。α-葡萄糖苷酶抑制物不直接影响酪氨酸酶的活性，并此反映在直接活性检定的结果中，其中DNJ和桑属(Morus)提取物显示无酪氨酸酶抑制性活性。
在间接活性测定中，DNJ和桑属(Morus)提取物均显示具有对酪氨酸酶的抑制性活性。α-葡萄糖苷酶抑制物作用于未成熟的酪氨酸酶，及通过在酪氨酸酶成熟期间防止钙联结蛋白的结合，有影响成熟酪氨酸酶的酶促活性的构象变化。这些变化通过与DNJ和桑属(Morus)提取物3天温育之后酶促活性的降低被证明。熊果苷直接竞争酪氨酸酶活性位点，并在间接测定中，其中熊果苷不在测定溶液中存在，无酶促活性的抑制。
【实验3.本发明的桑树叶提取物对黑色素细胞中的黑色素含量的影响】
目的是研究测试样品对黑色素瘤细胞系B16的黑色素含量的影响。使用的试剂和设备如下：
(1)实施例1的桑树叶提取物
(2)DNJ标准参照化学品
(3)VC PMG标准参照化学品
(4)WIP裂解缓冲剂
(5)光学显微镜
(6)细胞培养板(24孔和96孔)
(7)离心机
(8)微平板读取器
方法如下：
(1)收获对数期的黑色素瘤B16细胞，并将细胞悬浮液调整到适当的浓度，分注入24孔板，并允许细胞粘附到壁。
(2)向各孔添加1ml通过用培养基稀释制造的不同浓度的测试样品(对于各浓度4个两份)。温育2天，刷新样品溶液，并持续温育2天。
(3)在第4天收获细胞，和用PBS彻底洗涤两次。添加250μl WIP裂解缓冲剂及允许在冰浴中裂解，每5min涡旋混合一次至4～5次。
(4)以12000rpm于4℃离心10min。去除上清液，并用400μl 1NNaOH溶解沉淀，并将其保持在80℃水浴中1小时。
(5)使用酶标仪测量在405nm处的OD值，并计算相对含量。
【结果和讨论】
测定结果可见于图7。中色柱显示DNJ对B16黑色素瘤细胞中的黑色素含量的抑制性效应，而深色柱和浅色柱显示VC-PMG和桑属(Morus)提取物对B16黑色素瘤细胞中黑色素含量的抑制性效应的结果。全部效应是与不同浓度的DNJ，VC-PMG或桑属(Morus)提取物3天温育之后。
相比对照，不同浓度水平的DNJ，VC-PMG和实施例1的处理的黑色素含量以剂量-依赖性方式显著降低。3种化合物的活性强度，自强到弱，是：DNJ>桑属(Morus)提取物>VC-PMG。
DNJ是自桑属(Morus)提取物鉴定的活性化合物，作为α-葡萄糖苷酶抑制物，且可减小导致B-16黑色素瘤细胞系中黑色素减少的酪氨酸酶的活性。由于全部植物中的天然存在的DNJ的含量非常低，不可能使用天然的DNJ用于商业目的。但用桑属(Morus)提取物，尽管桑属(Morus)提取物中的DNJ含量低至2～5％，桑属(Morus)提取物仍展示DNJ的活性的类似效力，其指示在桑属(Morus)提取物之中，DNJ可与其他活性化合物协同工作，以产生强抗-色素沉着效 应。
从我们的观察，当应用到B16黑色素瘤细胞的VC-PMG的浓度增加到超过200ppm，细胞的活力降低，这表明，过量的浓度的VC-PMG可导致对细胞的伤害。桑属(Morus)提取物，作为天然产物，相比VC-PMG具有更佳安全性特征和更强功效，且其作用机理不同于VC-PMG，由此桑属(Morus)提取物可单独使用或与VC-PMG组合使用而达到更佳抗-色素沉着效应。
为了开发桑属(Morus)提取物作为化妆品中的光泽产物，我们认为化妆品中通常使用的光泽成分的剂量是：熊果苷：1％～5％，曲酸：0.2％～3％，维生素衍生物：<3％。基于我们的研究，实施例1的建议剂量是低于3％。
【实验4.本发明的桑树叶提取物对黑色素细胞生长的影响】
【方法】
【细胞活力】
细胞存活使用MTT测定来测量，其基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物通过有活力的细胞中的线粒体酶转变为MTT-甲结晶。MTT在磷酸盐缓冲液(PBS)中新鲜制备为2mg/ml。将2×104细胞/ml平铺于96-孔板，将DNJ，VC-PMG，桑属(Morus)提取物或DMEM加入培养基。在不同时间点在整个实验过程中将等份的20μl的MTT浓储物溶液加入孔，及将板在湿润的5％CO2温育器中于37℃温育4h。4h之后，将这些细胞的甲结晶通过轻轻振摇溶解到100μl DMSO中。10min之后，用分光光度计使用ELISA平板读数仪在540nm处定量甲的量。
【黑色素瘤细胞中黑色素含量的确定】
以4×104细胞每24-孔培养板的孔的密度接种B16黑色素瘤细胞，于37℃在5％CO2气氛下温育24h。然后将细胞用各种浓度的DNJ，VC-PMG或桑属(Morus)提取物处理3天。将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，收集到离心管。离心之后，在含有苯基甲基磺酰氟化物(PMSF) 的WIP裂解缓冲剂中在冰上破坏细胞沉淀30min。将溶液以12000g于4℃离心10min，将沉淀通过于70℃热沸溶于1N NaOH经1h。在分光光度计中在405nm处检定黑色素含量。
【结果和讨论】
【DNJ，VC-PMG和桑属(Morus)提取物对细胞活力的效应】
将使用MTT测定对于B16黑色素瘤细胞的细胞活力的数据显示于图8a，图8b和图8c。
DNJ，VC-PMG和桑属(Morus)提取物在给定浓度诱导B16黑色素瘤细胞的无生长抑制。这些数据明显显示DNJ，VC-PMG和桑属(Morus)提取物在B16黑色素瘤细胞中在200ppm浓度以下的非-细胞毒性性质，并表明，细胞生长不影响以下黑色素含量测定。
【实验5：本发明的桑树叶提取物对威斯塔大鼠的血糖的影响】
试剂和设备如下：
(1)实施例1的桑树叶提取物
(2)盐水
(3)米格列醇标准参照化学品
(4)64只威斯塔大鼠
(5)Johnson’s One Touch Ultra血糖计和Code 9血糖测试条
使用的方法如下：
动物经腹膜内注射(15mg/kg或30mg/kg)或胃内(25mg/kg或50mg/kg)接收桑属(Morus)提取物。将米格列醇(25mg/kg)，批准用于2型-糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制物用作阳性对照。将空腹的血-糖水平记录为基线，并在接收淀粉膳食之后以05.hr，1hr和2小时的时间间隔测量血糖水平。在接受淀粉膳食之前给动物用桑属(Morus)提取物施剂。
【结果和讨论】
提供淀粉之后0.5h、1h、2h内的血糖(X±SD，n＝10)
结果显示，桑属(Morus)提取物显著减少血糖水平。胃内施用途径显示，活性化合物具有良好口腔生物利用度，且不被代谢灭活。用50mg/kg剂量的胃内和腹膜内剂量显著降低血糖水平，与此研究中的米格列醇同样有效。见图9。
【实验6：桑树提取物对减少人中血糖水平的效应】
【方法】
在小型人研究中，参与者接收400mg桑属(Morus)提取物或安慰剂，在过夜绝食之后加50g软糖。监控血糖水平3小时。此外，1位患者接收50g米格列醇作为阳性对照。
【结果和讨论】
数据显示，桑属(Morus)提取物显著减少血糖水平，减少初始血糖增加59.91％，经2小时减少血糖水平50.78％，及经3小时减少47.18％。桑属(Morus)提取物能减少软糖血糖指标，从83.8到41.2。见图10。
【实验7：桑树提取物对人中皮肤光泽的效应】
【方法】
将在实施例1中的桑树提取物制造成0.2％和0.5％霜制剂用于研究。对给了知情同意的20位雌性受试者(龄18及更大)，将各制剂应用到各前臂上的预先定义的区，两次每天。在第1治疗之前，测量皮肤色彩，其中使用Chromameter CR300在定义的区域上测量。
在28天的治疗后，受试者返回到测试实验室，其中在与第0天相 同的定义的区域进行皮肤色彩的新测量。
对3个研究参数进行评估：
●L*(自暗到亮)。此是皮肤的亮度参数。此参数的增加表征皮肤变光泽。
●b*(自蓝到黄)。此参数的降低表征皮肤黄成分的降低。
●ITA°(个体类型角)。此参数显示使用亮度(L*)和皮肤黑色素参数(b*)的受试者的皮肤色素沉着程度。ITA°的增加表征皮肤色素沉着的降低。
【结果和讨论】
在0.2％产品28天的每天使用之后(+0.54A.U.平均)L*参数显著增加(P<0.001)，代表皮肤着色的增加的亮度。在90％的受试者中观察到此效应。见图11a。
在0.2％产品的28天的每天使用之后(+1A.U.平均)个体类型角(ITA°)参数显著增加(P<0.001)指示皮肤色素沉着的降低。在57％的受试者中观察到此效应。见图11b。
对于0.5％产物：在28天的每天使用之后L*参数显著增加(P<0.001)指示皮肤亮度的增加。在86％的受试者中观察到此效应。见图11a
在产品的28天的每天使用之后0.5％制剂的个体类型角(ITA°)参数显著增加(P<0.001)，指示皮肤色素沉着的降低。在67％的受试者中观察到此效应。见图11 b。
【实验8.提取物数据】
本发明的提取物(样品1～3)在它们的以下表1中例证的特征中不同于现有技术提取物：
【表1】
样品 对α-葡萄糖苷酶I的IC50(μg/ml) 亚氨基糖含量 颜色 水溶解度 1 34 12％ 淡黄 易溶性 2 42 19％ 淡黄 易溶性 3 21 29％ 几乎白 易溶性 4 240 2％ 黄色棕 一般 5 180 5％ 黄 可溶性 6 204 3％ 褐绿 一般 7 110 12％ 褐绿 可溶性 8 150 6％ 褐黄 一般
对以上表1的解释：
样品1-3表示在实施例1～3中制备的产物；
样品4表示根据专利03139028.5制造的产物；
样品5用以下描述的方法制造：粉碎桑树叶，并在回流下用80％乙醇提取3次，1～2小时每次。第一次，使用原材料重量的6倍(w/w)的乙醇，之后第2和第3次是4倍。组合提取物并在过滤之前静置24小时。浓缩滤出液溶液和于70～80℃用水提取浓缩的提取物5次。每次使用原材料重量(桑树叶)的10倍的水。调整组合的水提取物的pH至pH3～4并添加NaCl到3～5％浓度。用60cm(H)x 3cm(D)的柱使液体经历D101大孔树脂层析。用水洗涤直到洗脱液澄清，然后用柱体积的5倍的30～50％乙醇，流速20/ml洗脱。收集洗脱液，将其浓缩并干燥而获得样品(5)。
用以下描述的方法制备样品6：粉碎桑树叶和每次用50～60％乙醇于50℃，使用桑树叶重量的10～12倍的乙醇提取两次。浓缩提取物，并使其通过填充D72强酸性大孔树脂的柱并收集流体(级分1)。用乙醇洗脱以获得级分2，之后是用含有2％铵的70％乙醇洗脱以获得级分3。分别离心及浓缩级分1，2和3。干燥及混合以获得样品(6)。
用以下描述的方法制备样品7：粉碎桑树叶，并用80℃水提取两次，(10～15倍的水)。调整组合的提取物的pH至pH2～3，冷却其到0℃直到完全沉淀。过滤，并使浓缩的过滤物经历阳离子树脂层析。用水之后是等同量的50％乙醇和氨水溶液的混合物洗脱，直到洗脱液成为无色。浓缩洗脱液和干燥以获得样品(7)。
用以下描述的方法制备样品8：粉碎桑树叶，并用30％乙醇提取3次(桑树叶的5倍的重量,每次)。浓缩组合的提取物，并向浓缩物添加乙醇而沉淀。将水添加到浓缩的上清液，并使其通过D101大孔树脂柱，并收集流体。用3倍的水洗脱，并组合流体和水洗脱液以获得级分1。持续用60％乙醇(5倍)洗脱柱以获得级分2。调整级分1至pH4，并使其通过阳离子交换柱。用水洗涤柱直到洗脱液成为无色，用0.5N氨溶液(8倍)洗脱并收集洗脱液以获得级分3。分别浓缩和干燥级分2和3，以获得样品(8)。
表中使用的溶解度术语定义如下：
●“易溶性”：1g样品会溶解于小于1ml水；
●“可溶性”：1g样品会溶解于10～30ml水；
●“一般”：1g样品会溶解于30～100ml水；
以上结果展示，本发明的产品在活性，关键有效成分的含量，颜色和水溶解度上相比当前产品更佳。