技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗。
背景技术
鸡新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。
鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。
通过对Ⅰ群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，可通过水平和垂直两种途径传播，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围也越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病，特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。许多I群禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但是I群4型禽腺病毒例外，可直接引起鸡群发病，主要病变表现为心包积液和肝、肾肿大，本病于1963年首次在美国发生，随后在世界各地相继出现，是全世界家禽和野禽常见的传染病原。1976年我国台湾省首次发生本病，之后全国各地均有发生本病的报道，且呈逐年上升趋势，给鸡养殖业带来严重的危害。
近些年来，鸡新城疫、传染性支气管炎是较为常见的严重威胁家禽的2种重要疾病；而鸡群对I群4型禽腺病毒的感染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖户带来很多烦恼，而且多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激,还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所以需要筛选获得新的流行毒株来应对变异所造成的新的危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗，从而弥补现有技术的不足。
本发明的三联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽腺病毒；
其中鸡新城疫病毒优选为鸡新城疫病毒La Sota株；
其中传染性支气管炎病毒优选为传染性支气管炎病毒M41株；
禽腺病毒为I群4型禽腺病毒YBAV-4株，其保藏编号为CCTCC No.V201541。
上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；
本发明的灭活疫苗的制备方法如下：
1)油相制备：
取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80(Span-80)，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后完成油相制备；
2)水相制备：
将灭活的新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、I群禽腺病毒毒液混合；取混合抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；
其中新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、I群禽腺病毒的数量比优选为1:1:2；
3)乳化
取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟完成乳化制备。
本发明的疫苗所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID50效价高、免疫原性好并能抵御禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，三联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，三联苗和三种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。
具体实施方式
申请人筛选获得了一株新型变异的I群4型禽腺病毒，将该病毒与鸡新城疫病毒、传染性支气管炎一起来制备联合疫苗，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：YBAV-4株毒株的筛选
1、流行病学调查自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。2010年，发明人从山东淄博某养殖场有包涵体肝炎和心包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。
2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4℃过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量，经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，－20℃保存。
3、病毒的鉴定
3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5～10ml，反复洗3～5次，末次用生理盐水将血细胞泥稀释成0.8％、1％和2％浓度，4℃保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。
3.2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以5-溴尿嘧啶-2’-脱氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1h)处理后，接种鸡胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果：分离毒分别经BUDR、氢氧化钠(pH10)和60℃、1h处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60℃，1h可被灭活。而经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。
3.3血清学鉴定
3.3.1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37℃作用，24～48h观察是否出现凝集沉淀线。结果：分离毒抗原仅能与Ⅰ群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。
3.3.2型特异性鉴定Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准毒株、分离毒对Ⅰ群禽腺病毒1～12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结果：分离毒测4型标准阳性血清的中和效价(1:501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价(1:537)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下。表明分离株是血清4型。
3.4PCR检测及基因测序病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品进行Hexon基因测序，并进行遗传进化分析。根据Hexon基因序列比对和遗传进化分析结果可以看出，分离毒与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差异；与血清6型、7型、8a和8b型同源性更低。
该病毒株于2015年10月15日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.V201541。
实施例2：YBAV-4株毒种的制备
(一)鸡肝细胞最佳培养条件研究
1、细胞密度对细胞生长的影响将5种不同密度(1～5万个/ml，5～10万个/ml，10～15万个/ml，15～20万个/ml，20～25万个/ml)的鸡肝细胞分别接种同一批次的25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞工厂中，用同批次的DMEM营养液在同条件下培养，每个密度接种5瓶/2个，在同条件下培养、观察细胞长成致密单层所需时间及细胞的形态。
2、新生牛血清含量对细胞生长的影响用同一厂家生产的新生牛血清，分别按6％、8％、10％、12％的比例加入DMEM培养液中，培养同一批鸡肝细胞，细胞的终密度均为15～20万个/ml，每种血清浓度的营养液接种同一批次25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞工厂各5瓶/2个，观察细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。
3、胰酶对细胞生长的影响所用细胞消化液为0.02％EDTA-0.25％胰酶溶液，待细胞消化好后，一部分细胞培养容器倒去消化液加入营养液，另一部分细胞培养容器不弃去消化液直接加入营养液。营养液为pH值为7.0～7.2、含10％新生牛血清的DMEM营养液，细胞密度均为15～20万个/ml。接种同一批次25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞工厂各5瓶/2个，在同条件下培养、观察细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。
4、营养液pH值对细胞生长的影响其它条件均相同，仅营养液的pH值分别调整为6.8、7.0、7.2、7.4，不同pH值的营养液分别接种25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞工厂各5瓶/2个，观察营养液颜色变化、细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。
(二)I群4型禽腺病毒YBAV-4株最佳培养条件研究
1、最佳接毒剂量的确定分别在不同培养容器中以0.1％、0.5％、1％、2％、5％五个不同剂量的YBAV-4株病毒液接种鸡肝细胞，观察并记录出现细胞病变的时间及病变程度，当80％以上的细胞出现细胞病变(以下简称CPE)收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其病毒含量(TCID50)，以TCID50最高者的接毒剂量为最佳接毒剂量。
2、最佳接毒时间的确定以细胞在三种生长状态下繁殖YBAV-4株病毒液，当鸡肝细胞长成60～70％单层、长成70～80％单层和长成90％以上单层接种病毒，按1％的量接毒，37℃、5％CO2培养箱培养，当80％以上的细胞出现CPE时收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其TCID50，以TCID50最高者的接毒时间为最佳接毒时间。
3、最佳培养温度的确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，分别置于34℃、36℃、37℃、38℃培养，观察细胞病变出现的时间及病变程度，当80％细胞出现CPE时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其TCID50，以TCID50最高者的培养温度为最佳培养温度。
4、最佳收毒时间的确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，分别于37℃、5％CO2培养箱培养，当细胞出现70％、80％、90％左右CPE时收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其TCID50，以TCID50最高者的收毒时间为最佳收毒时间。
5、最佳维持液血清含量确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1％的量接种长成良好单层的鸡肝细胞，维持液中新生牛血清含量分别为1％、2％、3％，分别于37℃、5％CO2培养箱培养，观察细胞病变出现的时间，当80％细胞出现CPE时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其TCID50，以TCID50最高者的血清含量为最佳维持液血清含量。
6、验证试验根据上述的试验结果，我们选择最佳接毒方式、最佳接毒剂量、最佳接毒时间、最佳培养温度、最佳收毒时间制备了3批病毒液，将病毒液反复冻融2次后，测定病毒液的病毒含量。
实施例3：鸡新城疫、传染性支气管炎、禽腺病毒(Ⅰ群，4型)抗原的制备
1.Millipore超滤浓缩机使用，保养条件及使用方法，按厂家提供的使用说明进行。
2.浓缩效果检测
2.1浓缩抗原效检浓缩前留样测定浓缩前病毒液中抗原效价(HA和/EID50/TCID50)，浓缩过程中随时取样测定浓缩液抗原效价(HA)，确定浓缩倍数，浓缩后的浓缩液留样，测定浓缩液中抗原效价(HA和/EID50/TCID50)。
2.2滤出液抗原检测取浓缩即将结束时(此时浓缩液中抗原浓度最大，滤出液中漏出抗原的可能性最大)的滤出液，分别采用测定血凝价(HA)、接种SPF鸡胚(观察有无活病毒漏出)、接种SPF鸡(检测是否有抗原物质漏出)等途径检测漏出液中有无抗原成份。
2.3浓缩膜型号选择不同病毒抗原成份的大小不同，不同超滤膜的截留(过滤)孔径不同，因此选用不同孔径型号(1#、2#、3#、4#、5#)的超滤膜对不同病毒进行截留试验，并根据滤出液中抗原检测结果、浓缩效检结果及浓缩所需时间，分别确定浓缩三种病毒抗原所用最佳浓缩膜型号。
2.4浓缩效果稳定性试验用最佳型号浓缩膜浓缩NDV、IBV、FADV胚液各3批，检测浓缩效果的稳定性。
2.5浓缩倍数试验用最佳型号浓缩膜，将NDV、IBV、FADV胚液各浓缩至原体积的1/2、1/3、1/4、1/5，、测定不同浓缩倍数的EID50/TCID50，确定适宜浓缩倍数。
2.6浓缩成本分析根据浓缩时材料消耗，推算浓缩成本。
(一)毒(菌)种应达到所需标准：
使用鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎M41株、I群4型禽腺病毒YBAV-4株作为抗原毒种。
(二)抗原制备以及半成品检验：
1生产用毒种的制备
1.1鸡新城疫病毒La Sota株毒种制备：
将毒种用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释(如10-4或10-5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1％鸡红细胞凝集价不低于1:512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装于无菌瓶中，注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。
1.2IBV M41株生产用毒种制备
1.2.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释(如10-2)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活鸡胚的胚液，装于无菌容器内。将检验无菌且病毒含量≥106.0EID50/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌瓶中，注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。
1.3Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株毒种制备
1.3.1毒种繁殖挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种的维持液，置37℃培养36～48小时，当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。
2制苗材料的选择
2.1新城疫病毒、传染性支气管炎制苗材料发育良好的10～11日龄易感鸡胚(NDHI抗体均≤1:4；IB HI抗体≤3log2)。
2.2Ⅰ群禽腺病毒制苗材料鸡肝细胞。
3制苗用抗原液的制备
3.1新城疫病毒抗原
3.1.1接种取生产用毒种，用灭菌PBS作适当稀释(如10－4或10－5)，按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄鸡胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。
3.1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，孵育至96小时，全部取出，照胚，弃去死胚，将活胚气室向上直立，置2～8℃冷却12～24小时。
3.1.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚液。吸取胚液置于灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1:256者应弃去。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
3.1.4浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，随时抽样测定红细胞凝集价，当红细胞凝集价不低于1:1024时停止浓缩。留样，进行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
3.1.5灭活将病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置2～8℃保存，应不超过1个月。
3.2传染性支气管炎病毒抗原
3.2.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释(如10-2)，按《全自动接种机使用说明》要求，尿囊腔接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。
3.2.2孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每12小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。
3.2.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚液。吸取胚液放于灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥106.0EID50/0.1ml。同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。
3.2.4浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，留样，进行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
3.2.5灭活将IB病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。36～37℃灭活16小时后取出，留样，进行半成品检验，其余病毒液置2～8℃保存，应不超过1个月。
3.3I群禽腺病毒抗原
3.3.1细胞制备从液氮罐中取出冻存管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml培养液的离心管中，1000r/min离心5分钟。用含20％新生牛血清的培养液悬浮细胞，置37℃、5％CO2培养箱培养，当长成良好单层时用胰酶－EDTA消化细胞。
3.3.2抗原制备
3.3.2.1细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到细胞工厂中，37℃培养。
3.3.2.2接毒挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种的维持液，置37℃继续培养。
3.3.2.3观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获，冻融2次，取样进行半成品检验。－15℃保存，应不超过30日。
3.3.2.4浓缩将收获的毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩2～3倍，留样，进行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
3.3.2.5灭活将病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2％。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置2～8℃保存，应不超过1个月。
4半成品检验
4.1新城疫部分
4.1.1红细胞凝集价测定取灭活前的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行测定，其红细胞凝集价应不低于1:1024。
4.1.2病毒含量测定将灭活前取出的病毒液作10倍系列稀释，取10－7、10－8、10－93个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1m1，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。逐胚测定红细胞凝集价，不低于1:128者，判为感染，计算EID50。每0.1ml病毒含量应≥109.0EID50。
4.1.3无菌检验取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
4.1.4灭活检验取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，判为灭活完全。
4.2传染性支气管炎部分
4.2.1病毒含量将浓缩后灭活前的胚液进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-73个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日，无论死胚、活胚(接种后24小时内死亡者除外)均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、蜷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID50。每0.1ml病毒含量≥106.7EID50，方可用于制苗。
4.2.2无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
4.2.3灭活检验取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚。对所有鸡胚进行检验，应均不出现失水、蜷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象时，认为灭活完全。
4.3Ⅰ群禽腺病毒部分
4.3.1病毒含量测定取灭活前的病毒液进行测定，每0.1ml病毒含量应≥107.3TCID50。
4.3.2无菌检验取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
4.3.3灭活检验将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的鸡肝细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的鸡肝细胞作空白对照，37℃、5％CO2培养箱培养，观察120小时。细胞对照孔及样品孔均应不出现细胞病变。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，样品孔仍不出现细胞病变时，判定为灭活完全。
实施例4：疫苗的制备
1油相制备取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后备用。
2水相制备将灭活的新城疫病毒液、传染性支气管炎、I群禽腺病毒毒液以1:1:2比例混合。取混合抗原液95份，灭菌的吐温－805份，充分混匀，使吐温－80完全溶解。
3乳化取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30～40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。
(四)疫苗的安全试验
1.对靶动物各种接种途径的一次单剂量接种的安全试验
取1日龄SPF鸡分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批灭活苗，0.3ml/只；第2组肌肉注射1401批灭活苗，0.3ml/只；第3组肌肉注射生理盐水0.3ml/只作对照。取22日龄SPF鸡分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批灭活苗，0.5ml/只；第2组肌肉注射1401批灭活苗，0.5ml/只；第3组肌肉注射生理盐水0.5ml/只作对照，分别在隔离器内饲养，连续观察14日。结果颈部皮下注射和肌肉注射两种途径对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免后15日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗经两种注射途径对SPF鸡是安全的。
表1不同注射途径对SPF鸡的安全试验
注：“-”表示鸡只采食、饮水、粪便、精神均正常。
2.对靶动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次超剂量接种的安全试验
单剂量接种安全试验
取1日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1401批三联苗，0.3ml/只；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.3ml/只，隔离器内饲养，观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。取22日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第3组颈部皮下注射1401批三联苗，0.5ml/只；第4组颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只，隔离器内饲养，观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。结果见表2。
单剂量重复接种安全性试验
取1日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1401批三联苗，0.3ml/只，于免疫后14日再次同样剂量再接种1次；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.3ml/只，于注射后14日再次同样剂量再注射1次，隔离器内饲养，二免后再观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，二免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。取22日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第3组颈部皮下注射1402批三联苗，0.5ml/只，于免疫后14日再次同样剂量再接种1次；第4组颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只，于注射后14日再次同样剂量再注射1次，隔离器内饲养，二免后再观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，二免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。结果见表3。
表2结果表明，疫苗单剂量接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，免后15日解剖，注射局部均吸收良好，无肿胀，炎症等，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常。表3结果表明，疫苗二次接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，注射局部均吸收良好，无肿胀，炎症等。在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常。
表2 SPF鸡单剂量接种的安全试验
注：1、“-”表示鸡只采食、饮水、粪便、精神均正常；下同。2、免疫途径采用颈部皮下注射。
表3 SPF鸡单剂量重复接种的安全试验
一次超剂量接种安全性试验：
用1日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批三联苗，0.6ml/只，第2组颈部皮下注射1402批三联苗，0.6ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，0.6ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，0.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采食、饮水、免疫前及免后15日SPF鸡体重等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用7日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批三联苗，1.0ml/只，第2组胸部肌肉注射1402批三联苗，1.0ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，0.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采食、饮水、免疫前及免后15日SPF鸡体重等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用22日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组胸部肌肉注射1401批三联苗，1.0ml/只，第2组颈部皮下注射1402批三联苗，1.0ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，0.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采食、饮水、免疫前及免后15日SPF鸡体重等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用270日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批三联苗，1.0ml/只，第2组胸部肌肉注射1402批三联苗，1.0ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，1.0ml/只，隔离器内饲养，观察60日，记录临床症状、饮水、采食及产蛋率情况。
表4 1日龄SPF鸡一次超剂量接种的安全试验
表5 7日龄SPF鸡一次超剂量接种的安全试验
表6 22日龄SPF鸡一次超剂量接种的安全试验
表7 270日龄SPF产蛋鸡一次超剂量接种的安全试验
注：每组试验动物数为10只，注射剂量为1.0ml/只。
表4～7结果表明，疫苗一次超剂量接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起明显不良反应，疫苗注射组与对照组SPF鸡增重无太大变化，解剖观察，注射局部疫苗吸收良好，无肿胀，炎症等，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常。产蛋鸡试验结果表明，三联苗在产蛋期内免疫对产蛋期蛋鸡是安全的，产蛋率、体重基本不受影响。
(五)免疫期试验
用实验室试制的3批苗进行1日龄及22日龄SPF鸡的抗体消长规律和免疫持续期的研究。三联苗免疫1日龄SPF鸡，试验结果显示，NDV部分：免疫后21日、5个月内ND抗体均≥6.0log2，攻毒后10/10保护；免疫后6个月，抗体少数降至4log2以下，攻毒后5/10～6/10保护；而非免疫对照鸡攻毒后均5/5死亡。H9亚型AIV部分：免疫后21日、5个月内H9抗体≥8.0log2，攻毒后9/10以上病毒分离保护；免疫后6个月，抗体降至7.5log2以下，攻毒后9/10以上病毒分离保护；而非免疫对照鸡攻毒后病毒分离率均为9/10～10/10。禽腺病毒部分：免疫后7日少数鸡能检测出琼扩抗体，免后21日～6个月琼扩抗体均7/10及以上阳性，免疫后21日、5、6个月攻毒免疫组均达到8/10及以上保护；对照组攻毒后均8/10及以上发病。从以上结果来看，三联苗接种1日龄SPF鸡(0.3ml/只)后5个月内仍能够达到理想的保护效果。三联苗免疫22日龄SPF鸡，试验结果显示，疫苗免疫后7个月个别鸡抗体降至临界值水平。攻毒后免疫组产蛋率与正常对照组产蛋率差异不大，而攻毒对照组鸡产蛋率明显下降。由此可见，三联苗ND部分保护期可达7个月。从以上结果来看，三联苗接种22日龄SPF鸡(0.5ml/只)后7个月内仍能够达到理想的保护效果。考虑到饲养环境以及实际生产情况，为预防鸡新城疫、H9亚型禽流感、Ⅰ群4型禽腺病毒的发生，我们将免疫剂量及免疫期定为：3周龄及以内鸡，0.3ml/只，免疫期为4个月。3周龄以上鸡，0.5ml/只，免疫期为6个月。
表8 1日龄SPF鸡免疫期试验
而且，本发明的灭活疫苗对于YBAV-4株的攻毒的免疫效果明显好于市售的Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗，推测是由于YBAV-4株基因发生变异导致的。