《一种查尔酮类化合物在制备抗血管新生药物中的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种查尔酮类化合物在制备抗血管新生药物中的用途.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410724453.9 (22)申请日 2014.12.03 A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 27/02(2006.01) A61P 17/06(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103 号 (72)发明人 吴春福 王立辉 。
2、杨静玉 陈国良 李猛 蒋晓蕊 李华欢 周启璠 方武宏 (74)专利代理机构 沈阳智龙专利事务所 ( 普通 合伙 ) 21115 代理人 宋铁军 周楠 (54) 发明名称 一种查尔酮类化合物在制备抗血管新生药物 中的用途 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域， 涉及查尔酮类化 合物在制备抗血管新生药物中的用途。本发明 提供的查尔酮类化合物 5d 在人脐静脉内皮细 胞 (HUVEC)Transwell 小室迁移实验、 Real-time cell analysis(RTCA)实验、 微管形成实验和在体 抗血管新生实验等具有明显的抑制作用， 可以明 显抑制内皮细胞微管的形成， 明显抑制内皮细胞 有。
3、阻力的迁徙转移。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104473917 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104473917 A 1/1 页 2 1.式 (I) 中新查尔酮类化合物 5d 在制备抑制血管新生的药物中的应用， 式 (I)5d 分子量 336。 2.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为肿瘤 血管新生的药物。 3.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为抑制 关节炎病变组织的。
4、血管新生的药物。 4.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为抑制 银屑病变组织血管新生的药物。 5.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为抑制 新生血管性眼病的药物。 6.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为抑制 动脉粥样硬化病变处血管新生的药物。 7.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物为抑制 糖尿病并发症眼病的药物。 8.根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述的抑制新生血管生成的药物剂型为 胶囊剂、 片剂、 微囊制剂。
5、、 注射剂、 栓剂、 喷雾剂或软膏剂。 9.根据权利要求 1 中所述的用途， 其特征在于 ： 含有有效量的式 (I) 新查尔酮类化合 物 5d 以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104473917 A 2 1/4 页 3 一种查尔酮类化合物在制备抗血管新生药物中的用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及新查尔酮类化合物以及含有此类化合物的药物组 合物作为制备治疗血管新生相关疾病的药物的应用。 背景技术 0002 血管新生指在原有血管的基础上芽生出新毛细血管的过程， 包括以下过程 ： 血管 内皮细胞增殖， 血管基底膜降解， 内皮。
6、细胞迁移并形成微管， 重塑基底膜， 血管生成 ； 该过程 包含了血管内皮细胞与周围细胞外基质间的相互作用， 主要受血管新生促进因子和血管新 生抑制因子的调控。 研究发现， 多种生长因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、 血管生成素 2和碱性成纤维细胞生长因子， 及标配生长因子等都可以通过不同的途径调节血管新生。 生 理状态下， 血管新生在胚胎发育、 创伤修复、 女性月经时短暂开放， 其余时段则处于关闭状 态， 从而使血管的生长与退化维持在动态的平衡状态。 0003 肿瘤是人体细胞异常分化增殖的恶性疾病。肿瘤在表现其生长、 转移等生物学行 为时与其中的微血管增生有密切的关系。无论原发性或转移性。
7、肿瘤 , 其持续性生长都必须 依赖于新生血管的形成。肿瘤的生长首先需要建立一个新生血管网络。缺少血供的肿瘤直 径一般只能维持在12mm以内。 新生肿瘤血管表现为结构不规则,生长方式各不相同,提 示肿瘤血管生成有着与正常新生血管不同的条件。 恶性肿瘤细胞依赖丰富的新生毛细血管 网及时得到其迅速无限生长所需的氧气和养料 , 并运走代谢废物。因此， 抗肿瘤血管新生 已经成为抗肿瘤发生发展的有效策略之一。目前抗血管新生药物已经有 Avastin、 Nexavar 和 Sutent 等被美国 FDA 批准应用治疗恶性肿瘤， 还有数十种抑制剂被批准进行临床实验。 0004 关节炎与血管新生的关系密切 , 。
8、因为关节炎早期的病理改变为持久性滑膜炎及 血管翳形成 , 尤其依赖于广泛的新生血管网的形成。血管翳具有类似于肿瘤组织的特 性 - 侵蚀性 , 它可侵蚀和破坏关节软骨和骨组织 , 最终引起不可逆的关节僵直、 功能丧失。 在关节炎的滑液细胞中有 VEGF 的高表达 , 显示 VEGF 与关节炎发生的关系。临床研究证 实 , 关节炎患者关节内新生血管增生的程度与患者的病情、 滑膜增生及炎细胞反应的程度 呈正比 , 抑制血管新生的药物可缓解关节炎的病情。 0005 除了恶性肿瘤及关节炎与血管新生相关外， 血管新生还与糖尿病视网膜病变、 银 屑病、 血管新生性眼病和动脉粥样硬化等多种疾病或病理过程有关。。
9、 发明内容 0006 发明目的 0007 本发明提供式 (I) 新查尔酮类化合物 5d(E)-1-(5- 羟基 -2,2- 二甲基 -2H- 色原 烯 -6- 基 )-3-(3- 羟基 -4- 甲氧基苯基 ) 丙 -2- 烯 -1- 酮 ) 在制备用于血管新生相关疾病 的治疗和 / 或预防药物中的应用。 0008 式 (I) 0009 说 明 书 CN 104473917 A 3 2/4 页 4 0010 本发明要解决的技术问题在于式 (I) 新查尔酮类化合物 5d 在制备用于血管新生 相关疾病的治疗和 / 或预防药物中的应用， 尤其是在制备肿瘤血管新生、 眼科疾病、 类风湿 性关节炎、 血管。
10、瘤、 银屑病等血管新生性疾病中的应用。其中， 所述抑制血管新生药物可抑 制肿瘤血管新生， 可抑制病变组织血管新生。其中， 所述肿瘤血管新生包括白血病、 淋巴 瘤、 骨髓瘤血液癌症的血管新生、 Kaposi s 肉瘤病变组织血管新生、 Paget s 疾病血管新 生、 血管瘤病变组织血管新生、 血管瘤、 实体瘤病变组织血管新生、 多发性血管瘤、 血管母细 胞瘤和良性血管增生疾病。所述病变组织血管新生包括关节炎病变组织血管新生、 血管新 生性眼病、 银屑病病变组织血管新生和动脉粥样硬化组织血管新生。 0011 本发明还提供含有有效量的式 (I) 新查尔酮类化合物 5d 以及药学可接受成分的 组合物。
11、在制备抑制血管新生药物中的应用。 根据本发明可以将治疗有效量的新查尔酮类化 合物和药学上接受的任意一种辅料制成药物组合物， 也可以添加其他与新查尔酮类化合物 没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。 可以在本发明的抑制血管新生的药物中加入一种或 多种药学上可以接受的载体。 其制剂可以是药学上的任意一种剂型， 包括但不限于胶囊剂、 片剂、 微囊制剂、 注射剂、 栓剂、 喷雾剂或软膏剂等。 0012 优点和效果 ： 0013 经研究表明， 本发明提供的式 (I) 中新查尔酮类化合物 5d 在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)Transwell小室迁移实验、 Real-time cell analysis(。
12、RTCA)实验、 微管形成实验和 在体抗血管新生实验等具有明显的抑制作用， 可以明显抑制内皮细胞微管的形成， 明显抑 制内皮细胞有阻力的迁徙转移。 0014 本发明中所用的新查尔酮类化合物为沈阳药科大学药物化学实验室合成和鉴定。 附图说明 0015 图 1 为本发明化合物抑制人肝癌细胞 Hep3B HIF-1、 HIF-1、 VEGF 及其 mRNA 的表达示意图 (VEGF 血管上皮细胞生长因子， TPT 拓扑替康， HIF-1 缺氧诱导因子 -1， HIF-1 缺氧诱导因子 -1， Actin 肌动蛋白 ) ； 0016 图 2 为本发明化合物抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVE。
13、C 侵袭的示意图 (Con 空白， VEGF 血管上皮细胞生长因子 ) ； 0017 图3为本发明化合物抑制VEGF诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC转移的示意图(VEGF 血管上皮细胞生长因子 ) ； 0018 图 4 为本发明化合物抑制 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 HUVEC 小管生成的示意图 (Con 空白， VEFG 血管上皮细胞生长因子 ) ； 0019 图 5 为本发明化合物在体抗血管新生的示意图。 具体实施方式 说 明 书 CN 104473917 A 4 3/4 页 5 0020 实施例 1、 化合物的配制及作用靶点 0021 1.1 化合物配制 0022 5d 化合物用 DM。
14、SO 溶解配制成 100mM 母液， 临用时用培养液稀释制需要浓度。 0023 1.2 化合物的作用靶点 0024 5d 显著下调 HIF-1、 HIF-1 的表达水平， 抑制 HIF-1 的活性， 进而抑制了 VEGF 的转录及表达， 发挥抗血管新生作用。 0025 1.2.1 材料 0026 肝癌细胞 Hep3B, 拓扑替康 (TPT), 培养液购自 Gibco,Cell Lysis Buffer 购 自 Beyontime， BCA protein assay 购自 Beyontime， 鼠抗 HIF-1 抗体、 鼠抗 VEGF 抗体 购自 Santa Cruz Biotechnolog。
15、y, 鼠抗 HIF-1 抗体购自 Cell Signaling Technology， 羊抗鼠 IgG 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology， 增强型化学发光系统 (ECL plus) 购自 Amersham Pharmacia Biotech， RNeasy Mini Kit 购自 Qiagen， RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 购自 Thermo。 0027 1.2.2 实验方法 0028 5d、 TPT 以 DMSO 溶解成 100mM 母液储备， 临用时以培养液稀释 ； 在 5 CO2， 37饱 和湿度的培养箱中。
16、培养 Hep3B 细胞。培养液以 90 RPMI-1640 或 MEM 基础培养基和 10 FBS 比例混合。细胞密度达到 80， 转移到缺氧小室 (1 O2， 5 CO2、 95 N2的混合潮湿气 体填充 ) 培养 48h ； 用不同浓度的 5d、 TPT 处理 Hep3B 细胞， 提取蛋白， Western blot 检测 HIF-1、 HIF-1、 VEGF 的表达 ； RT-PCR 检测 VEGF mRNA 的表达， RNeasy Mini Kit 提取总 RNA， RevertAid First StrandcDNASynthesisKit 获得 cDNA， PCR 检测 VEGF 。
17、mRNA 的表达。 0029 1.2.3 结果 0030 如图 1 中 5d 抑制了 HIF-1、 HIF-1、 VEGF 的表达， 同时 5d 抑制了 VEGF mRNA 的 表达， 此结果表明 5d 具有很好的抗血管新生的作用。 0031 实施例 2、 DW22 对 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 侵袭能力的影响 0032 2.1 材料 0033 原代 HUVEC 细胞， 培养液、 胰酶购自 Gibco， Transwell 小室购自 Corning， 基质胶 购自 BD， 钙黄绿素购自 Sigma。 0034 2.2 实验方法 0035 5d 以 DMSO 溶解成 100。
18、mM 母液储备， 临用时以培养液稀释 ； 在 5 CO2， 37饱和湿 度的培养箱中培养 HUVEC 细胞。培养液用含 1 FBS 的 M200 基础培养基。 0036 Transwell 小室以 1 ： 8 基质胶与培养液混合后包被， 37 度凝固 0.5h 后备用， 上室 加入200l不含VEGF的培养液， 下室加入500l含VEGF培养液， 药物处理组加入0.8、 4、 20M的5d， 培养12h后取出， 棉签擦去上室表面细胞， 以钙黄绿素染色观察下室表面细胞， 采用高内涵药物分析系统拍照， 并分析计 数。 0037 2.3 结果 0038 结果如图 2 所示， 5d 能够抑制 VEGF。
19、 诱导的 HUVEC 细胞侵袭， 此结果表明， 5d 够明 显抑制 VEGF 诱导的血管内皮细胞侵袭， 可能具有抑制新生血管生成的能力。 0039 实施例 3、 5d 对 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 迁移能力的影响 0040 3.1 材料 说 明 书 CN 104473917 A 5 4/4 页 6 0041 原代 HUVEC 细胞、 培养液、 胰酶购自 Gibco。 0042 3.2 实验方法 0043 5d 以 DMSO 溶解成 100mM 母液储备， 临用时以培养液稀释 ； 在 5 CO2， 37饱和湿 度的培养箱中饥饿处理 HUVEC 细胞， 利用 xCELLige。
20、nce analyser system 检测 HUVEC 细胞 迁移能力， 上室接种含 30,000-50,000 个细胞的无细胞悬液， 下室为含 10 FBS 的培养液， 药物处理组加入 0.8、 4、 20M 的 5d， 该系统检测细胞指数， 从而反应细胞迁移能力。 0044 3.3 结果 0045 结果如图 3 所示， 5d 能够抑制 VEGF 诱导的 HUVEC 细胞迁移， 此结果表明， 5d 够明 显抑制 VEGF 诱导的血管内皮细胞迁移， 可能具有抑制新生血管生成的能力。 0046 实施例 4、 5d 对 VEGF 诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 小管生成的影响 0047 4。
21、.1 材料 0048 原代 HUVEC 细胞、 培养液、 胰酶购自 Gibco， 96 孔板购自 Corning， 基质 胶购自 BD， 钙黄绿素购自 Sigma。 0049 4.2 方法 0050 5d 以 DMSO 溶解成 100mM 母液储备， 临用时以培养液稀释 ； 在 5 CO2， 37饱和湿 度的培养箱中培养 HUVEC 细胞。培养液用含 1 FBS 的 M200 基础培养基。 0051 96 孔板没空加入 1 ： 1 混合的基质胶与培养液， 37 度凝固 1h 后加入 100L HUVEC 细胞悬液， 每孔 15000 个细胞， 培养 12h 后拍照观察， VEGF 刺激浓度为 。
22、20ng/ml。 0052 4.3 结果 0053 结果如图 4 所示， 5d 能够抑制 VEGF 诱导的 HUVEC 细胞小管生成 , 此结果表明， 5d 能够明显抑制 VEGF 诱导的血管内皮小管生成， 可能具有抑制新生血管生成的能力。 0054 实施例 5、 5d 对人肝癌细胞 Hep3B 在体抗血管新生的影响 0055 5.1 材料 0056 Hep3B 细胞， Balb/c nude 雄性鼠， 抗 CD31 抗体、 3,3- 二氨基联苯胺购自 Sigma。 0057 5.2 方法 0058 每只鼠接种 100ul 细胞悬液 (5*106个细胞 )， 11 天后， 处死小鼠， 剥离瘤组织进行 免疫组织化学实验， 其步骤简介如下 : 包埋瘤组织， 脱蜡， 抗原修复， 血清或生物素封闭， 加 一抗， 加二抗， 加 3,3- 二氨基联苯胺， 苏木精染色。 0059 5.3 结果 0060 结果如图5所示， 5d能够下调血管新生相关标志物CD31， 此结果表明， 5d能够明显 抑制新生血管的形成。 说 明 书 CN 104473917 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104473917 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104473917 A 8 。