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1、(10)申请公布号 CN 102397236 A (43)申请公布日 2012.04.04 CN 102397236 A *CN102397236A* (21)申请号 201010283979.X (22)申请日 2010.09.16 A61K 9/00(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/38(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 31/4745(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 同济大学 地址 200。
2、092 上海市杨浦区四平路 1239 号 (72)发明人 李永勇 温惠云 董海青 徐梦 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 林君如 (54) 发明名称 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制 备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种壳层可脱落的聚合物胶束药 物载体的制备方法， 此药物载体是一种由二硫键 桥连的两亲性共聚物， 二硫键可在细胞内的还原 环境下快速裂解， 实现壳层可脱落智能释放药物 的功能， 该两亲性共聚物在水中会快速自组装成 胶束纳米粒子和装载药物。 与现有技术相比， 本发 明在高谷胱甘肽浓度下药物释放速率比不含谷胱 甘肽环境下药物释放速率快 3。
3、-5 倍， 可用于药物 在肿瘤细胞内的控制释放， 对肿瘤细胞有明显的 抑制性， 该类载药胶束粒子能很稳定的包覆抗癌 药， 为肿瘤的治疗提供了一种新型高效的药物载 体体系。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 CN 102397236 A1/1 页 2 1. 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征在于， 该方法包括以下 步骤 ： (1)将含二硫键的亲水性聚合物与疏水性聚合物混合， 在有机溶剂中常温下反应23 天， 将产物置于透析袋中透析提纯， 冻干后得到含二硫键的两亲性聚合物 ； (。
4、2) 将步骤 (1) 得到的含二硫键的两亲性聚合物在水溶液中透析 24h， 每 8h 换水一次， 得到粒径为 100 400nm 的胶束纳米粒子 ； (3) 将步骤 (2) 得到的胶束纳米粒子与抗癌药物分别溶于有机溶剂中， 再将其混合并 置于透析袋中， 加入蒸馏水后透析 24h， 每 8h 换水一次， 即得到粒径为 100 400nm 的壳层 可脱落的聚合物胶束药物载体。 2. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (1) 中的亲水性聚合物为聚乙二醇或亲水性天然高分子。 3. 根据权利要求 2 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体。
5、的制备方法， 其特征 在于， 所述的亲水性天然高分子包括淀粉、 功能化纤维素、 壳聚糖、 果胶或海藻酸。 4. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤(1)中的疏水性聚合物包括聚丙交酯(PLA)、 聚乙交酯(PGA)、 丙交酯和乙交 酯的共聚物 (PLGA)、 聚己内酯 (PCL)、 - 苄氧羰基保护聚赖氨酸， 聚亮氨酸或聚苯丙氨酸。 5. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (1) 中的含二硫键的亲水性聚合物与疏水性聚合物的质量比为 2 1 4。 6. 根据权利要求 1 所。
6、述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (2) 中的含二硫键的两亲性聚合物的水溶液的浓度为 0.2 1mg/ml。 7. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (3) 中的抗癌药物选自阿霉素、 紫杉醇或喜树碱中的一种。 8. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (3) 中胶束纳米粒子与抗癌药物的重量比为 10 1 30 1。 9. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤(3)中胶。
7、束纳米粒子在有机溶剂中的浓度为0.50.6mg/ml， 抗癌药物在有 机溶剂中的浓度为 0.7 0.9mg/ml。 10. 根据权利要求 1 所述的一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特 征在于， 所述的有机溶剂为 N， N- 二甲基酰胺 (DMF)、 四氢呋喃 (THF) 或二氯甲烷 (DCM)。 权 利 要 求 书 CN 102397236 A1/5 页 3 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于细胞内智能释放药物的药物载体， 尤其是涉及一种壳层可脱 落的聚合物胶束药物载体的制备方法。 背景技术 0002 在过去的二十年， 对聚合。
8、物纳米胶束类载体如胶束、 囊泡、 胶囊、 纳米管的研究逐 渐深入， 目前已经至少有三种聚合物纳米胶束类药物载体 (SP1049C， NK911 和 Genexol-PM) 被批准用于临床， 极大促进了纳米医药的发展。然而聚合物纳米胶束作为药物载体也面临 着一些不足。化疗药物一般需要进入肿瘤细胞内后才能产生疗效， 而传统纳米载体的药物 释放行为在细胞内外的差异没有明显区别， 药物较多在细胞外就已经释放， 导致药物的生 物利用度较低， 副作用较大。目前常见的刺激响应纳米胶束也不能区分细胞内和细胞外环 境， 因此研究能够进行细胞内药物传递的智能型载药纳米胶束具有重大意义。细胞内药物 传递的药物载体可。
9、通过设计在细胞内壳层可选择性脱落的智能型载药纳米胶束， 壳层在细 胞内的脱落将直接导致细胞内的药物释放速度远远大于细胞外的释放速度， 因此可以极大 提高药物的生物利用度， 提高化学治疗效果， 这是胶束类药物载体的发展前沿。 目前科学界 这方面的研究工作刚刚起步， 研究报道甚少。(Sun， H.L. ； Guo， B.N. ； Li， X.Q.， Cheng R.， Meng F.H.， Liu H.Y.， Zhong Z.Y.， Shell-sheddable micelles based onDextran-SS-Po ly(epsilon-caprolactone)diblock copo。
10、lymer for efficient intracellularrealease of doxorubicin.Biomacromolecules 2010， 11(4)， 848-854.) 发明内容 0003 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可在肿瘤细胞 内高谷胱甘肽还原条件下， 快速释放药物于肿瘤细胞， 而达到药物对肿瘤细胞控制释放的 壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法。 0004 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 ： 0005 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 其特征在于， 该方法包括以 下步骤 ： 0006 (1) 将含二硫键的亲水。
11、性聚合物与疏水性聚合物混合后在有机溶剂中常温反应 2 3 天， 将产物置于透析袋中透析提纯， 冻干后得到含二硫键的两亲性聚合物 ； 0007 (2) 将步骤 (1) 得到的含二硫键的两亲性聚合物溶于蒸馏水中， 将得到的水溶液 置于透析袋中透析 24h， 每 8h 换水一次， 得到粒径为 100 400nm 的胶束纳米粒子 ； 0008 (3) 将步骤 (2) 得到的胶束纳米粒子与抗癌药物分别溶于有机溶剂中， 再将其混 合并置于透析袋中， 加入蒸馏水后透析 24h， 每 8h 换水一次， 即得到粒径为 100 400nm 的 壳层可脱落的聚合物胶束药物载体。 0009 所述步骤 (1) 中的亲水。
12、性聚合物为聚乙二醇或亲水性天然高分子。 0010 所述的亲水性天然高分子包括淀粉、 功能化纤维素、 壳聚糖、 果胶或海藻酸。 说 明 书 CN 102397236 A2/5 页 4 0011 所述步骤 (1) 中的疏水性聚合物包括聚丙交酯 (PLA)、 聚乙交酯 (PGA)、 丙交酯和 乙交酯的共聚物 (PLGA)、 聚己内酯 (PCL)、 - 苄氧羰基保护聚赖氨酸、 聚亮氨酸或聚苯丙 氨酸。 0012 所述步骤 (1) 中的含二硫键的亲水性聚合物与疏水性聚合物的重量比为 2 1 4。 0013 所述步骤 (2) 中的含二硫键的两亲性聚合物的水溶液的浓度为 0.2 1mg/ml。 0014 所。
13、述步骤 (3) 中的抗癌药物选自阿霉素、 紫杉醇或喜树碱中的一种。 0015 所述步骤 (3) 中胶束纳米粒子与抗癌药物的重量比为 10 1 30 1。 0016 所述步骤 (3) 中胶束纳米粒子在有机溶剂中的浓度为 0.5 0.6mg/ml， 抗癌药物 在有机溶剂中的浓度为 0.7 0.9mg/ml。 0017 所述的有机溶剂为 N， N- 二甲基酰胺 (DMF)、 四氢呋喃 (THF) 或二氯甲烷 (DCM)。 0018 与现有技术相比， 本发明在肿瘤细胞内高谷胱甘肽 (GSH) 还原环境下， 可迅速释 放药物， 而在正常细胞中无药物释放， 高谷胱甘肽环境下药物释放速率比不含谷胱甘肽环 境。
14、下药物释放速率快 3-5 倍， 可用于药物在肿瘤细胞内的控制释放， 对肿瘤细胞有明显的 抑制性， 该类载药胶束粒子能很稳定的包覆抗癌药， 为肿瘤的治疗提供了一种新型高效的 药物载体体系。 附图说明 0019 图 1 为 DLS 测试壳层可脱落两亲性共聚物胶束的粒径图 ； 0020 图 2 为壳层可脱落两亲性共聚物胶束透射电镜图 ； 0021 图 3 为以芘为疏水荧光探针， 激发波长 330nm 下荧光光谱图 ； 0022 图 4 为根据荧光光谱图计算得出的 CMC 值 ； 0023 图 5 为使用谷胱甘肽刺激诱导壳层可脱落胶束粒径变化图 ； 0024 图 6 为载阿霉素两亲性壳层可脱落聚合物胶。
15、束在不同浓度谷胱甘肽溶液中的药 物累积释放率 ； 0025 图 7 为不同浓度下不载药壳层可脱落胶束和载药壳层可脱落胶束与人乳腺癌细 胞 MCF-7 共培养 24h 后细胞存活率。 具体实施方式 0026 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 0027 实施例 1 0028 本发明提供一种二硫键桥连的新型 PEG 壳可脱落负载肿瘤药物的体系。其特征在 于肿瘤细胞内谷胱甘肽还原条件下， 二硫键断裂， 可快速将药物释放， 达到药物对肿瘤细胞 的控制释放， 形成一种新型高效肿瘤药物载体。 0029 以下以二硫键为组分的氨化甲氧基基聚乙二醇 (mPEG-SS-NH2) 为亲水性聚合物， -苄。
16、氧羰基保护聚赖氨酸(PzLL)为疏水性聚合物， 阿霉素(DOX)作为肿瘤药物模型， 对本 发明药物载体的制备， 功能发挥及效果作全面而详细的介绍 ： 0030 (1) 二硫代二丙酸的酰氯化 ： 氮气保护下， 取二硫代二丙酸 (DTDP)， 1.05g， 5mmol 溶于 5mL 二氯亚砜 (SOCl2) 溶液中， 85反应 4h 后， 旋干 SOCl2； 说 明 书 CN 102397236 A3/5 页 5 0031 (2)mPEG-SS-mPEG 制备 ： 将上述 (1) 中加入 20mL 无水四氢呋喃 (THF)， 5mmol 三乙 胺 (Et3N)， 记为溶液 1， 将 4.8g， 1。
17、mmol 甲基聚乙二醇 (mPEG-OH) 溶于 30mL 无水 THF 中， 滴 入溶液 1 中， 75反应 6h， 将溶液浓缩后在乙醚中沉淀得到固体 mPEG-SS-mPEG ； 0032 (3) 巯基化 mPEG 制备 (mPEG-SH) ： 将 3.3g， 0.33mmol 干燥后的 mPEG-SS-mPEG 配成 10水溶液 (20mL)， 加入二硫苏糖醇 (DTT) 常温反应 2d 冷冻干燥后， 用 THF 溶解在乙醚中 沉淀得到巯基化的 mPEG ； 0033 (4)端氨基化mPEG制备(mPEG-SS-NH2) ： 取mPEG-SH(2.4g， 0.5mmol， 与巯基乙胺盐 。
18、酸盐 (0.57g， 5mmol)， Et3N 30L 在 50mL 无水甲醇中室温反应 12h 后， 将产物浓缩， 在乙醚 中沉淀， 得到端氨基的 mPEG(mPEG-SS-NH2)。 0034 (5) 两亲性聚合物 mPEG-SS-PzLL 制备 ： 取 PEG-SS-NH2(0.5g)， zLL-NCA0.25g 或 0.5g 或 0.75g 溶于 10mL 无水 DMF 中， 常温反应 2 天后， 在乙醚中沉淀， 过滤， 真空干燥得白 色固体粉末 mPEG-SS-PzLL。 0035 实施例 2 0036 制备壳层可脱落聚合物胶束及最低临界胶束浓度测定 0037 按照实施例 1 的方法。
19、制备两亲性聚合物胶束， 然后进行胶束制备及最低临界胶束 浓度 (CMC) 测定。 0038 mPEG-SS-PzLL 聚合物胶束经过透析法获得， 经动态光散射 (DLS) 测定粒径， 粒径 为 302nm 左右， 粒径分布窄， PDI 为 0.0480.005， 如图 1 所示， 胶束成圆球形， 电镜照片如 图 2 所示。 0039 通过包裹疏水探针荧光芘来测定胶束的最低临界胶束浓度(CMC)。 向十个10mL的 离心管， 分别加入 1mL 浓度为 610-6mol/L 芘的丙酮溶液于离心管中， 待丙酮完全挥发后， 将 10 个不同浓度的聚合物胶束水溶液 (1.210-3mg/mL 0.5mg。
20、/mL) 加入装有芘的离心 管中。超声 5min 后室温放置 24h， 使芘在胶束溶液中达到平衡状态。在发射波长 330nm 下 激发， 获取激发波谱图， 如图 3 所示， 激发和发射带宽均选为 5nm。CMC 值被定义为荧光强度 I397发生突变时所对应的聚合物浓度， 为 28mg/mL， 如图 4 所示。 0040 实施例 3 0041 谷胱甘肽刺激诱导胶束壳层脱落实验 0042 按照实施例 2 的方法制备两亲性聚合物胶束， 然后进行谷胱甘肽 (GSH) 刺激诱导 胶束壳层脱落实验研究。 0043 通过在10mM GSH环境下， 使用DLS测定聚合物胶束粒径的变化来说明胶束壳层脱 落特性。。
21、当加入 10mM GSH 2h 后， 聚合物的粒径由 300nm 增加到 419nm， PDI 由 0.048 升至 0.22， 由图 5 所示。当时间增至 4h 后， 出现大的聚集， 这是由于二硫键的断裂， 致使亲水性 PEG 的离去， 导致疏水端的聚集。从而证明谷胱甘肽环境下， 可使胶束壳层脱落， 使药物释 放。 0044 实施例 4 0045 壳层可脱落载药胶束的制备及体外释药特性 0046 按照实施例 1 的方法制备两亲性聚合物胶束， 然后进行载药胶束制备及体外释药 特性研究。 0047 8mg mPEG-SS-PzLL 溶于 14mL DMF 中， 溶解均匀 ； 并将 1.6mg 盐。
22、酸阿霉素溶于 2mL 说 明 书 CN 102397236 A4/5 页 6 DMF 中， 两者混合后置于 12,000-14,000 的透析袋中， 于 2000mL 准确量取的蒸馏水中透析 24h， 每 8h 换水一次并取样， 得到载药纳米胶束， 其药物包封率通过荧光分光光度计测得。 药物包封率为 76.9。 0048 通过透析法评估载药胶束的体外释药特性。将透析后的透析袋取出， 直接放入 150mL( 准确量取 ) 的 PBS(pH 7.4) 缓冲溶液或含 10mM GSH 的 PBS 缓冲溶液中进行透析 ( 烧杯置于 37， 150rpm 摇床中 )， 定时取 2mL 溶液， 每次补加 。
23、2mLPBS 溶液。待释药一定时 间之后， 通过荧光分光光度计检测阿霉素释放量。采用阿霉素特征吸收峰 (556nm) 定量检 测所取水样中阿霉素的浓度， I 为 470nm 激发波长下荧光强度。 0049 由图 6 可知， 该载药胶束在 PBS 缓冲液中释放平缓， 随着谷胱甘肽浓度增大， 该载 药胶束释放速率明显加快， 1h 时， 40mM 谷胱甘肽环境中， 药物释放速率明显高于无谷胱甘 肽的 PBS 溶液中释放速率。于 10h 时 40mM 谷胱甘肽溶液中药物释放已达到 40， 10mM 谷 胱甘肽溶液中药物释放达到 30， 而在 PBS 溶液中药物释放仅为 10左右。以上现象均说 明该载药。
24、胶束对 GSH 有良好的还原敏感响应性， 能在短时间内有效刺激药物在肿瘤部位的 释放。 0050 实施例 5 0051 细胞成活率对比实验 0052 按照实施例 4 的方法制备两亲性聚合物载药胶束， 以人乳腺癌细胞 MCF-7 为模型 来做初步研究。本实例中， 以不载药壳层可脱落胶束与载药壳层可脱落胶束为对比进行细 胞成活率测定。 0053 首先将人乳腺癌细胞 (MCF-7) 以 5000 个 / 孔接种在 96 孔板中， 培养 24h。其次将 材料 mPEG-SS-PzLL 或 DOX-mPEG-SS-PzLL 配成浓度从 31.310-3到 1mg/mL 的 6 个浓度， 每 孔加入 20。
25、0L， 培养 24h 后吸弃培养基， 加入 20L 5mg/mLMTT 溶液， 培养 4h， 最后， 吸弃上 清， 每孔加入 150DL MSO 溶液， 低速振荡 10min， 酶标仪在 492nm 测定吸光度。 0054 实验结果如图 7 所示， 左边柱状为纯材料 mPEG-SS-PzLL 的情况， 右边的柱状为载 药 DOX/mPEG-SS-PzLL 的情况。由图中可知， 纯材料 mPEG-SS-PzLL 细胞暗度性低， 生物相容 性好。而载药 DOX/mPEG-SS-PzLL 随浓度增大， 细胞生长受到抑制， 存活率降低， 间接表明载 药胶束在细胞内可壳层脱落， 释放药物， 具有良好的还。
26、原敏感性。 0055 实施例 6 0056 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 该方法包括以下步骤 ： 0057 (1) 将含二硫键的聚乙二醇与聚亮氨酸 (PLeu) 按重量比为 2 1 混合后置于 N， N- 二甲基酰胺中， 常温下反应 2 天， 然后利用乙醚进行沉淀并过滤， 将固体产物进行真空干 燥， 得到含二硫键的两亲性聚合物 ； 0058 (2) 将步骤 (1) 得到的含二硫键的两亲性聚合物溶于蒸馏水中， 控制水溶液的浓 度为 0.2mg/ml， 将其置于透析袋中透析 24h， 每 8h 换水一次， 得到粒径为 100nm 的胶束纳米 粒子 ； 0059 (3) 将步骤 (。
27、2) 得到的胶束纳米粒子与紫杉醇分别溶于 N， N- 二甲基酰胺中， 胶束 纳米粒子的浓度为 0.5mg/ml， 抗癌药物的浓度为 0.7mg/ml， 胶束纳米粒子与紫杉醇的重量 比为 10 1， 将其混合并置于透析袋中， 加入蒸馏水后透析 24h， 每 8h 换水一次， 即得到粒 径为 200nm 左右的壳层可脱落的聚合物胶束药物载体。 说 明 书 CN 102397236 A5/5 页 7 0060 实施例 7 0061 一种壳层可脱落的聚合物胶束药物载体的制备方法， 该方法包括以下步骤 ： 0062 (1) 将含二硫键的聚乙二醇与聚苯丙氨酸按重量比为 2 1 混合后置于二氯甲烷 (DCM。
28、) 中， 常温下反应 3 天， 将产物在水溶液中透析得到含二硫键的两亲性聚合物 ； 0063 (2) 将步骤 (1) 得到的含二硫键的两亲性聚合物溶于蒸馏水中， 控制水溶液的浓 度为0.75mg/ml， 将得到的水溶液置于透析袋中透析24h， 每8h换水一次， 得到粒径为300nm 左右的胶束纳米粒子 ； 0064 (3)将步骤(2)得到的胶束纳米粒子与喜树碱分别溶于二氯甲烷(DCM)中， 胶束纳 米粒子的浓度为 0.6mg/ml， 喜树碱的浓度为 0.9mg/ml， 胶束纳米粒子与抗癌药物的重量比 为 30 1， 再将其混合并置于透析袋中， 加入蒸馏水后透析 24h， 每 8h 换水一次， 即得到粒 径为 300nm 左右的壳层可脱落的聚合物胶束药物载体。 说 明 书 CN 102397236 A1/4 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102397236 A2/4 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102397236 A3/4 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102397236 A4/4 页 11 图 7 说 明 书 附 图 。