技术领域
本发明涉及一种药物组合，是一种抗血小板聚集药物。
背景技术
血小板(blood platelet)是哺乳动物血液中的有形成分之一。形状 不规则，比红细胞和白细胞小得多，无细胞核，成年人血液中血小板数量 为100～300×1000000000个/L，它有质膜，没有细胞核结构，一般呈圆形， 体积小于红细胞和白细胞。血小板在长期内被看作是血液中的无功能的细 胞碎片。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定 的数量(如人的血小板数为每立方毫米10～30万)，在止血、伤口愈合、 炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。血 小板聚集率异常，导致血栓，危及生命。
目前常用的抗血小板药物有阿司匹林、氯吡格雷与普拉格雷、血小板 糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗药、双嘧达莫、PAF受体拮抗剂、凝血酶和凝血 因子Xa(FXa)抑制剂等。
阿司匹林在心脑血管疾病中广泛应用，尤其低剂量在预防动脉血栓中， 常用于心脑血管动脉血栓疾病的一、二级预防，小剂量阿司匹林理想的作 用于无核的血小板，从而形成对TXA2依赖的血小板聚集产生不可逆抑制。 是通过对分布于血小板中的环氧酶-1(COX-1)529位丝氨酸残基的乙酰化 不可逆抑制血栓素A2(TXA2)的合成。高剂量的阿司匹林则具有很强的副作 用，能直接抑制血管壁中的合成酶，减少前列环素的合成，不利于对TXA2作用的对抗和平衡，而且出现明显的胃肠不良反应，容易发生胃溃疡。但最 佳剂量一直在研究。据最新研究表明，剂量在30mg/d就可以发挥良好的 抗血小板聚集，而当大于81mg/d则增加不良反应，如胃肠道出血。在我 国，阿司匹林用于脑卒中二级预防推荐剂量为50～100mg/d，而用于预防 急性心肌梗死或经皮冠状动脉手术(PCI)治疗手术后，则口服300mg/d。
阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)对于阿司匹林抵抗的确切定义 尚无定论，但通过多方面报道可以发现目前有以下两种：①临床阿司匹林 抵抗(clinical aspirin resistance)，尽管给病人规律的推荐剂量的阿司匹林， 仍有冠心病、脑卒中或外周血管疾病的发生。②生化性阿司匹林抵抗 (biochemical aspirin resistance)，尽管给病人规律的推荐剂量的阿司匹林， 但通过血小板功能检测仍有持续血小板活化的现象。这些检测血小板功能 的方法包括：出血时间、尿血栓素B2(TXB2)检测、血小板膜P-选择素的表 达、血浆可溶性P-选择素、光学血小板聚集试验及PFA-100等。阿司匹林 抵抗率分布在一个5.0％～56.8％的较广范围。
氯吡格雷和普拉格雷都是P2Y12受体抑制剂，具有很强的选择性。两者 都是前药，需要细胞色素P450酶代谢之后，才能和P2Y12受体结合，发挥 抗血小板聚集的作用。
氯吡格雷是噻氯匹定(一种抗血小板聚集药，现已基本淘汰)的衍生物， 虽然氯吡格雷在心脑血管疾病中得到广泛应用，但其至少具有3个方面的 缺陷：一是滞后的作用表现；二是病人个体差异大；三是不可逆地强阻断。 除此之外，经两个阶段的细胞色素P450酶代谢时，与其他药物会形成相互 作用。普拉格雷是在2009年1月份，通过欧盟委员会的认证，被用于急性冠 状动脉综合征(ACS)和PCI延迟病人的抗栓药。和氯吡格雷一样，普拉格 雷也通过抑制ADP和血小板P2Y12受体结合，不可逆地阻断血小板聚集， 而其作用强度比氯吡格雷更强，更持久、快速。13608例ACS和PCI患者 随机、双盲分组治疗，证实普拉格雷容易出血(2.4％vs1.8％)，但相对有效。 临床用量一般在60mg的负荷剂量和10mg/d口服剂量。总的来说，普拉格 雷在治疗ACS患者时，显著地降低中风发病率，但增加出血风险，甚至是致命 的。
血小板GP IIb/IIIa受体和纤维蛋白原或vWF是血小板聚集的必经途 径，所以血小板GP IIb/IIIa受体拮抗药可以有效地抑制血小板聚集。现在 通过美国FDA的3种静脉注射血小板GP受体拮抗药是阿昔单抗、依替巴 肽、替罗非班，因其化学结构不同，作用机制有差别，适应证也不同。 GP IIb/IIIa受体拮抗剂的不良反应有出血和血小板减少症，没有证据表明重 复使用阿昔单抗、埃替非巴肽及替罗非班的潜在风险，而这在理论上可以 引起变态反应、对阿昔单抗的中和及血小板减少症。
双嘧达莫(dipyridamole，DPM)又名潘生丁(Persantin)，双嘧达莫主要通 过抑制磷酸二酯酶使血小板内环磷酸腺苷(cAMP)的含量增加从而抑制血 小板的活化。该类药物的缺点是化学稳定性差，半衰期短，必须加倍剂量 或者使用缓释剂才能在24h内起到抑制血小板功能的作用。副作用为头 痛、头晕、恶心和轻度胃肠不适，减量后可缓解。急性心肌梗死不宜使用。
PAF为目前报道中作用最强的低分子量血小板激活剂之一，在人和 兔的血小板上已发现亲和力很强的结合位点，受体激活可导致动脉栓塞、 急性炎症。其受体拮抗剂有贝帕泛、阿帕泛、E-5880、CV-3928、CV-6209、 WEB-2086、WEB-2170、RP-59227等，但来源困难、价格昂贵，在一定程 度上限制了研究。
水蛭素及其类似物等抗凝血酶制剂大多为多肽，为直接的凝血酶抑制 剂，临床主要用于预防PTCA术后冠状动脉再阻塞。其最主要的副作用是 出血，尤其是同肝素或其他抗血小板药物共同使用时，出血次数更多。
山茱萸是为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的成熟 果肉，根据《神农本草经》记载，主要用于治疗肝肾阴虚，头晕目眩、腰 酸耳鸣，随着对山茱萸的进一步研究，对山茱萸若干有效成分已经可以有 效的提取和分离，目前，在山茱萸若干有效成分中筛选出抗血小板的有效 成分，利用这些有效成分配伍组合成抗血小板药物，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前各种抗血小板药物存在的弊端或不足， 提供一种以多种中成药有效成分组合的抗血小板药物。
本发明的目的是这样实现的：一种抗血小板药物的组合物，包括药物 的有效组分和辅料，其中，药物的有效药组分为苹果酸、丁二酸和柠檬酸 组成，所述的有效组分的重量比例为苹果酸2-4份、丁二酸1-3份和柠檬 酸1-3份。其中最佳比例为苹果酸3份、丁二酸2份及柠檬酸2份。
在本发明中，所述的抗血小板聚集的物，其特征在于，用于治疗血小 板聚集引起的心脑血管血栓性疾病。
在本发明中，所述的辅料为用常用药用辅料，药物的剂型为片剂，或 丸剂，或悬浮剂，或胶囊。
本发明的优点在于：本药物是由山茱萸中的有机酸类化合物天然组成 比例，且为机体内三羧酸循环中所需的化合物，同时可作为食品添加剂来 应用；其安全性较其它单体药物要高，可在相当剂量下应用而不易产生不 良反应。同时，作为多成分组合类药物其作用明显优于其中任何一个单体 药物，获得更好的治疗效果。
具体实施方式
实施例1
苹果酸、丁二酸和柠檬酸的单体成分对家兔血小板聚集率的影响
动物：
大耳白家兔，雄性，体重2.0-2.5kg，由南京江宁县汤山青龙山动物 繁殖场提供，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2007-0008，实验动物使 用许可证：SYXK(苏)2005-0009(下同)。
药物：
苹果酸：ACROS ORGANICS公司，批号：A0269273
柠檬酸：南京化学试剂有限公司，批号：081245071
丁二酸：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：090812
试剂：
ADP：规格0.5g·瓶-1，上海伯奥生物科技有限公司，批号：990527 檬酸钠：AR，上海久亿化学试剂有限公司，批号20060801
盐酸普鲁卡因注射液：2ml:40mg，广州白云山明兴制药有限公司，批号： 060601
氯化钠注射液：南京小营制药有限公司，批号：2005090101
仪器：
LG-PABER型血小板聚集凝血因子分析仪，北京世帝科学仪器公司；
LDZ5-2离心机，北京医用离心机厂；
Sartorius BS110S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司。
实验方法
家兔体外血小板聚集的检测方法取大耳白家兔，利多卡因局部麻醉， 颈动脉插管放血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以800r·min-1离心10min， 分取上层富血小板血浆(PRP)，剩余部分以3000r·min-1离心10min，分取 贫血小板血浆(PPP)。聚集诱导剂用ADP(终浓度5.4μg·ml-1)。每管250 μl PRP中加入不同浓度的药物10μl，对照组PRP中加入等量的生理盐水， 37℃温育5min，然后加入诱导剂10μl，用PPP(加入与待测样本相同的 药物10μl)调零，空白组加入等量的生理盐水，用LG-PABER型血小板 聚集凝血因子分析仪测定血小板60s、300s及最大(max)聚集率，并按 下述公式计算药物对血小板聚集的抑制率，并计算相关方程及半数抑制浓 度(IC50)。
试验条件：
实验室温度为20～22℃。备有空调及通风排气设施。受试动物饲养于 中心实验室，动物单笼饲养，笼具下有不锈钢网格。饲以专用颗粒饲料， 由动物中心提供，自由饮水。
统计学方法
实验数据以表示；以SPSS16.0统计软件，均数间比较采用单因 素方差分析(one-way ANOVA)，q检验。
试验结果
苹果酸、丁二酸和柠檬酸单体成分体外给药均有不同程度降低ADP诱 导的家兔血小板聚集率的作用，并具有明显的量效关系：其中：苹果酸的 y＝0.9559x+0.0856，r＝0.9619，见表1；丁二酸的y＝1.4344x+0.1037，r＝0.9912， 见表2)、柠檬酸的y＝0.3958x+0.2104，r＝0.9233，见表3。
表1苹果酸体外给药对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响
表2丁二酸体外给药对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响
表3柠檬酸体外给药对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响
实施例2
本实施例根据实施例1中显著抗血小板聚集活性的3种药物，基于相 同动物家兔，做正交配比设计，得出最佳配比。
选取正交设计表L9(34)，做正交设计，分组寻求最优配伍
表4表头设计
得正交设计分组
表5试验设计表(mg/ml)
按表中剂量配制溶液，分组进行抗家兔血小板聚集实验，得出半数抑 制浓度(IC50)
表6正交设计直观分析表
由正交结果可知，最优配伍为：苹果酸∶丁二酸∶柠檬酸为3∶2∶2。
实施例3
将实施例1所述的苹果酸、丁二酸和柠檬酸按照3∶2∶2及其它不同比例 不同重量配伍后，按照实施1所示抗血小板聚集的活性检测方法，得出在相 同剂量下对ADP、PAF、凝血酶诱导的家兔血小板聚集的抑制作用均是3∶2∶2作用 最好，其它配比也较单一成分为好，差异均有显著性(P＜0.05，见表7～9)。
表7.组合物体外给药对ADP诱导的家兔血小板聚集的影响(n＝6)
注：与模型对照组比较@P＜0.05；与苹果酸组比较*p＜0.05；与丁二酸组比较&P＜0.05；与柠檬酸组 比较#p＜0.05(下同)。
表8.组合物体外给药对PAF诱导的家兔血小板聚集的影响(n＝6)
表9.组合物体外给药对凝血酶诱导的家兔血小板聚集的影响
实施例4
对大鼠颈动脉栓塞的影响
动物
SD大鼠，雄性，体重280-350g，清洁级，70只。由上海斯莱克动物 有限公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005；实验动物 使用许可证：SYXK(苏)2007-0030。
试验药物：以实施例3获得的抗血小板粉剂为试验药物(下同)
对比药物：阿司匹林肠溶片：25mg·片-1，南京百敬宇制药有限责任公 司，批号：091109
模型对照：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：国药集团化学试有限公司，批 号：F20051103
仪器：
BT87-3实验性体内血栓形成测定仪，包头医学院心血管研究室研制
实验方法
实验室温度为20～22℃。备有空调及通风排气设施。饲以专用颗粒饲 料，由动物中心提供，自由饮水。
试验前，将所述抗血小板粉剂以0.5％CMC-Na配成混悬液，其中G 组使用的混悬液中抗血小板粉剂的含量为28mg/ml，D组使用的混悬液 中抗血小板粉剂的含量为14mg/ml，苹果酸的含量为28mg/ml，丁二酸的 含量为28mg/ml，柠檬酸的含量为28mg/ml。
ASPL组使用的混悬液是将阿司匹林片研末，以0.5％CMC-Na配成混 悬液，混悬液中阿司匹林片的含量为1.2831mg/ml。
将SD大鼠随机分为4组：模型对照组、ASA组、G组、D组，各组 大鼠每12h灌胃给药一次，连续3d，其中，各组每次给药量分别为：模型 对照组给药量0.5％CMC-Na；ASPL组给药量0.012831g/kg；G组给药量 0.28g/kg；D组给药量0.14g/kg，苹果酸组给药量为0.28g/kg，丁二酸组给 药量为0.28g/kg，柠檬酸组给药量为0.28g/kg。
最后一次给药后将大鼠固定于鼠板，用钝性分离出大鼠的颈总动脉 (CCA)，以BT87-3实验性体内血栓形成测定仪的刺激电极直流电持续刺 激颈总动脉，刺激强度为2毫安×7分钟，引起血管内膜损伤，致使颈总动 脉内逐渐形成混合血栓，最后记录体内血栓形成的时间(s)。
统计学方法
实验数据以表示；以SPSS16.0统计软件，均数间比较采用单因 素方差分析(one-way ANOVA)，q检验。实验结果记录在表10中。
表10.本发明对大鼠颈动脉栓塞的影响(n＝10)
结果显示，G组、D组及ASPL组均能明显延长大鼠实验性体内动脉 血栓形成的时间，与模型对照组比较差异均有显著性(P＜0.01)，各单一 成分也有延长血栓形成时间的趋势，但与模型组比较差异无显著性。D、G 组作用明显优于单一成分组，差异也有显著性。
动、静脉血栓的形成均可导致血管栓塞疾病的发生甚至死亡。血小板 在血栓形成过程中起关键作用。当血管内皮损伤，血管壁基质暴露，血流 中的血小板受到基质中胶原的诱导，在vWF因子参与下，与内皮下组织 粘附，并向胞内传递活化信号，从而使血小板活化变形、释放。活化的血 小板膜表面表达GPIIb/IIIa，与纤维蛋白原相互联接而聚集，通过级联反应， 使血栓形成。本实施例通过直流电持续刺激血管，引起血管内膜的损伤， 致使血管内逐渐形成混合血栓，比较体内血栓形成时间，判断药物的阻止 血栓形成的作用。由实验结果可知，所述抗血小板粉剂二个剂量均有抑制 血栓形成的作用，与模型组比较有显著差异。
实施例5
对小鼠肺动脉血栓形成的影响
动物
ICR小鼠，雄性，体重18-22g，清洁级，70只。由上海斯莱克动物 有限公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005；实验动物 使用许可证：SYXK(苏)2007-0030。
试验药物：抗血小板粉剂。
对比药物：阿司匹林肠溶片：25mg·片-1，南京百敬宇制药有限责任公 司，批号：091109。
模型对照：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：国药集团化学试有限公司，批 号：F20051103。
仪器
机械秒表，上海秒表厂。
实验方法
实验室温度为20～22℃。备有空调及通风排气设施。饲以专用颗粒饲 料，由动物中心提供，自由饮水。
试验前，将所述抗血小板粉剂以0.5％CMC-Na配成混悬液，其中G 组使用的混悬液中抗血小板粉剂的含量为20mg/ml，D组使用的混悬液中 抗血小板粉剂的含量为10mg/ml，。
ASA组使用的混悬液是将阿司匹林片研末，以0.5％CMC-Na配成混 悬液，混悬液中阿司匹林片的含量为0.9165mg/ml。
混合致栓剂的配制(使用前临时配制)：
取已分装的ADP(二磷酸腺苷)储备液0.2ml(浓度为740μg/ml)， 加入盐酸肾上腺素注射液(1mg·ml-1)0.67ml，加生理盐水至10ml。
将ICR小鼠随机分为4组：模型对照组、ASA组、G组、D组，各组 大鼠每12h灌胃给药一次，连续3d，其中，各组每次给药量分别为：模型 对照组给药量0.5％CMC-Na；ASA组给药量0.01833g/kg；G组给药量 0.4g/kg；D组给药量0.2g/kg；苹果酸组给药量为0.4g/kg，丁二酸组给药 量为0.4g/kg，柠檬酸组给药量为0.4g/kg。
造模方法与观察指标
参考文献(李圣青，张艰，戚好文等.小鼠肺栓塞模型的诱导及比较[J].第 四军医大学学报.2004，25(15)：1379-1381.)方法，于末次给药1h后，各组 ICR小鼠尾静脉注射混合致栓剂0.075ml·10g-1体重(相当于ADP1.1μg·10 g-1，肾上腺素5μg·10g-1)，观察小鼠给予致栓剂后的表现，如跳跃、蹬腿、 呼吸急促、不能自主活动趴伏等现象，记录小鼠恢复自主活动的时间，其 中≥15min未恢复活动者按15min计算。
统计学方法
实验数据以表示；以SPSS16.0统计软件，均数间比较采用单因 素方差分析(one-way ANOVA)，q检验。实验结果见表11
表11本发明对小鼠肺动脉血栓形成的影响(n＝10)
结果显示，在各单体药物及其配伍方中，G、D组、ASA组、苹果酸 及丁二酸均能明显缩短小鼠肺栓塞的恢复时间，与模型对照组比较差异均 有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，柠檬酸组仅有缩短肺栓塞恢复时间的趋势， 与模型组比较差异无显著性。
血栓性疾病是当前危害人类健康的主要疾病之一，其形成是许多疾病 发病机制中涉及的一种重要病理过程，血小板在血栓形成中起到重要作 用。小鼠肺动脉栓塞模型是研究抗血栓药物的的常用模型，广泛的应用于 抗血栓药物的筛选，抗血小板药物治疗在防栓、抗栓中是不可或缺的环节。 本实施例通过此模型来研究本发明的不同浓度组对抗血栓作用。在本实施 例中，当小鼠尾静脉给予混合致栓剂后，各组动物均表现出肺栓塞症状， 如跳跃、蹬腿、呼吸急促、口鼻出血、不能自主活动、趴伏甚至死亡等现 象；致栓后的恢复时间反应了栓塞的严重程度，恢复时间越长，说明栓塞 越严重。实验结果表明，高剂量、低剂量均可明显缩短小鼠肺栓塞恢复时 间，较模型组比较差异有显著性。
实施例6
抗血小板聚集胶囊剂
苹果酸、丁二酸和柠檬酸按照重量3∶2∶2比例组成，并加入适量淀粉， 碾磨成细粉，混合均匀，过筛，再与用乙醇适量溶解的苹果酸、丁二酸和 柠檬酸混合，制粒，烘干，装入胶囊。
以上各实施例不是对本发明的限制，具体实施时，本领域的普通技术 人员可以利用常用药用辅料，通过传统的工艺配后制成片剂，或丸剂，或 悬浮剂。