LOLP1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒.pdf

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1、10申请公布号CN104059140A43申请公布日20140924CN104059140A21申请号201310090071022申请日20130320C07K14/47200601C12N15/12200601C12Q1/68200601G01N33/6820060171申请人湖南莱拓福生物科技有限公司地址410000湖南省长沙市高新开发区麓谷大道662号软件中心大楼1179号72发明人祝跃球74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人闫桑田54发明名称LOLP1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒57摘要本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1，以。

2、及一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表2页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表2页附图5页10申请公布号CN104059140ACN104059140A1/1页21一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1LIGHTOFLIFEPROTEIN1，LOLP1蛋白，其由SEQIDNO1所示的氨基酸序列构成。2编码LOLP1蛋白的DNA，其由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。3一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含特异性检测LO。

3、LP1蛋白的试剂。4根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白的抗体。5根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述LOLP1蛋白由SEQIDNO1所示的氨基酸序列构成。6根据权利要求35中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。7根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白核酸的引物或探针。8根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述LOLP1蛋白核酸由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。9根据权利要求38中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自。

4、下组肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。10根据权利要求36中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定ELISA试剂盒、时间分辨荧光免疫测定TRFIA试剂盒、化学发光检测试剂盒。11一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。权利要求书CN104059140A1/12页3LOLP1蛋白和用于癌症的诊断等的试剂盒技术领域0001本文涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1LIGHTOFLIFEPROTEIN1，LOLP1蛋白，以及一种用于癌症的早期诊。

5、断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒。背景技术0002乳腺癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和肝癌等癌症均是目前多发和常见的癌症，并且致死率非常高。目前尚缺乏有效地针对乳腺癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和肝癌患者的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的方法。因此，急需新的特异性高、敏感性高、易操作的、对人体无危害、能在癌症发病的早期及时诊断、并且对于治疗指导、预后判断或复发检测等具有实用价值的靶标和检测评估方法。发明内容0003针对上述问题，本发明人从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出一个新的特异性蛋白，即人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1LIGHTOFLIFEPROTEIN1，LOLP1蛋白。该蛋。

6、白质由316个氨基酸组成，在除消化道外的正常成体组织中几乎不表达。但经本发明人的研究发现LOLP1蛋白在人类肝癌、肺癌、乳腺癌及甲状腺癌中过度表达。相反，LOLP1蛋白在人的正常消化道组织中高表达，但是在肠癌组织中低表达或不表达。0004本发明人进一步进行了深入地研究，获得了一种新的蛋白质以及编码该蛋白质的核苷酸序列，并利用该蛋白质或其核苷酸序列的特异性，开发用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，0005具体而言，本文涉及如下内容00061一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1LOLP1蛋白，其由SEQIDNO1所示的氨基酸序列构成。00072编码LOLP1蛋白的DNA，。

7、其由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。00083一种重组载体，其包括项2的重组载体。00094一种转化体，其是将项3所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。00105一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含特异性检测LOLP1蛋白的试剂。00116项5所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白的抗体。00127项6所述的试剂盒，其中所述LOLP1蛋白由SEQIDNO1所示的氨基酸序列构成。00138项57中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。说明书CN1。

8、04059140A2/12页400149项5所述的试剂盒，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白核酸的引物或探针。001510项9所述的试剂盒，其中，所述LOLP1蛋白核酸由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。001611项510中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含LOLP1蛋白或核酸标准品。001712项511中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自下组肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。001813项58中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定ELISA试剂盒、时间分辨荧光免疫测定TRFIA试剂盒、化学发光检测试剂盒。00191。

9、4项13所述的试剂盒，其包括0020包被有LOLP1蛋白的特异性捕获抗体的ELISA板；0021生物素标记的另一种属来源的LOLP1蛋白的特异性检测抗体；该捕获抗体与检测抗体均可与LOLP1蛋白结合。002215项14所述的试剂盒，其还包括0023包被缓冲液1PBS，PH7301；0024样品稀释液1PBS、1BSA、005NAN3，PH7301；0025封闭液1PBS、3BSA；0026洗脱液PBST1PBS、005TWEEN20；0027STREPTAVIDINHRP或者STREPTAVIDINEU。002816根据项14或15的试剂盒，其中捕获抗体和检测抗体是利用LOLP1蛋白免疫动物获。

10、得的纯化抗体或单克隆抗体。002917根据项1416中任一项的试剂盒，其中检测抗体的生物素标记效率生物素/抗体为510。003018根据项517中任一项所述的试剂盒，其中所述早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测包括0031A利用所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中LOLP1蛋白或核酸的水平；0032B将A中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。003319根据项18的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、乳汁、肠液等体液，大便或组织样品。003420特异性检测LOLP1蛋白的试剂在制备用于癌症早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒中的用途。00352。

11、1根据项20所述的用途，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白的抗体。003622根据项20所述的用途，其中所述LOLP1蛋白由SEQIDNO1所示的氨基酸序列构成。003723根据项2022中任一项所述的用途，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本。说明书CN104059140A3/12页5003824根据项20所述的用途，其中，所述特异性检测LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白核酸的引物或探针。003925根据项24所述的试剂盒，其中所述LOLP1蛋白核酸由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。004026根据项。

12、2025中任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包含LOLP1蛋白或核酸标准品。004127根据项2026中任一项所述的用途，其中所述癌症选自下组肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌。004228根据项2022中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定ELISA试剂盒、时间分辨荧光免疫测定TRFIA试剂盒、化学发光检测试剂盒。004329根据项28所述的用途，其包括0044包被有LOLP1蛋白特异性捕获抗体的ELISA板；0045生物素标记的另一种属来源的LOLP1蛋白的特异性检测抗体；该捕获抗体与检测抗体均可与LOLP1蛋白结合。004630根据项29所述的用途，其还包括0047包被缓。

13、冲液1PBS，PH7301；0048样品稀释液1PBS、1BSA、005NAN3，PH7301；0049封闭液1PBS、3BSA；0050洗脱液PBST1PBS、005TWEEN20；0051STREPTAVIDINHRP或者STREPTAVIDINEU。005231根据项29或30的用途，其中捕获抗体和检测抗体是利用LOLP1蛋白免疫动物获得的纯化抗体或单克隆抗体。005332根据项2931中任一项的用途，其中检测抗体的生物素标记效率生物素/抗体为510。005433根据项2032中任一项所述的用途，其中所述早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测包括0055A利用所述特异性检测LOLP。

14、1蛋白的试剂测量来自受试者的生物学样品中LOLP1蛋白或核酸的水平；0056B将A中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。005734根据项33的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、乳汁、肠液等体液，大便或组织样品。005835一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。附图说明0059图1为显示LOLP1蛋白在正常人组织中的表达的图。图1LOLP1蛋白和肌动蛋白ACTIN在人类正常组织中的表达结果。利用从图示中的人类组织中提取的蛋白质，以及本文的LOLP1蛋白特异性抗体进行WESTERN印迹，。

15、再用不同荧光标记的二抗显示抗原抗体反应结果。说明书CN104059140A4/12页60060图2为显示LOLP1蛋白在肝癌中的表达的图。图2LOLP1蛋白在人类肝癌组织中的表达，其中图2A为用人类肝癌冰冻切片进行免疫组织化学并利用显微镜观察而检测到的LOLP1蛋白在肝癌组织中的表达情况，图2B为利用显微镜观察的无抗体对照。其中图2A用LOLP1蛋白特异性抗体检测到LOLP1蛋白。图2B用兔血清IGG取代LOLP1蛋白特异性抗体，证明结果的特异性。0061图3为显示LOLP1蛋白在肺癌中的表达的图。图3免疫组织化学检测的LOLP1蛋白在人类肺癌组织中的表达，其中图3A为利用显微镜观察的LOLP。

16、1蛋白在正常肺组织中的表达情况，图3B为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在肺癌组织中的表达情况，即用肺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP1蛋白在人类正常肺组织中不表达，但在肺癌组织中特异性表达。0062图4为显示LOLP1蛋白在甲状腺癌中的表达的图。图4LOLP1蛋白在人类甲状腺癌组织中的表达，其中图4A为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在正常甲状腺组织中的表达情况，图4B为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在甲状腺癌组织中的表达情况，即用甲状腺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP1蛋白在人类正常甲状腺组织中不表达，但在甲状腺癌组织中特异性表达。0063图5为。

17、显示LOLP1蛋白在乳腺癌中的表达的图。图5LOLP1蛋白在人类乳腺癌组织中的表达，其中图5A为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在正常乳腺组织中的表达情况，图5B为利用显微镜观察LOLP1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，即用人类乳腺组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP1蛋白在人类正常乳腺组织中不表达，但在乳腺癌组织中特异性表达。0064图6为显示LOLP1蛋白在乳腺癌速冻组织中的表达的图。图6LOLP1蛋白在人类乳腺癌速冻组织中的表达结果，其中图6A为RTPCR的结果，是通过从组织中提取RNA、反转录为CDNA、再进行PCR扩增而得到的结果。图6B为WESTERNBLOT的结果，。

18、是从冰冻组织中提取的蛋白，以本文的LOLP1蛋白特异性抗体进行WESTERN杂交，再用不同荧光标记的二抗显示抗原抗体杂交结果。0065图7为显示LOLP1蛋白在结肠癌中的表达下降的图。图7LOLP1蛋白在人类结肠癌组织中的表达，其中图7A为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在正常结肠组织中的表达情况，图7B为利用显微镜观察的LOLP1蛋白在结肠癌组织中的表达情况，即用组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。结果表明LOLP1蛋白在人类正常结肠组织中高表达，但在结肠癌组织中未见表达。0066图8为显示LOLP1蛋白纯化及ELISA检测的灵敏度的图。图8LOLP1蛋白纯化及夹心ELISA试剂盒的灵敏性。。

19、0067A纯化的LOLP1蛋白考马士亮蓝染色分析。0068B用纯化的LOLP1蛋白检测夹心ELISA的灵敏度分析。其中捕获抗体来自用全长LOLP1蛋白免疫山羊获得的纯化抗体；检测抗体来自用全长LOLP1蛋白免疫兔获得的纯化抗体。用纯化的、不同量的LOLP1蛋白作为待检样品，以确定最低检测灵敏度。0069图9为显示LOLP1蛋白在正常人群和乳腺癌及肝癌患者血清中的浓度分布的图。图9示出正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布，其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。说明书CN104059140A5/12页70070图10为显示LOLP1蛋白在肺癌患者血清中的浓度分布的图。

20、。图10示出肺癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布。其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。0071图11为显示LOLP1蛋白在甲状腺癌患者血清中的浓度分布的图。图11示出甲状腺癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布。其是利用上述的夹心ELISA检测得到的分布结果。0072图12示出LOLP1蛋白在肠液中的浓度。具体实施方式0073本文涉及一种人类肿瘤特异性抗原莱拓福蛋白1LIGHTOFLIFEPROTEIN1，在本文中有时也简称为LOLP1蛋白，该蛋白质是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的一个新的特异性蛋白抗原。该蛋白质具有316个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。0074本文。

21、中利用考马士亮蓝染色分析对经纯化的LOLP1蛋白进行分析，纯化后的蛋白质的结构和大小如图8A所示，其大小约为37KDA。0075本文进一步涉及编码LOLP1蛋白的DNA有时也用LOLP1表示，其由SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列构成。0076本文所涉及的DNA序列可以通过SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的引物从人体细胞如肠上皮细胞或肝、肺等肿瘤细胞扩增获得LOLP1蛋白的CDNA。对于扩增得到的CDNA进行测序，该序列即为SEQIDNO2所示的核苷酸序列。0077本文还涉及包括SEQIDNO2所示的核苷酸序列的重组载体，以及将所述重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。在本文中可。

22、以采用上述克隆得到的编码本文的LOLP1蛋白的DNA，将其导入适当的宿主并进行表达，可以得到本文的LOLP1蛋白。例如，通过基于本说明书中记载的编码本发明的LOLP1蛋白的基因的碱基序列的信息，设计本发明的LOLP1蛋白的基因特异性的探针或引物，使用该探针或引物从人体细胞如肠上皮细胞或肝、肺等肿瘤细胞中扩增编码本文LOLP1蛋白的DNA，利用基因重组技术将其装入载体，再导入宿主细胞，并在宿主细胞中表达，能够得到本发明的LOLP1蛋白。0078本文涉及的LOLP1蛋白在人的正常大脑、脾、肝、肺、胸腺、心脏、肾中不表达或基本不表达参见图1，而在罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的患者的肝、肺、甲状腺。

23、及乳腺癌组织中却有明显表达。相反，LOLP1蛋白在人的正常肠组织中高表达，但是在肠癌组织中低表达或不表达参见图2图5，以及图7。0079此外，进一步利用半定量RTPCR及WESTERNBLOT方法来研究LOLP1蛋白在人类乳腺癌中的表达。RTPCR的结果显示，在正常的乳腺组织中未观察到编码LOLP1蛋白的DNA向RNA的转录，而在乳癌患组织中则观察到了编码LOLP1蛋白的DNA向RNA的转录参见图6A。由此可以说明LOLP1蛋白在DNA向RNA转化的过程中即发生了变化。0080此外，WESTERNBLOT的结果进一步证实LOLP1蛋白在正常乳腺组织中未见表达，而在乳腺癌组织中高表达，其中ACT。

24、IN作为参照参见图6B。0081初步的研究表明LOLP1蛋白可能促进肿瘤细胞的生长、增殖及浸润，在肿瘤的发生、发展中起极为重要的作用。0082本发明人发现肿瘤细胞可分泌LOLP1蛋白到外周血液循环中，在罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的患者的血清中检测到LOLP1蛋白浓度的增加。因此LOLP1蛋白说明书CN104059140A6/12页8可以作为新的肿瘤血清标记物，可用于肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的早期诊断、诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。相反，本发明人发现人的正常肠上皮细胞可分泌LOLP1蛋白到肠液、大便中，但在肠癌患者的肠液、大便中LOLP1蛋白浓度减少或检测不到LOLP1蛋白。因此。

25、，LOLP1蛋白也可以用于肠癌的早期诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。0083本文提供的检测LOLP1蛋白的试剂盒，包括特异性识别LOLP1蛋白的抗体，该抗体被包被在固体载体上。0084本文利用夹心ELISA技术建立了检测血清LOLP1蛋白抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的人群筛查，并可用于指导治疗、预后判断以及监测复发病人。0085本文还涉及提供一种检测LOLP1蛋白的夹心ELISA试剂盒。该试剂盒主要包括有包被有捕获LOLP1蛋白的抗体的ELISA板；生物素标记的检测抗体2G/ML兔抗LOLP1蛋白抗体或单克隆抗体；捕获抗体与检测抗体均可与。

26、LOLP1蛋白抗原结合。0086所述检测LOLP1蛋白的夹心ELISA试剂盒还包括有包被缓冲液1PBS，PH7301；样本稀释液/抗体稀释液1PBS、1BSA、005NAN3，PH7301；封闭液1PBS、3BSA；洗脱液PBST1PBS、005TWEEN20；辣根过氧化物酶HRP标记的链霉抗生物素蛋白STREPTAVIDINHRP或者链霉抗生物素蛋白EUSTREPTAVIDINEU；标准品不同浓度的纯LOLP1蛋白，分别为0、03125、0625、125、25、5、10、20NG/ML。0087所述捕获抗体来自用全长LOLP1抗原免疫羊获得的纯化抗体或免疫小鼠获得的单克隆抗体；检测抗体来自用。

27、全长LOLP1抗原免疫兔获得的纯化抗体或单克隆抗体。检测抗体的生物素标记效率生物素/抗体为5101，即每一个抗体分子结合510个生物素。0088本文的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。0089为此目的，本发明提供一种制备上述检测LOLP1蛋白抗原的夹心ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤0090用包被缓冲液将捕获抗体稀释成710G/ML，在ELISA板的每孔中加入100L上述抗体稀释液，4C过夜；取出，置于37C30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100L封闭液，37C2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4C，备用。0091使。

28、用时，将血清样本110稀释，每孔加入100L稀释血清和标准品0、03125、0625、125、25、5、10、20NG/MLLOLP1蛋白纯蛋白稀释品，37C孵育1小时。去除样本液，用PBST洗5次，用抗体/缀合物缓冲液ANTIBODY/CONJUGATEBUFFER稀释生物素标记的兔抗LOLP1蛋白抗体1500，然后每孔加入100L抗体稀释液，37C孵育1小时。去除抗体液，用PBST洗5次，用ANTIBODY/CONJUGATEBUFFER稀释STREPTAVIDINHRP15000，然后每孔加入100L稀释液，37C孵育1小时。去除STREPTAVIDINHRP稀释液，用PBST洗5次，每。

29、孔加入100LTMBHRP底物，37C孵育30分钟。每孔加入50L终止液STOPSOLUTION终止反应。在30分钟内，用450NM波长读取OD值，以620NM作为参考。以标准品制作的标准曲线，计算出稀释血清中LOLP1蛋白的浓度，然后将浓度乘以10，得到血清样本中的终浓度。0092任选地，该试剂盒还可以包含下述与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标说明书CN104059140A7/12页9准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的LOLP1蛋白标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本文方法的说明书、任选地提供用于解析实施本文方法时获得的结果的标准图、。

30、数据和软件。0093本发明人在研究中，发现LOLP1蛋白在肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌组织中高表达，在同一患者的癌旁组织中低表达或不表达参见图1图6。相反，本发明人发现人的正常肠上皮细胞高表达LOLP1蛋白，但在肠癌组织中LOLP1蛋白减少或检测不到。本发明人建立的检测LOLP1蛋白的夹心ELISA试剂盒、时间分辨荧光免疫测定TRFIA试剂盒、及化学发光检测试剂盒，可适用于肝癌，肺癌、肠癌、甲状腺癌和乳腺癌早期诊断和人群筛查、治疗效果判断、复发监测及预后判断等方面，具有快速、客观和准确性等优点。0094本文还提供一种检测LOLP1蛋白的试剂盒，其包括特异性检测LOLP1蛋白的试剂，该特异性检测。

31、LOLP1蛋白的试剂是特异性识别LOLP1蛋白核酸的引物或探针。0095本文还涉及一种用于癌症的早期诊断、诊断、治疗指导、预后判断或复发监测的试剂盒，其包含用于特异性检测SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互补序列的引物或探针。0096其中可以使用上述引物，通过常规的分子克隆方法扩增SEQIDNO2所示的核苷酸序列。所述探针可以与SEQIDNO2所示的核苷酸序列杂交。0097探针和引物按照本领域常规的方法设计和合成即可，只要其可以特异性识别LOLP1蛋白核酸序列即可。探针或引物是指核酸序列。引物的实例例如为本文中所提及的SEQIDNO3和SEQIDNO4。0098此外，上述探针和引物可被固定在。

32、一种或多种固体载体上。所述固体载体是指能通过疏水、离子或共价交联结合探针和/或引物的任何固体材料，例如有珠子、膜、过滤器材、生物芯片等。连接在固体载体上的探针和/或引物可以用于形成本文的试剂盒。0099本文提供的检测LOLP1蛋白的试剂盒，包括特异性识别LOLP1蛋白核酸的引物或探针，其可以被固定于固体载体上。0100任选地，该试剂盒还可以包含下述与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的核酸标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本文方法的说明书、任选地提供用于解析实施本文方法时获得的结果的标准图、数据和软件。01。

33、01此试剂盒适用于肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的病人筛查，并可用于指导治疗、预后判断以及监测复发病人。0102本文中的早期诊断是指在当肿瘤还很小，没有转移，病人还没有出现临床症状时，通过检测血清中的LOLP1蛋白水平的改变例如，在血清中检测到出现该LOLP1蛋白，来进行诊断；或者对患者肠液、大便中的LOLP1蛋白水平进行检测以判断其是否发生改变例如，样品中LOLP1蛋白的浓度减少或检测不到LOLP1蛋白，来进行诊断。肿瘤的早期诊断是提高治愈率，减少死亡率的关键。0103本文中的诊断是指利用人血清中LOLP1蛋白水平的改变的检测结果，或者肠液、大便中的LOLP1蛋白水平的。

34、改变的检测结果来对肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌、肠癌进行诊断。具体地，将检测到的LOLP1蛋白水平与相应的非癌对照进行比较，若LOLP1蛋白水平高于非癌对照，则表明患者患有或风险罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌；或LOLP1蛋白水平低于非癌对照，则表明患者患有或有风险罹患肠癌。这里，“非癌对照”可以是来说明书CN104059140A8/12页10自同一患者的与待诊断的癌症具有相同组织来源的非癌性组织或细胞中LOLP1蛋白的水平，也可以是从已知的正常人的相应组织中LOLP1蛋白的平均水平。本领域技术人员能够合适地确定非癌对照的水平。0104本文中的治疗指导是指检测接受治疗的肝癌、肺癌、甲状腺癌及。

35、乳腺癌、肠癌病人血清中或肠液、大便中的LOLP1蛋白水平的改变，可判断疗效。对于肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌的患者而言，如果与实施治疗之前相比，实施治疗之后血清中的LOLP1蛋白的水平降低则表示治疗有效，而LOLP1蛋白水平升高则预示病情恶化。0105本文中的监测复发是指定期检测已治愈的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP1蛋白水平的改变，如果相比于基线水平LOLP1蛋白的水平升高则预示癌症复发。0106本文中的预后判断是指肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP1蛋白的水平往往与肿瘤的大小及瘤组织中LOLP1蛋白的表达水平有关，二者均为预后不良的征兆。再有接受治疗的肝癌、肺癌。

36、、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中LOLP1蛋白的变化，也预示治疗的效果及病人的预后。对于肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌患者而言，测定患者血清中LOLP1蛋白的水平，并与预后良好的对照水平进行比较，如果与预后良好的对照相比患者血清中LOLP1蛋白的水平升高，则提示患者的预后不良，反之，则预后良好。0107实施例0108下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，所有的限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技中国有限公司THERMOFISHERSCIENTIFICINC。实验中使用的试剂。

37、购自西格玛奥德里奇中国公司SIGMAALDRICHCOLLC。0109实施例1LOLP1蛋白CDNA序列的获得0110通过如下方法获得了LOLP1蛋白的CDNA序列。用TRIZOLINVITROGEN,USA提取人肝癌细胞内总RNA，溶解在去离子水中，测定浓度。用下例反应体系去除污染的DNA01110112将该反应体系放置在室温15分钟0113加多聚OLIGODT1L0114然后在75C加热10分钟，后置于冰上速冻。0115按照下述组成逆转合成CDNA01160117说明书CN104059140A109/12页110118添加后置于42C孵育45分钟。0119按照如下条件进行PCR012001。

38、2194C变性5分钟，然后94C变性45秒，56C复性45秒，72C延长90秒，共30个循环。然后利用常规方法纯化DNA并进行测序，测序结果如SEQIDNO2所示。0122其中所使用的PCR引物为0123SEQIDNO35端CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC0124SEQIDNO43端GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC0125实施例2LOLP1蛋白的纯化0126将LOLP1CDNA克隆到含组氨酸标签的PQE原核细胞蛋白表达载体，导入活化的大肠杆菌，分选阳性克隆，用LB培养基培养、扩增，IPTG诱导蛋白表达，收集菌液、离心收集细菌。用超声破碎细菌、离心取上清，与NINTA。

39、反应结合含组氨酸标签的LOLP1蛋白，洗涤、收集蛋白，测定浓度。0127通过上述方法得到的该纯化的蛋白与常规1X加样缓冲液在95C加热5分钟，用12聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用考马斯亮蓝染色，结果如图8A所示，得到了大小与预期大小相同的为37KDA的LOLP1蛋白。0128实施例3制备检测LOLP1蛋白抗原的夹心ELISA试剂盒0129实施例3中所使用的捕获抗体和检测抗体是利用实施例2表达并纯化而获得的全长LOLP1蛋白分别免疫山羊和家兔后获得血清，并用LOLP1抗原制备的亲和柱纯化后获得的。兔抗LOLP1蛋白抗体被生物素标记。本文获得的捕获抗体和检测抗体的灵敏度和特异性都很强，如图8B所示。

40、，夹心ELISA可检测到003125NG/ML的LOLP1蛋白。其中生物素标记试剂盒购自PIERCE公司。STREPTAVIDINHRP购自ALPHADIAGNOSTIC公司。检测LOLP1蛋白的ELISA板由按照本文所描述的方法制备；所用试剂配制如下包被缓冲液1PBS，PH7301；样本稀释液/抗体稀释液1PBS、1BSA、005NAN3，PH7301；封闭液1PBS、3BSA；洗脱液PBST1PBS、005TWEEN20；检测抗体1G/ML兔抗LOLP1蛋白抗体；标准品不同浓度LOLP1蛋白抗原0、03125、0625、125、25、5、10、20NG/ML。0130实施例4正常人群和乳腺。

41、癌患者、肝癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布说明书CN104059140A1110/12页120131检测ELISA板的制备用包被缓冲液将实施例3中得到的捕获抗体稀释成710G/ML，在ELISA板的每孔中加入100L上述抗体稀释液，4C过夜；取出，置于37C30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100L封闭液，37C2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4C，备用。0132血清样本的检测血清样本用PBS以110稀释，每孔加入100L样品稀释液或标准品不同浓度LOLP1蛋白抗原0、03125、0625、125、25、5、10、20NG。

42、/ML，37C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；检测抗体用抗体稀释液以1500稀释，每孔加入100L实施例3制备的检测抗体稀释液，37C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，控干；STREPTAVIDINHRP用抗体稀释液以180000稀释，每孔加入100LSTREPTAVIDINHRP稀释液，37C，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；100L加入底物3,3,5,5四甲基联苯胺TMB，37C，避光孵育30分钟；加入50L2MH2SO4中止反应；用酶标仪以450NM波长测定OD值。绘制标准曲线，根据标准曲线，计算出血清样本中LOLP1蛋白的浓度，并10，得到血。

43、清LOLP1蛋白终浓度。0133检测结果分析0134选取71例健康人、50例乳腺癌患者和50例原发性肝癌患者进行血清样本检测，结果用GRAPHPAD40统计学软件进行分析。T检验结果显示，平均LOLP1蛋白水平在两组人群中有显著性统计学差异P0001。如表1所示，在这71例正常人群中，血清LOLP1蛋白的浓度范围为011NG/ML，平均值为519NG/ML，最高值为107NG/ML。其中，746的样本的LOLP1蛋白浓度集中在39NG/ML如图9。乳腺癌患者血清LOLP1蛋白的浓度范围为95684NG/ML，平均值为2072NG/ML。88的患者血清LOLP1蛋白的浓度高于10NG/ML，最高。

44、值达到了684G/ML。肝癌患者血清LOLP1蛋白的浓度范围为12489NG/ML，平均值为325NG/ML。0135表1血清LOLP1蛋白浓度分布NG/ML0136说明书CN104059140A1211/12页130137实施例5肺癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布0138采用与实施例4相同的方法制备检测ELISA板，以及血清样本，此外，选取76位肺癌患者进行血清样本检测，分布的结果图10所示。在76位肺癌患者血清中，只有5例低于10NG/ML，其余均高于110NG/ML。用GRAPHPAD40统计学软件进行分析，T检验结果显示，LOLP1蛋白抗原水平在肺癌患者血清中明显高于正常人群P000。

45、1。0139实施例6甲状腺癌患者血清中LOLP1蛋白浓度分布0140采用与实施例4相同的方法制备检测ELISA板，以及血清样本，此外，选取42位肺癌患者进行血清样本检测，分布的结果图11所示。在42位甲状腺癌患者血清中，只有1位低于10NG/ML，其余均高于110NG/ML。用GRAPHPAD40统计学软件进行分析，T检验结果显示，平均LOLP1蛋白抗原水平在甲状腺癌患者血清中明显高于正常人群P0001。0141实施例7肠癌患者肠液中LOLP1浓度的检测0142用肠镜收集肠液，离心、沉淀，收集上清。采用与实施例4相同的方法制备ELISA板检测肠液中LOLP1蛋白抗原水平。我们收集、检测了10例。

46、正常人和15例肠癌患者的肠液。结果用GRAPHPAD40统计学软件进行分析。T检验结果显示，平均LOLP1蛋白抗原水平在两组人群中有显著性统计学差异P0001。分布的结果图12所示。0143本文发现了一种新的LOLP1蛋白作为一种肿瘤血清标记物，该LOLP1蛋白以及编码LOLP1蛋白的DNA具有很强的肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌特异性。本文提供了检测血清、肠液中LOLP1蛋白抗原的实验方法和夹心ELISA试剂盒。本文所述方法的特异性强，本底水平低。此外本文所述的夹心ELISA试剂盒的灵敏度高，可检测到003125NG/说明书CN104059140A1312/12页14MLLOLP1蛋白，。

47、如图8B所示。另外本文所述方法简单快捷。整个实验操作对于实验仪器和试剂的要求都不高，在一般实验室均可进行，其准确度高，结果由酶标仪定量分析，排除了主观性。说明书CN104059140A141/2页1500010002序列表CN104059140A152/2页16序列表CN104059140A161/5页17图1图2图3说明书附图CN104059140A172/5页18图4图5说明书附图CN104059140A183/5页19图6图7说明书附图CN104059140A194/5页20图8图9说明书附图CN104059140A205/5页21图10图11图12说明书附图CN104059140A21。