技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及丁基苯酞及其衍生物在制备预防和 治疗ALS的药物中的应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又称Charcot 病或Lou Gehrig病，是一种致命性的运动神经元变性疾病。ALS的全 球发病率是5～7/10万，好发年龄40～60岁，男女发病比率是1.4～2.5∶ 1。以肌肉无力、肌束颤动以及肌肉萎缩为主要临床表现，该病会影响 咽喉部肌肉，使患者出现言语和吞咽困难；亦可累及呼吸肌，导致呼 吸困难而死亡。该病起病隐袭，逐渐进展，平均生存期约为3～5年， 最终多因呼吸衰竭而死亡，给国家、社会和家庭都带来了沉重的负担。
ALS的主要病理表现为：脊髓前角细胞、脑干后组运动神经核、 大脑皮质运动区锥体细胞变性、数量减少，胶质细胞增生。脊髓前根 和脑干运动神经轴突变性和继发脱髓鞘，导致失神经支配和肌萎缩。 在疾病发作时脊髓星形胶质细胞肥大增生和小胶质细胞活化。肌电图 检查对诊断该病很有价值。常规肌电图呈典型神经源性改变。静息状 态下可见纤颤电位、正锐波，有时可见束颤电位；小力收缩时运动单 位电位时限增宽、波幅增大、多相波增加，大力收缩呈现单纯相。早 期复合肌肉动作电位(CMAP)正常，随着病程进展，肌肉萎缩加重， CMAP下降甚至测不出。CMAP下降反应了有功能的运动单位的减少。 在疾病早期或缓慢进展者，虽已有运动神经元丢失，但由于侧支芽生 的再支配作用，可无复合肌肉动作电位波幅下降；但当运动神经元丢 失速度超过再支配速度时，就出现了复合肌肉动作电位波幅下降。疾 病晚期，运动神经元大量丢失，复合肌肉动作电位波幅可降至极低甚 至无法测出。运动单位数目估计(MUNE)是一种定量测定支配某 一骨骼肌或肌群的有功能的下运动神经元数目的电生理技术。在ALS 患者，统计法MUNE测定表现为运动单位数目明显减少。
ALS的发病机制尚不明确，可能涉及兴奋性氨基酸毒性作用、神 经营养因子的缺失和异常、氧化应激和线粒体功能障碍、凋亡、神经 炎性反应、蛋白聚集、非运动神经元作用等方面。炎症在铜/锌超氧化 物岐化酶1(SOD1)介导的运动神经元变性中的作用成为近来研究热 点。随着SOD1小鼠临床症状发作后，在脊髓中出现大量活化的小胶质 细胞和星形胶质细胞，胶质细胞中表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和 磷酸酯酶A2、COX-2等。炎症反应强度的增加与疾病的进展是一致的， 抑制小胶质细胞激活的药物如minocycline和COX-2抑制剂能延迟 SOD1小鼠的发病和病情进展。
目前对ALS的有效性治疗方面并没有取得突破。力如太是美国食 品和药物管理局(FDA)批准的唯一用于治疗ALS的药物。其可能机 制有：阻滞NMDA受体，稳定失活的电压依赖性钠通道，抑制突触前 谷氨酸的释放，促进细胞外谷氨酸的摄取。力如太对体外培养的运动 神经元和SOD1转基因小鼠都有神经保护作用。力如太仅能延缓患者 平均的生存期2～3个月。人们期望能够将神经营养因子应用于ALS 的治疗，然而神经营养因子的临床试验结果是令人失望的。其它的如 抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎性药物、免疫调节剂等只是在动物实验或 临床试验阶段。目前尚无有效的预防或治疗ALS疾病的药物。
丁基苯酞(3-n-butylphathlide，NBP)其化学名称为消旋-3-正丁基苯 酞，商品名恩必普(NBP)，又名芹菜甲素，是从芹菜籽中分离出来的一 种有效成分。其分子式：C12H14O2，分子量：190.24，结构式如下：
丁基苯酞对急性缺血性脑卒中的中枢神经功能的损伤有改善作 用，其药效学作用如下：(1)具有明显缩小大鼠局部脑缺血脑梗塞面积， 改善神经功能缺失作用；(2)能改善小鼠完全脑缺血的脑能量代谢；(3) 改善局部脑缺血引起的脑水肿；(4)对缺血区局部脑血流和软脑膜微循 环有明显改善作用；(5)抗血栓作用；(6)能显著改善局部脑缺血引起的 记忆障碍；(7)对脑卒中易感性自发性高血压大鼠的脑卒中具有预防和 治疗作用。
丁基苯酞还具有改善线粒体功能，抗氧自由基，降低细胞内钙水 平以及抑制细胞凋亡等作用。中国专利CN03137457.3公开了左旋正丁 基苯酞的预防和治疗痴呆的用途；中国专利CN200480029409.0公开了 左旋丁基苯酞在制备预防和治疗脑梗塞的药物中的应用；氨丁苯酞对 血小板聚集功能的影响(参见马轶涛，中国药理学通报2000Feb；16 (1)：72～4)。中国专利CN201010033365.6公开了丁基苯酞及其衍生 物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗 ALS的药物中的应用。
所述丁基苯酞包括消旋丁基苯酞或左旋丁基苯酞。
所述衍生物在体内代谢为消旋丁基苯酞或左旋丁基苯酞。
发明专利CN101337891A公开了根据前药原理，结构式如式I的 化合物在体内能释放NO和丁基苯酞，所述化合物结构式如下：
其中A为C2-C8烷基、C2-C8烯烃基、C2-C8烯烃基、苯基或取代苯基、 芳杂环或取代芳杂环；所述取代苯基被1个或多个选自于羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-CH＝CHCOO(CH2)n，n＝2-6取代的苯基，各取 代基可以相同或不同；所述芳杂环为1至4个杂原子的5至7元芳香环， 所述杂原子独立的选自O、S或N；所述取代芳杂环可任选被1个或多个 选自于C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤素取代，各取代基可以相同或不同；
R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、 N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰 基哌嗪。
因此，所述化合物在体内代谢为丁基苯酞，也必然具有防治ALS 的效果。
作为优选，R为吗啉基；A为n＝3，所 述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2- (4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为哌啶基；A为n＝3，所 述衍生物为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2- (4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为n＝3， 所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基 -4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为n＝3，所 述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧 丁氧羰基)乙烯基]苯酯。
作为优选，R为吗啉基；A为n＝3，所述 衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧 羰基)乙烯基]苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-二乙胺 基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为吗啉基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-吗啉基 乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为哌啶基；A为C4烷基时，所述衍生物为[2-(1-哌啶 基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述 衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)] 苯酯。
作为优选，R为哌啶基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述衍 生物即为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)] 苯酯。
作为优选，R为吗啉基；A为苯环上间位取代基为C2烷基，所述衍生 物即为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯 酯。
因此，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲 氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧) 正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2- (1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰 基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4- 硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸 -4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊 基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4- 硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、 [2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2- (1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯或[2-(1- 吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯时，其在体内 代谢为丁基苯酞，具有预防和治疗ALS的效果。
李江、王晓良等公开了消旋2一(a-羟基戊基)苯甲酸钾盐在体内具 有与消旋丁基苯酞一致的组织分部与代谢特征，(参见dl-PHPB的体内 外转化及药代动力学研究，中国药理通讯2007年第二十四卷第三期， 50-51)。CN1234541C公开了2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐在防治心脑血管 疾病方面具有与丁基苯酞相似的药理作用，根据化药药物代谢动力学， 本领域人员可以合理预期，结构式如式II所示的2一(a-羟基戊基)苯甲 酸盐在体内均可离解为丁基苯酞，也必然具有防治ALS的效果。
更优选地，所述衍生物为2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐，结构式如式 II所示：
其中，M为一价金属离子或是二价金属离子，n＝2或n＝3。
作为优选，2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐中所述M为钾离子、钠离子、 锂离子、钙离子、镁离子或锌离子。
经动物试验证实，本发明所述丁基苯酞及其衍生物可延缓SOD1- G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，减少了脊髓运动神经 元退行性病变，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多， 还可减少转基因鼠电生理的异常，复合肌肉动作电位波幅和运动单位 数目均明显改善，小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到了 显著的抑制，明显降低了iNOS、NF-κBp65的表达水平，可用于制备预 防和治疗肌萎缩侧索硬化的药物，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠对生存期的影响；
图2示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠体重的影响；
图3示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠转棒实验潜伏期的影响；
图4示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠悬线实验潜伏期的影响；
图5示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠脊髓小胶质细胞激活的影 响；
图6示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠脊髓星形胶质细胞激活的 影响；
图7示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠iNOS、NF-κBp65蛋白表 达的影响；
图8示消旋丁基苯酞对ALS模型鼠发病时间的影响；
图9示左旋丁基苯酞对ALS模型鼠发病期的影响；
图10示左旋丁基苯酞对ALS模型鼠生存期的影响。
具体实施方式：
本发明公开了丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗ALS病的药 物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数 实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经 通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
按照本发明，实施例公开消旋丁基苯酞和左旋丁基苯酞制备预防 和治疗ALS病的药物中的应用，本领域技术人员根据现有技术及药理 学原理，合理预期在体内代谢为消旋或左旋丁基苯酞的衍生物具有预 防和治疗ALS的效果。
所述衍生物包括结构式如式I所示：
其中A为C2-C8烷基、C2-C8烯烃基、C2-C8烯烃基、苯基或取代苯基、 芳杂环或取代芳杂环；所述取代苯基被1个或多个选自于羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-CH＝CHCOO(CH2)n，n＝2-6取代的苯基，各取 代基可以相同或不同；所述芳杂环为1至4个杂原子的5至7元芳香环， 所述杂原子独立的选自O、S或N；所述取代芳杂环可任选被1个或多个 选自于C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤素取代，各取代基可以相同或不同；
R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、 N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰 基哌嗪。
以及结构式如式II所示的化合物：
其中，M为一价金属离子或是二价金属离子，n＝2或n＝3。
作为优选，所述M为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子、镁离子 或锌离子。
所述衍生物包括2一(a-羟基戊基)苯甲酸钾盐、[2-(1-吗啉基乙酰 氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯 酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁 氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{ 2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙 酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1- 吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、 [2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉 基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正 戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸 -[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2- 硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧 乙基)]苯酯。
本发明提供的丁基苯酞及其衍生物可以延缓SOD1-G93A转基因 小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，减少脊髓运动神经元退行性病变， 使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多，还可减少转基因 鼠电生理的异常，复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目均明显改善， 小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到了显著的抑制，明显 降低了iNOS、NF-κBp65的表达水平，可有效预防和治疗肌萎缩侧索 硬化。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：ALS转基因鼠的鉴定
目前广泛应用临床和基础研究的ALS转基因鼠是SOD1-G93A小 鼠，它携带能表达人G93A(氨基酸链上第93位甘氨酸被丙氨酸替代) 错义突变的SOD1基因，能模拟ALS慢性进展性的病程以及部分病理 和生化表现。SOD1-G93A小鼠的主要特征：大约3-4个月出现后肢无 力，悬尾时后肢震颤及外展无力，2周后小鼠1个或2个肢体瘫痪，逐 渐出现毛发粗糙，消瘦，5个月后运动不能，最终因呼吸衰竭而死亡。
本发明所述ALS转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur，编 号002726)购自美国Jackson Laboratory(Barharbor，ME，U.S.A)。
1.1子代鼠的鉴定
①DNA提取：剪取子代鼠的尾尖约2mm，置于一EP管中，加入 150ul 50mM的NaOH，95℃孵育30分钟，涡漩使鼠尾尖充分消化后，加 入12.5ul 1M Tris-HCL(PH＝8.0)，再涡旋，10,000rpm离心2分钟。基 因组DNA即在上清液中。
②PCR反应：基因扩增条件为：95℃3min，然后95℃45S，60℃30s， (35个循环)，72℃延伸5min。
③PCR产物分析：吸取10ul PCR产物，在2％琼脂糖凝胶上电泳， 80V，45min，用全自动凝胶成像系统拍摄，上海英维俊生物公司进行 产物的纯化和测序。
1.2ALS转基因鼠的表型特征：ALS鼠3个月左右逐渐出现悬尾肢体 震颤，后肢无力，进行加重的爬行时步态不稳，摇摆，单侧或双侧肢 体瘫痪，直至双后肢僵直不能爬行和自主进食。
1.3动物分组和给药(治疗给药)
1、消旋丁基苯酞组：分3个剂量(30mg/kg，60mg/kg，120mg/kg) SOD1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
2、溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同体积的 花生油灌胃；
3、正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予 同体积的花生油灌胃。
实施例2：观察消旋丁基苯酞对ALS小鼠发病时间和生存期、运 动功能的影响
每天观察所有SOD1-G93A转基因鼠的精神状态、病情进展、存活 情况。发病的评判：连续2天观察出现肢体震颤和(或)肢体无力即 判为发病死亡时间：将鼠置为仰卧位，30秒内不能翻身为俯卧位即判 断死亡。
转棒实验：转棒实验可以评价运动的协调性、力量和平衡能力。 实验鼠放置于直径3.5cm的转棒仪上，转速调至16rpm，记录坠落的最 长潜伏期，以180秒为分界值，超过180秒按180秒记录，不足180 秒按实际时间记录。小鼠运动能力的评测从70天开始，小鼠先8rpm 练习5天使之习惯运动并获得一个基础运动值。每次实验重复3次并 取其最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬线实验：主要评价小鼠的抓握力量。将实验鼠置于传统用的鼠 笼盖上，轻轻震动鼠笼盖促使实验鼠紧握鼠笼盖，随后迅速翻转鼠笼 盖，记录后肢离开笼盖的最长潜伏期，以90秒为分界值，超过90秒 按90秒记录，不足90秒按实际时间记录。每次实验重复3次并取其 最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬尾实验：悬吊鼠尾，观察后肢的伸展及其弯腰情况，并予评分 ——2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。
本发明人通过检测发病晚期小鼠的翻正反射确定小鼠的临床死亡 时间，经统计分析发现，60mg/kg消旋丁基苯酞组小鼠的平均生存期 比溶剂对照组延长了20天，30mg/kg和120mg/kg消旋丁基苯酞组小 鼠的平均生存期比溶剂对照组未见有明显改变见图1。以上结果说明， 消旋丁基苯酞延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存 期。
本发明人采用了Rotarod转棒仪、悬线实验、悬尾实验来检测小 鼠的运动功能。ALS小鼠发病3周体重明显下降，消旋丁基苯酞 60mg/kg组小鼠体重的降低被延缓，见图2。野生型小鼠始终能在最好 的水平完成转棒和悬线实验。ALS小鼠发病后转棒实验和悬线实验的 潜伏期逐渐缩短，在发病5周左右不能维持实验，而消旋丁基苯酞 60mg/kg组小鼠运动功能评分的减低被延缓(见图3，图4)。
实施例3：ALS转基因鼠的电生理学检测
自发电位：实验鼠经10％水合氯醛麻醉，同心针电极插入后肢腓肠 肌肌腹中，观察有无纤颤电位和(或)正锐波。
复合肌肉动作电位(CMAP)的记录：实验鼠经10％水合氯醛麻醉， 刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后肢腓肠肌肌腹中。给予超强 刺激，得CMAP并记录，测量峰峰值表示CMAP波幅，并记录远端运动 潜伏期(DML)。
运动单位数量(MUNE)评估：参照“统计学方法技术”的原理，实 验鼠经10％水合氯醛麻醉，刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后 肢腓肠肌肌腹中。调整电极位置，以最小刺激强度获得最大复合肌肉 动作电位(CMAP)；并获得刺激反应功能曲线，保证起始部分和终止部 分所包含的2～4个反应点位于同一水平，根据刺激反应功能曲线确定 采样区间。首先选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距最大的部分， 作为第1个采样区间；选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距次大的 部分，作为第2个采样区间；选择曲线上相邻2个反应点间波幅差距， 第3大的部分，作为第3个采样区间；最后选择曲线中相邻2个反应点 间波幅差距最小的部分；作为第4个采样区间。调整刺激强度，使所 获得的反应点均落于采样区间内，然后进行采样，采样时保证同一采 样区间内至少存在连续且规律出现的两种类型的反应点，否则应扩大 采样区间的范围，直至满足采样条件。同一采样区间可重复采样2～10 次结束某一采样区间采样的条件为：所得运动单位电位波幅的标准差 小于均数的10％，采样点直方图近似正态分布或略呈负性偏态分布。 结束某一采样区间的采样后，可获得该区间的采样范围和运动单位数 目估计测值。重复上述采样步骤，对下一个选定的采样区间进行检测， 直至完成全部4个采样区间的采样最终获得复合肌肉动作电位波幅和 运动单位数目。
复合肌肉动作电位(CMAP)波幅的大小主要反应了周围神经轴索 的功能。运动单位数目的估计(MUNE)反应了有功能的运动单位的 多少。
结果发现与正常对照组的小鼠比较ALS转基因鼠均有正锐波和纤 颤电位，CMAP波幅(24.3±0.30mv vs 12.8±7.15mv)和 MUNE(135.8±8.64vs 63.2±31.87)均明显下降。60mg/kg消旋丁基苯酞 组较溶剂对照组的CMAP波幅(18.2±7.27mv vs 12.8±7.15mv， p＜0.05)明显改善，见表1。MUNE(110.5±9.68vs 63.2±31.87p＜0.05) 明显改善，见表2。*P＜0.01，#P＜0.05。
表1复合肌肉动作波幅
*与正常对照组比较P＜0.05
表2运动单位数目
*与正常对照组比较P＜0.05
实施例4：ALS鼠腰段脊髓前角的病理学检测：脊髓组织学和运 动神经元计数
导致SOD1-G93A转基因小鼠发生疾病的直接因素为脊髓前角运 动神经元退行性变。尼氏染色可以表示出运动神经元的胞体及其胞核 的状态。本发明人采用尼氏染色方法观察了小鼠脊髓前角神经元。
实验鼠10％水合氯醛深度麻醉后，用4℃生理盐水进行心脏灌注 后，一部分脊髓(L4～L5段)用于组织病理学分析和免疫组化分析。 脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用10％，20％， 30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。另一部分脊髓(C1～L3段)用 于western blot检测，其取出后迅速置于液氮中，～80℃冰箱保存。脊 髓L4～L5段经上述处理后，石蜡包埋，脊髓连续切片的厚度为6μm， 切片贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上。为了计数运动神经元，脊髓 L4-L5段连续切片200张，每7张取1张做尼氏染色。处理好的切片用 显微镜明视野拍照后，计数。
计数的标准：计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中 央管以上的部分；运动神经元的直径在20μm以上；运动神经元有明显 的细胞核。
Nissl染色的具体步骤如下：
(1)二甲苯脱蜡10min×2次；
(2)依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精
(3)蒸馏水冲洗5min×1次；
(4)切片入焦油紫工作液染色30分钟；
(5)切片入蒸馏水洗去浮色；
(6)切片入70％酒精、80％酒精、95％酒精分色；1分钟；镜下观 察尼氏体颗粒清晰。
(7)切片入特殊分色液中退背景；100％酒精∶乙醚∶氯仿＝1∶1∶ 1
(8)切片入无水酒精脱水，二甲苯I、二甲苯II透明，中性树胶封 片。
通过对各组转基因小鼠脊髓((L4～L5段)组织切片，尼氏染色， 显微镜观察和计数，发现与正常对照组小鼠对比，发病中期 SOD1-G93A转基因小鼠脊髓前角运动神经元数目明显下降(8.5±2.92 vs 28.5±6.36野生型P＝0.000)，而60mg/kg消旋丁基苯酞组可以有 效保护脊髓前角运动神经元，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数 目明显增多(16.8±2.64vs 8.5±2.92，P＝0.002)，30mg/kg组无明显的 保护脊髓前角运动神经元的作用(8.6±2.92vs 8.5±2.92， P＞0.05)，120mg/kg组也没有观察到明显的保护脊髓前角运动神经元的 作用(8.5±0.87vs 8.5±2.92，P＞0.05)，结果见表3。说明消旋丁基苯酞 减少了脊髓运动神经元退行性病变。
表3运动神经元计数
*与正常对照组比较P＜0.01
形态学、组织学观察结果显示：SOD1-G93A转基因小鼠的发病症 状与ALS患者的临床表现十分相似，表现为渐进性的肌无力，肌萎缩， 直至瘫痪和死亡，病理改变时脊髓前角运动神经元选择性丢失。转基 因鼠发病后逐渐出现双侧后肢的无力、瘫痪以致萎缩，60mg/kg消旋 丁基苯酞组小鼠病理改变一定程度改善。
实施例5：消旋丁基苯酞对ALS转基因小鼠神经保护作用的机制
炎症反应在ALS病情的发生和发展中扮演重要的角色，胶质细胞 的激活是SOD1-G93A转基因小鼠体内炎症反应的检测指标之一。本发 明人使用CD11b和GFAP作为标记分别观察了转基因小鼠脊髓前角小 胶质细胞和星形胶质细胞的形态。
本发明分别用CD11b和GFAP来检测脊髓切片(L4～L5段)来评 估小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况，研究消旋丁基苯酞对SOD1- G93A转基因鼠胶质细胞激活的影响。
免荧光染色的具体步骤如下：
(1)二甲苯脱蜡10min×2次；
(2)依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精
(3)蒸馏水冲洗5min×1次；
(4)抗原修复：枸橼酸盐缓冲液(pH＝6.0)高压修复
(5)冷却至室温，蒸馏水冲洗2min×3次，甩干；
(6)3％过氧化氢室温孵育10min，甩干；
(7)0.01mmol/LPBS冲洗5min×3次；
(8)置于湿盒中，荧光笔画圈，3％胎牛血清室温孵育10min，倾去 血清，勿洗；
(9)加入一抗GFAP(1∶800)，CD11b(1∶100)30μl 4℃过夜，阴性对 照加入抗体稀释液；
(10)取出湿盒，室温中静置30min，使其恢复室温；0.01mmol/LPBS 冲洗5min×3次；
(11)分别滴加FITC标记的山羊抗大鼠IgG(1∶100)，TRITC标记的 山羊抗兔IgG(1∶100)室温孵育60分钟，PBS洗涤5min×3；
(12)甘油缓冲液封片后，荧光显微镜下观察。
结果发现，在野生型小鼠，小胶质细胞为分枝状，细胞体较小， 显示为静息状态的小胶质细胞。在ALS小鼠，小胶质细胞CDllb表达 增强，细胞突起增粗、缩短，并向病变神经元迁移，在运动神经元周 围则呈圆形的巨噬细胞样形态，显示为充分活化的小胶质细胞。与溶 剂对照组相比，消旋丁基苯酞60mg/kg能够明显减轻小胶质细胞的活 化。另外，GFAP免疫荧光染色显示ALS小鼠星形胶质细胞免疫学标 志GFAP上调，细胞增大。与溶剂对照组相比，消旋丁基苯酞60mg/kg 能够明显减轻星形胶质细胞反应。说明消旋丁基苯酞抑制了转基因小 鼠脊髓胶质细胞的激活。统计结果见图5和图6，*P＜0.01。
实施例6：消旋丁基苯酞对SOD1-G93A转基因鼠iNOS、 NF-κBp65蛋白表达的影响
炎症在ALS的发生和发展中起了非常重要的作用。本发明采用 western blot检测了炎症相关指标iNOS、NF-κBp65蛋白的表达。
脊髓(C1～L3段)标本从～80℃冰箱中取出后，置于RIPA裂解 液中，超声破碎1分钟，12000rpm，4℃离心，15分钟，取上清。分装 后保存于-80℃冰箱备用。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液，硝酸纤维 素膜室温封闭1小时。一抗(iNOS、NF-κBp65)4℃孵育过夜。二抗， 室温孵育1小时。采用化学发光法显影，拍照。
结果发现，与野生型小鼠相比转基因小鼠iNOS、NF-κBp65的水 平明显升高。消旋丁基苯酞60mg/kg明显降低了iNOS、NF-κBp65的 水平，见图7，统计结果显示其差异具有显著性。说明消旋丁基苯酞抑 制了ALS转基因小鼠脊髓炎症相关蛋白的水平，减少炎症的发生。
实施例7：消旋丁基苯酞对ALS转基因鼠发病时间的影响
参照实验例1对实验动物分组(预防给药)，实验鼠分为：
1.消旋丁基苯酞组：剂量(60mg/kg)
SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始每天灌胃给药，直至死亡；
2.溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始予同体积的花 生油灌胃；
3.正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄42天即开始予 同体积的花生油灌胃。
ALS鼠发病和死亡的判断标准参照实施例2。
结果发现，消旋丁基苯酞60mg/kg组小鼠比溶剂对照组小鼠平均 的发病时间延缓了15天(113.5±13.71vs 98±8.72)。见图8。
实施例8：左旋丁基苯酞对ALS转基因鼠生存期和发病时间的影响
参照实施例1对实验动物分组(预防给药)，实验鼠分为：
左旋丁基苯酞组：剂量30mg/kg，SOD1-G93A阳性鼠日龄42 目即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始予同体积的花 生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄42天即开始予同 体积的花生油灌胃。
ALS鼠发病和死亡的判断标准参照实施例2。
参照实施例4，采用了Rotarod转棒仪、悬线实验、悬尾实验来检 测小鼠的运动功能，发现左旋丁基苯酞30mg/kg组小鼠比溶剂对照小鼠 延缓发病时间17天(100.2±5.52VS 117.1±12.57)见图9，延长生存期21 天(157.9±4.81VS 178.8±12.29)，见图10。
以上结果说明，左旋丁基苯酞也可延缓SOD1-G93A转基因小鼠的 发病时间，延长小鼠生存期，与消旋丁基苯酞具有相似的药理作用。
实施例9：左旋丁基苯酞对ALS转基因鼠电生理学检测的影响
参照实施例3的方法，对各组进行复合肌肉动作电位(CMAP)的 记录以及运动单位数量(MUNE)评估，结果见表4和表5。
表4复合肌肉动作电位
*与对照组比较P＜0.05
表5运动单位数目估计
*与对照组比较P＜0.05
实施例10：左旋丁基苯酞对ALS鼠腰段脊髓前角运动神经元计数 的影响
参照实施例4，实验鼠10％水合氯醛深度麻醉后，用4℃生理盐水 进行心脏灌注后，一部分脊髓(L4～L5段)用于组织病理学分析和免 疫组化分析。脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用 10％，20％，30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。再依次入30％、50％、 70％酒精处理24小时脊髓L4～L5段经上述处理后，石蜡包埋，脊髓 连续切片的厚度为6μm，切片贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上。为了 计数运动神经元，脊髓L4-L5段连续切片200张，每7张取1张做尼 氏染色。处理好的切片用显微镜明视野拍照后，计数。
计数的标准：计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中 央管以上的部分；运动神经元的直径在20μm以上；运动神经元有明显 的细胞核，结果见表6，说明左旋丁基苯酞减少了脊髓运动神经元退行 性病变。
表6运动神经元计数
*与对照组比较P＜0.01
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出 若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。