技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体涉及人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病 毒性肝炎药物中的应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，以肝脏炎性病变为主并可引起多器官 损害，迁延难愈，可发展成为肝硬化、肝癌等，已成为严重威胁人类健康的世界性疾病， 也是我国当前流行最广泛、危害性最严重的一种传染病。
人面子叶来源漆树科人面子属植物人面子Dracontomelon duperreanum Pierre的叶， 《广西本草选编》记载，“治烂疮、褥疮，叶，煎水外洗。”国内外研究资料表明，人面 子叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物的生长具有一定的抑制作用，对念球 菌属、分枝孢子菌属真菌有不同程度的抑制作用。
人面子叶中化学成分类型主要有糖类、生物碱、黄酮、甾体皂苷、鞣质及酚类，叶 挥发油中含有较多的正十六烷酸，具有抗肿瘤活性,在高浓度时能将小鼠乳腺癌tsFT210 细胞的细胞周期抑制在G2/M期并诱发tsFT210细胞发生凋亡。
但是目前对人面子叶的应用仅限于抑菌方面的用途，对于人面子叶的别的方面用途 却没有进行相关的研究，使得人面子叶的应用受到局限。
发明内容
为了探索人面子叶的新用途，本发明的目的在于公开了人面子叶乙酸乙酯提取物在 制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用，所述人面子叶 为漆树科人面子属植物人面子Dracontomelon duperreanum Pierre的叶。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，人面子叶乙酸乙酯提取物具有抑制HBV HBsAg和HBeAg分泌的作用。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，人面子叶乙酸乙酯提取物具有抑制HBV DNA表达的作用。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，人面子叶乙酸乙酯提取物具有降低免疫性肝损伤机体血清中转氨酶的作用。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，人面子叶乙酸乙酯提取物具有降酶保肝作用。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，所述人面子叶乙酸乙酯提取物是通过下述方法制备所得：
(1)、精密称取人面子叶药材，粉碎，过24目筛，加入10倍量95%乙醇回流提取2 次，减压抽滤，得滤液；
(2)、药渣加入10倍量50%乙醇回流提取2次，减压抽滤，得滤液；
(3)、合并步骤(1)和(2)的滤液，50℃～70℃真空减压回收乙醇，至滤液无醇味，得 到总提物；40℃～60℃真空干燥，得总提取物干膏；
(4)、将步骤(3)制得的总提取物干膏，加入蒸馏水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯 各萃取4次，合并4次乙酸乙酯萃取产物，得乙酸乙酯萃取液；对乙酸乙酯萃取液50℃～ 70℃减压干燥，得乙酸乙酯提取物。本技术方案中是按水溶液:溶剂=1:1的比例依次用石 油醚、乙酸乙酯萃取。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，所述的药物的剂型为医学上可接受的剂型。
上述技术方案所述的人面子叶乙酸乙酯提取物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的 应用，其中，所述的药物的剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液中的一种。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明开发了人面子叶乙酸乙酯提取物的新用途，将人面子叶乙酸乙酯提取物原 先仅作为抑菌药物的单一应用扩大到了现在的人面子叶乙酸乙酯提取物作为治疗乙型病 毒性肝炎药物方面的作用，增加了人面子叶乙酸乙酯的应用范围。
2、本发明通过试验确定了人面子叶乙酸乙酯在治疗乙型病毒性肝炎药物方面的应 用，为治疗乙型病毒性肝炎提供了新的治疗药物，为治疗乙型病毒性肝炎提供了新的选 择方向。
附图说明：
图1为正常对照组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图2为病毒对照组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图3为拉米夫定组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图4为低剂量组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图5为中剂量组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图6为高剂量组鸭肝脏病理切片(HE×200)；
图7为人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠肝脏重量的影响；
图8为人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠脾脏、胸腺重量的影响；
图9为人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶、TNF-α的影 响；
图10为正常组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图11为正常组小鼠肝脏病理切片(HE×200)；
图12为模型组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图13为模型组小鼠肝脏病理切片(HE×200)；
图14为阳性组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图15为阳性组小鼠肝脏病理切片(HE×200)；
图16为低剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图17为低剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×200)；
图18为中剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图19为中剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×200)；
图20为高剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×400)；
图21为高剂量组小鼠肝脏病理切片(HE×200)。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对人面子叶乙酸乙酯提取物 的制备方法及其在治疗乙型病毒性肝炎中的应用作进一步的说明。
一、实验材料：
1、药物及试剂：
人面子叶(购自广东省中药材市场)，为漆树科人面子属植物人面子Dracontomelon duperreanum Pierre的叶；拉米夫定(北京诺德恒信科技有限公司，批号为111201)；联 苯双酯滴丸(北京协和药厂生产，1.5mg/丸，批号为12120106)；刀豆蛋白A(ConA)(美国 Sigma公司产品)；0.9%生理盐水(自制或市场购买)。
95%乙醇、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇(北京化工厂，批号分别为 20091109、20110808、20111121、20081011)；DMSO(二甲基亚砜)(Acros公司)。
2、细胞或及动物：
细胞株：HepG2.2.15细胞，从军事医学科学院购买，自行传代培养。
1日龄北京鸭雏鸭；SPF级Balb/c小鼠60只，体重20±2g，雌雄各半，清洁饲养。 以上动物均购自解放军第三零二医院实验动物中心(合格证SCXK-(军)2007-004)。
3、材料及仪器：
Costar96孔细胞培养板(美国Corning公司)；一次性0.22μm针筒式微孔滤膜(上海 兴亚净化材料厂)；HBsAg ELISA检测试剂盒(英科新创科技有限公司生产，批号为 2012025103)；HBeAg ELISA检测试剂盒(英科新创科技有限公司生产，批号为 2012040123)；HBV荧光定量检测试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司，批号为20110508)； 地高辛标记DNA药盒(罗氏公司)；HBV-DNA斑点杂交试剂盒(自制)；ALT、AST检测试剂 盒(上海荣盛生物技术有限公司生产，批号分别为20110304、20120401)；肿瘤坏死因子 (TNF-α)定量酶联免疫检测试剂盒(RD公司产品，批号为EIA11897)。
生物显微镜(日本Olympus公司产品)；Forma恒温CO2培养箱(Thermo Electron Shanghai Instruments Co.,Ltd.)；BioTek多功能酶标仪(Thermo Electron Shanghai Instruments Co.,Ltd.)；ABI7500荧光定量PCR仪(美国CY-TECH)；BS-120全自动生化 分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；FA2004分析天平(上海天平仪器厂)； ALC4239低温高速离心机(美国Sigma公司产品)。
二、实验项目
数据处理所有数据均以x±s表示，使用SPSS19.0统计软件中的单因素方差分析处 理数据，用LSD法进行组间比较，否则采用非参数秩和检验，P＜0.05表示有差异，P＜ 0.01表示有显著性差异。
试验例1：人面子叶乙酸乙酯提取物的制备：
(1)、精密称取人面子叶药材，粉碎，过24目筛，加入10倍量95%乙醇回流提取2 次，减压抽滤，得滤液；
(2)、步骤(1)抽滤后的药渣加入10倍量50%乙醇回流提取2次，减压抽滤，得滤液；
(3)、合并步骤(1)和(2)的滤液，50℃～70℃真空减压回收乙醇，至滤液无醇味，得 到总提物；将总提物在40℃～60℃下真空干燥，得总提取物干膏；本步骤产率为16.33%；
(4)、精密称取步骤(3)得到的总提取物干膏，加入蒸馏水溶解，按水溶液:溶剂=1:1 的比例依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取4次，合并4次乙酸乙酯萃取物，得乙酸乙酯萃 取液；将乙酸乙酯萃取液在50℃～70℃减压干燥，得乙酸乙酯提取物，产率为2.74%，4℃ 冷藏备用。
本试验例中水溶液是指溶解了总提物干膏的水溶液，总提物干膏先经石油醚萃取4 次后再经乙酸乙酯萃取4次。
试验例2：人面子叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞毒性试验：
2.1、试剂的配制：
DMEM培养液：DMEM粉13.4g、NaHCO31.5g、Hepes2.38g溶于500ml双蒸水中，5%NaHCO3或1N HCL调PH值为7.0～7.2，再定容至1000ml，无菌过滤分装，－20℃保存备用。临 用前加入10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素，380μg/ml G-418。
细胞消化液：0.25%胰蛋白酶，用D-Hanks平衡液配制，0.22μm微孔滤膜除菌分装， －20℃保存备用。
MTT染色液：浓度为5mg/ml，将250mg MTT放入小烧杯中，加50ml PBS搅拌30min， 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
2.2、细胞病变程度分级：
将HepG2.2.15细胞用0.25%胰酶消化5分钟，弃消化液，加入培养液，离心，重新 加入新鲜培养液，吹打成单个细胞，按5×104个细胞/ml的密度接种于96孔培养板中， 48小时后加入含有800μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、 12.5μg/ml、6.25μg/ml等一系列浓度人面子叶总提取物、乙酸乙酯提取物的培养液，每 孔200μl，每个浓度设5个复孔，另设不加药物加DMSO的细胞对照组，37℃、5%CO2下培 养，每4天换同浓度药液一次，作用8天后显微镜下观察细胞病变。
细胞病变程度分五级：完全破坏记为++++，75%破坏记为+++，50%破坏记为++，25% 破坏记为+，无破坏为－。
2.3、MTT法检测细胞的存活率：
弃培养液上清，每孔再加入新鲜培养液100μl和5mg/ml的MTT10μl，37℃、5%CO2条件下继续孵育4小时，孔底清晰可见紫黑色甲躜蓝颗粒。轻轻吸走MTT液，每孔加入 DMSO150μl，振荡。待甲躜蓝颗粒完全溶解后，用酶标仪检测540nm波长下各孔光密度 值(OD540)。每次实验重复三次。
不同浓度药物作用的抑制率按下列公式计算：
TC50：半数细胞有毒浓度，即抑制细胞生长达50%时药物浓度。
结果：采用MTT法检测人面子叶样品对细胞的毒性，所测得的OD值与显微镜下观察 的结果不一致，这与药物本身带有很深的颜色和药物水溶性差异有关。MTT法没有给出确 切的TC50值，根据显微镜下观察结果，给出人面子叶总提取物TC50参考范围在400～ 800μg/ml之间，乙酸乙酯萃取部位的TC50在200～400μg/ml之间，人面子叶样品对HepG 2.2.15最大无毒浓度结果见表1。
表1人面子叶样品对HepG2.2.15最大无毒浓度的确定
试验例3：人面子叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌影响：
根据样品最大无毒浓度进行实验。将HepG2.2.15细胞按5×104个细胞/ml的密度 接种于96孔培养板中，48小时后弃培养液上清，加入含有不同浓度药物[拉米夫定 (250μg/ml)、总提取物(200μg/ml)、乙酸乙酯提取物(50μg/ml)]的培养液，每孔200μl， 每个浓度设3个复孔，另设不加药物加DMSO的细胞对照组，37℃、5%CO2下培养，每4 天换同浓度药液一次，第9天收集细胞培养液上清，按照HBsAg和HBeAg ELISA检测试 剂盒上的方法检测上清中的相应抗原含量。乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫 法)和e抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)均采用双抗夹心法。具体操作实验方法如下：
(1)加样本：取待测细胞培养液上清50μl，加到抗-HBs或抗-HBe包被反应板中。设 空白对照2孔，阴、阳性对照各3孔。
(2)加酶结合物：加入多克隆抗-HBs-HRP或抗-HBe-HRP的酶结合物50μl(空白对照孔 除外)，充分混匀，封板，37℃孵育30分钟。
(3)洗板：弃去反应板中液体，用洗涤液洗板5次，拍干。
(4)显色：先后加入显色液A50μl、显色液B50μl，37℃避光孵育10分钟，加终止 液50μl，振荡混匀，用酶标仪在450nm、630nm双波长下检测光密度值(OD450/630)。
药物对抗原分泌的抑制率按下列公式计算：
结果：表中各样品在最大无毒浓度下对HepG2.2.15细胞均没有毒性。从表2结果 可以看出，人面子叶总提取物对HBV HBsAg的分泌没有抑制作用。与空白组相比，乙酸 乙酯提取物对HBV HBsAg、HBV HBeAg的分泌均有显著的抑制作用(P＜0.01)。乙酸乙酯 提取物与阳性药拉米夫定比较，两者对HBV HBsAg和HBeAg的分泌抑制作用无统计学差 异(P﹥0.05)。
综上，人面子叶乙酸乙酯提取物对HBV HBsAg和HBeAg的分泌具有较强的抑制作用， 其抑制作用优于总提取物，与拉米夫定作用相当。
表2人面子叶样品对HBsAg、HBeAg抑制影响(x±s)
注：与空白组比较，**P＜0.05，*P＜0.01，NE表示药物对抗原分泌无抑制作用。
试验例4：人面子叶乙酸乙酯提取物对HepG2.2.15细胞HBV DNA表达的影响：
根据样品最大无毒浓度进行实验。将HepG2.2.15细胞按5×104个细胞/ml的密度 接种于96孔培养板中，48小时后弃培养液上清，加入含有不同浓度药物[拉米夫定 (250μg/ml)、总提取物(200μg/ml)、乙酸乙酯提取物(50μg/ml)]的培养液，每孔200μl， 每个浓度设3个复孔，另设不加药物加DMSO的细胞对照组，37℃、5%CO2下培养，每4 天换同浓度药液一次，第9天收集细胞培养液上清，使用HBV荧光定量检测试剂盒检测 人面子叶不同样品对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用。按HBV荧光定量检测 试剂盒中说明书进行实验操作，具体步骤如下：
(1)样本处理：将100μL培养液上清和试剂盒中的阴、阳性对照品分别加到0.5mL 离心管中。加入提取液1100μL，振荡混匀，13000rpm离心10min；弃上清；再加入提 取液225μL，振荡混匀至沉淀完全溶解，2000rpm离心10秒，100℃水浴10min；13000rpm 离心10min，保留上清用于检测HBV DNA含量。
(2)扩增试剂准备：从试剂盒中取出Taq酶、PCR反应液及UNG，室温下融化混匀， 2000rpm离心10秒。
测试反应体系配制：37.6μL PCR反应液、0.4μL Taq酶、0.06μL UNG；其中PCR反 应液中含有的引物为：
上游：5’—GTCACCATATTCTTGGGAAC—3’(SEQ ID NO:1)
下游：5’—CATATCCCATGAAGTTAAGG—3’(SEQ ID NO:2)
(3)加样：室温解冻阳性工作标准品，振荡后2000rpm离心10秒。在所设定的PCR 反应管中分别加入2μL上述样本处理液、阴阳性对照及阳性工作标准品，盖紧管盖，将 PCR反应管置于PCR仪内，记录样本顺序。
(4)PCR扩增：采用PE GeneAmp7300PCR(ABI7500荧光定量PCR仪)扩增HBV DNA， 5min37℃、1min94℃、5sec95℃、30sec60℃、42个循环。
计算各组样品最大无毒浓度作用下，HBV DNA拷贝数和对HBV DNA表达抑制率。
结果：与空白组比较，阳性药拉米夫定、乙酸乙酯提取物HBV DNA的拷贝数明显下 降(P＜0.05)，总提取物仅具下降的趋势。其中乙酸乙酯提取物对HBV DNA的抑制率最高， 但与拉米夫定比较无显著性差异(P﹥0.05)。
综合分析：人面子叶乙酸乙酯提取物具有较强抑制HBV DNA表达的作用，其抑制作 用优于总提取物，与拉米夫定作用相当。
表3人面子叶样品对HBV DNA抑制影响(x±s)
注：与空白组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。
试验例5：人面子叶乙酸乙酯提取物体内抗鸭乙型肝炎病毒活性实验：
北京鸭蛋孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1ml DHBV-DNA阳性血清，1周后颈外静 脉抽血，用地高辛标记的DHBV-DNA探针经斑点杂交检测选出感染阳性鸭，饲养2～3周 后作为实验动物。正常对照组用未感染病毒的同龄鸭。
将DHBV-DNA阳性鸭随机分为6组，分别为正常对照组、病毒对照组、拉米夫定组、 人面子叶乙酸乙酯提取物低剂量组(100μg/ml)、中剂量组(200μg/ml)、高剂量组 (400μg/ml)，每组12只，分别于每日清晨ip或ig药物。另设正常对照组。每天给药1 次，连续1个月。各组动物于用药前、用药2周、用药1个月、停药后1周分别于颈外 静脉取血，分离血清，-20℃保存备用。采用斑点杂交法，用地高辛探针，将用药前后4 次血清统一对比检测血清DHBV-DNA，以与探针同源性的质粒DNA倍比稀释后点样于硝酸 纤维膜上杂交显示的斑点颜色深浅为标准，与待检血清斑点杂交斑点的颜色深浅比较来 定量，结果如表4、表5。用药1个月测血清ALT、AST，结果如表6。于停药后1周将实 验动物断颈处死，取肝组织10%甲醛固定，石腊切片，HE染色，光镜检查，如表7，图1～ 6。
结果：由表4、5可见给药各组均使血清DHBV-DNA滴度总体水平明显降低，停药后1 周拉米夫定血清DHBV-DNA滴度有回升现象，而人面子叶各剂量组DHBV-DNA滴度总体回 升不明显。各用药组部分鸭有DHBV-DNA阴转效果，但各组转阴率无明显差异，说明人面 子叶乙酸乙酯提取物有明显抑制鸭乙肝病毒的作用。表6可见用药1个月受试药各剂量 均比病毒对照组同一时相ALT明显下降，但AST变化不明显，说明人面子叶乙酸乙酯提 取物有显著降低感染鸭血清中转氨酶的作用。
表4人面子叶乙酸乙酯提取物对血清DHBV-DNA滴度的影响(x±s)
注：△ip；与病毒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。
表5用药2周、1月及停药1周血清DHBV-DNA阴转率(%)
表6用药1月血清转氨酶改变情况(酶活力单位,x±s)
注：与病毒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。
肝组织病理检查结果表明：各组动物均有不同程度肝细胞空泡变性、混浊肿胀，部 分汇管区隔炎细胞浸润，少数有肝细胞嗜酸性变，所有这些改变，人面子叶乙酸乙酯提 取物各剂量均比病毒对照组轻，未发现坏死现象，见表7，图1～图6。
表7各组肝组织常规HE染色病理检查结果
注：与病毒对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。
综合以上实验结果，人面子叶乙酸乙酯提取物可明显减少血清DHBV-DNA滴度总体水 平，且停药1周后血清DHBV-DNA回升不明显，同时人面子叶乙酸乙酯提取物有显著降低 感染鸭血清中转氨酶的作用，减轻病毒引起的肝脏组织损伤，说明人面子叶乙酸乙酯提 取物对感染鸭体内HBV具有较强的抑制作用，且经机体代谢后,其抗DHBV活性并未减弱。
试验例6：人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠的保护作用：
人面子叶乙酸乙酯提取物干膏，用0.5%CMC溶解混匀，配制成终浓度为20g/kg、 10g/kg、5g/kg的混悬液，4℃保存备用。将联苯双酯滴丸碾碎，用生理盐水溶解，配制 成浓度为160mg/kg的混悬液。
Balb/c小鼠适应性喂养3天。将小鼠按体重随机分为以下6组：正常组(A)、模型组 (B)、阳性(联苯双酯)组(C)、人面子叶乙酸乙酯提取物提取物高剂量(20g/kg)组(D)、中 剂量(10g/kg)组(E)、低剂量(5g/kg)组(F)，每组12只，雌雄各半，分笼饲养。除正常 对照组外，其余各组小鼠分别于首日尾静脉注射20mg/kg ConA。同时正常组、模型组灌 服生理盐水，C、D、E、F组按上述剂量给药1次，连续给药7天。末次给药后2小时， 除正常组小鼠外，其余各组小鼠再次尾静脉注射20mg/kg ConA，禁食不禁水。4小时后， 观察小鼠一般情况(包括精神、活动、饮食、皮毛)。称量体重，摘眼球取全血，常规分 离血清，按试剂盒说明方法检测ALT、AST、TNF-α。颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脏、胸 腺及脾脏称重，求出脏器指数。脏器指数按下列公式计算：
脏器指数=脏器湿重(mg)/小鼠体重(g)
摘取肝脏观察大体外观后，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色， 光镜下观察各组小鼠肝脏组织病理变化情况。
结果：
5.1、小鼠给药后一般情况观察：
实验期间正常组小鼠精力充沛，活动灵活，饮食正常，皮毛整洁，无死亡；各给药 组和模型组小鼠在用药后均有不同程度的精神萎靡，活动迟钝，饮食减少，皮毛竖立凌 乱，阳性组小鼠的精神、饮食等整体情况明显优于模型组和人面子叶各给药组。
5.2、对小鼠免疫器官重量的影响：
肉眼观察，模型组和各给药组小鼠的肝脏和脾脏明显瘀血肿胀，胸腺肿大。从表8、 图7、图8中可以看出，与正常组比较，模型组小鼠的肝脏指数、脾脏指数及胸腺指数增 大明显(P＜0.05或P＜0.01)，说明ConA致免疫性肝损伤小鼠造模成功。与模型组比较， 阳性(联苯双酯)组能显著降低肝脏指数、脾脏指数及胸腺指数(P＜0.01)，高剂量组能显 著降低造模引起的肝脏指数上升，同时中、高剂量组能显著降低造模引起的胸腺指数上 升。对于脾脏指数，各剂量组与模型组比较无统计学意义(P﹥0.05)。与阳性组比较，人 面子叶乙酸乙酯提取物高剂量组与阳性组降低肝脏指数无统计学差异，说明高剂量组具 有与阳性药相同的降低肝脏指数的作用。
综合分析：与模型组相比，人面子叶乙酸乙酯提取物给药组能明显降低肝脏指数和 胸腺指数(P＜0.05)，而对脾脏指数无影响，且高剂量组降低肝脏指数的作用与阳性药(联 苯双酯)无显著性差异(P＞0.05)。
表8人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠免疫器官重量的影响(x±s)
注：与正常对照组比较▼P<0.05，▼▼P<0.01；与模型对照组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01。
5.3、对血清ALT、AST的影响：
表9和图9中可以看出，模型组小鼠ALT、AST水平较正常对照组明显升高，差异有 显著性意义(P＜0.05)，表明ConA致免疫性肝损伤小鼠造模成功。阳性组与模型组比较， ALT、AST水平均明显低于模型组(P＜0.01)。各剂量组与模型组比较，中、高剂量均能显 著降低ALT水平，且高剂量组与阳性组比较没有显著性差异(P＞0.05)，同时，高剂量能 显著降低AST水平(P＜0.05)。
综合分析：与模型组比较，人面子叶乙酸乙酯提取物高、中剂量能显著降低ALT水 平，且高剂量与联苯双酯阳性药降低ALT水平无显著性差异，高剂量能显著降低AST水 平。说明人面子叶乙酸乙酯提取物有显著降低免疫性肝损伤小鼠血清中转氨酶的作用。
5.4、对血清TNF-α的影响：
从表9和图9可以看出，模型组小鼠TNF-α水平较正常对照组明显升高，差异有统 计学意义(P＜0.01)。阳性组较模型组TNF-α水平降低，但无统计学意义。各给药组与模 型组相比，TNF-α水平均有不同程度降低，其中高剂量组与模型组比较，差异具有显著 性意义(P＜0.05)，其余各组差异不显著(P＞0.05)。
综合分析：人面子叶乙酸乙酯提取物高剂量能显著降低血清中TNF-α的水平。
表9人面子叶乙酸乙酯提取物对免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响(x±s)
注：与正常对照组比较，▼P<0.05，▼▼P<0.01；与模型对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与阳性(联 苯双酯)组比较，
P<0.05，
P<0.01。
5.5、肝脏病理组织学检查：
肝脏组织经HE染色后用倒置显微镜观察。正常组小鼠肝脏组织形态正常，肝细胞索围绕 中央静脉呈放射状排列，细胞未见肿胀、炎性病变及坏死。模型组肝细胞坏死明显、肝 索排列紊乱，中央静脉和汇管区可见大量炎性细胞浸润，肝窦内可见红细胞堆积，肝脏 组织部分区域呈点状、片状坏死，坏死区残留有细胞碎片。联苯双酯组和人面子叶乙酸 乙酯提取物各给药组肉眼观察肝脏红肿增大，病理切片均可见肝细胞不同程度肿大，炎 症细胞浸润，但是未见明显坏死灶，与模型组比较炎症损伤程度减轻，以高剂量组、联 苯双酯组减轻程度最明显，中、低剂量组次之。病理切片详见图10～21。
综合以上实验结果，小鼠尾静脉注射ConA后肝脏、脾脏明显肿胀瘀血，肝脏、脾脏 指数升高；血清ALT、AST、TNF-α含量也明显升高，以上结果足以说明免疫性肝损伤小 鼠造模成功。阳性组、人面子叶乙酸乙酯提取物高剂量组护肝的作用明显，能快速、显 著地降低ALT、AST，病理组织学检查肝脏损伤减轻。同时人面子叶乙酸乙酯提取物高剂 量组能减少TNF-α的含量，说明人面子叶乙酸乙酯提取物护肝降酶作用机制可能与降低 TNF-α等炎症介质的释放、减轻肝脏炎症有密切联系。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制， 凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时， 凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍 属于本发明的技术方案的范围内。