5HTSUB2C/SUB受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用.pdf

本发明公开了5-HT2C受体特异性阻断剂的新用途，即5-HT2C受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。本发明提供了5-HT2C受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；（b）延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；（c）降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。本发明发现并从功能上证实了在新生大鼠离体延髓脑片上存在5-HT2C受体参与对基本节律性呼吸放电的调节。

1.5-HT受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为为如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；（b）延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；（c）降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。 2.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述5-HT受体特异性阻断剂为RS102221。 3.5-HT受体特异性阻断剂的应用，为如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；（b）延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；（c）降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅度。 4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述5-HT受体特异性阻断剂为RS102221。 5.5-HT受体特异性阻断剂在对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。 6.如权利要求5所述的调节作用，其特征在于：所述5-HT受体特异性阻断剂为RS102221。 7.5-HT受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为：对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电进行调节。 8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述5-HT受体特异性阻断剂为RS102221。

技术领域

本发明涉及5-HT2C受体特异性阻断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调 节作用。

背景技术

哺乳动物延髓神经网络能够产生节律性呼吸放电，已有研究证实面神经后核内侧 区（the medial region of Nucleus Retrofacialis，mNRF)是呼吸节律发生的关键 位置，也有研究发现延髓腹外侧区前包钦格复合体（complex，PBC） 是呼吸节律产生部位。这两个部位虽不完全相同，但有部分重叠。

大鼠5羟色胺能神经元从中缝核尾部投射到舌下神经核参与调整呼吸，5-羟色胺 受体（5-HT受体）存在于新生大鼠和新生小鼠腹侧呼吸组。除了5-HT3受体是配体门控 离子通道外其余5-HT受体均为G蛋白偶联受体、。

发明内容

本发明的目的是提供5-HT2C受体特异性阻断剂的新用途，即5-HT2C受体特异性阻 断剂对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电的调节作用。

本发明提供了5-HT2C受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为 如下（a）和/或（b）和/或（c）：（a）缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时 程；（b）延长舌下神经根基本节律性呼吸放电的呼吸周期；（c）降低舌下神经根基 本节律性呼吸放电的放电积分幅度。所述5-HT2C受体特异性阻断剂具体可为RS102221。

本发明还保护5-HT2C受体特异性阻断剂的应用，为如下（a）和/或（b）和/或（c）： （a）缩短舌下神经根基本节律性呼吸放电的吸气时程；（b）延长舌下神经根基本节 律性呼吸放电的呼吸周期；（c）降低舌下神经根基本节律性呼吸放电的放电积分幅 度。所述5-HT2C受体特异性阻断剂具体可为RS102221。

本发明还保护5-HT2C受体特异性阻断剂在对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电 的调节作用。所述5-HT2C受体特异性阻断剂具体可为RS102221。所述哺乳动物可为大 鼠，具体可为Sprague–Dawley大鼠，具体可为1-3天新生大鼠。

本发明还保护5-HT2C受体特异性阻断剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为： 对哺乳动物延髓的基本节律性呼吸放电进行调节。所述5-HT2C受体特异性阻断剂具体 可为RS102221。所述哺乳动物可为大鼠，具体可为Sprague–Dawley大鼠，具体可为 1-3天新生大鼠。

吸气神经元是产生吸气模式的基本组成成分，是呼吸节律形成的前提。本发明 发现MK212可以显著延长TI、缩短RC、增加IA，证明在吸气神经元细胞膜上存在 5-HT2C受体调节RRDA。本发明发现RS102221可以显著缩短TI、延长RC、降低IA， 证明在mNRF有内源性5-羟色胺能神经元释放5-羟色胺调节RRDA，阻断5-HT2C受体 对吸气神经元有抑制作用。MK212缩短RC和RS102221延长RC提示在呼吸中间神经 元和呼气神经元细胞膜上同样存在5-HT2C受体，通过调节这两类神经元兴奋性影响呼 吸的时相转换。激活或阻断5-HT2C受体影响RC说明通过影响呼吸中间神经元的兴奋 性影响了呼气-吸气时相转换从而影响呼吸周期。

5-HT2C受体被激活后催化4,5-磷脂酰肌醇二磷酸酯水解成为1,4,5-三磷酸肌醇 和二酯酰甘油。1,4,5-三磷酸肌醇通过内质网增加胞浆内[Ca2+]，二酯酰甘油激活胞 浆内PKC。PKC通过磷酸化钠通道增加钠通道开放几率，PKC还可以增加活性氧族浓 度。活性氧族也可增加钠通道开放几率。本发明推测5-HT2C受体对吸气神经元和呼吸 中枢的调节作用是通过增高的钠通道开放几率依次增加了吸气神经元和呼吸中枢的 兴奋性。

本发明发现并从功能上证实了在新生大鼠离体延髓脑片上存在5-HT2C受体参与 对基本节律性呼吸放电的调节，5-HT2C受体通过调节延髓呼吸神经元兴奋性来调节延 髓呼吸中枢基本节律性呼吸。

附图说明

图1为对照组的结果。

图2为MK212组的结果。

图3为RS102221组的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。

将每次吸气性放电开始至放电结束的时间作为吸气时程(inspiratory time, TI)，以一次吸气性放电开始至下一个放电开始的时间作为呼吸周期(respiratory  cycle,RC)，把一次放电的原始图进行积分获得放电积分幅度(integral amplitude, IA)。

实验数据以Mean±SD表示，使用SPSS13.0软件(SPSS,Chicago,USA)重 复测量方差分析进行统计学处理，检验水准а=0.05，P<0.05认为有统计学差 异。

2-Chloro-6-(1-piperazinyl)-pyrazine hydrochloride,

6-Chloro-2-(1-piperazinyl)pyrazine hydrochloride（简称MK212，是一种5-HT2C受体特异性激动剂）：Sigma,USA。

4-dione

hydrochloridehydrate,8-[5-(2,4-Dimethoxy-5-(4-trifluoromethylphenylsulpho namido)phenyl-5-oxopentyl]-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2（简称RS102221， 是一种5-HT2C受体特异性阻断剂）：Sigma,USA。

直流前置放大器（FZG-81DC preamplifier）：Shanghai Jialong Teaching  Apparatus,China。

BL-420生物信号采集和处理系统（BL-420F intelligent biological signal  collection and management system）：成都泰盟科技公司（Chengdu TME Technology, China）。

Sprague–Dawley大鼠（1-3天SPF级新生大鼠）：购自郑州大学实验动物中心， 5.47±1.53g，许可证号为SCXK(YU)2010-0002。

人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF)：将NaCl124mmol、KCl 5mmol、CaCl2 2.4mmol、MgSO4 1.3mmol、NaHCO3 26mmol和Glucose30mmol溶于双蒸水 并用双蒸水定容至1L；使用前用95％O2和5％CO2平衡1h以上。

MK212和RS102221均先溶于少量二甲基亚砜后加入人工脑脊液至所需浓度（需 保证二甲基亚砜浓度低于0.1%）。

所有的实施例中的实验步骤均经过新乡医学院动物伦理委员会批准。

实施例1、

一、制备包含面神经后核内侧区的新生大鼠离体延髓脑片（保留脑片腹侧面的舌 下神经根）

1、Sprague–Dawley大鼠用乙醚麻醉后在C3-C4节段断头，在延髓-脑桥之间迅 速横断脑干，去除颅骨及脑桥以上的脑组织，剪开延髓背侧颅骨，小心分离至C1-C2 段脊髓，游离出延髓-脊髓，完整保留舌下神经根。整个过程均在持续充以95％O2和 5％CO2的0℃人工脑脊液中进行，3min内完成标本制作。

2、迅速将标本头端向上移至切片槽内，腹侧面朝向刀刃，刀刃朝向头端倾斜20°， 在闩前600μm至闩后100μm间切下延髓脑片(含舌下神经根)。

二、分组处理

取60只步骤一制备的脑片，随机分为10组（每组6只），分别进行以下平行处 理：

对照组：将脑片置于灌流槽内，用人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流60min，pH 保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下 神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电（RRDA）经直流前置放大器放大后输入 BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

MK212-Ⅰ组：将脑片置于灌流槽内，用含有1μmol/L MK212的人工脑脊液以 2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银-氯化 银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前 置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

MK212-Ⅱ组：将脑片置于灌流槽内，用含有5μmol/L MK212的人工脑脊液以 2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银-氯化 银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前 置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

MK212-Ⅲ组：将脑片置于灌流槽内，用含有10μmol/L MK212的人工脑脊液以 2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银-氯化 银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前 置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

MK212-Ⅳ组：将脑片置于灌流槽内，用含有20μmol/L MK212的人工脑脊液以 2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银-氯化 银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直流前 置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

RS102221-Ⅰ组：将脑片置于灌流槽内，用含有1μmol/L RS102221的人工脑脊 液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银- 氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直 流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

RS102221-Ⅱ组：将脑片置于灌流槽内，用含有5μmol/L RS102221的人工脑脊 液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银- 氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直 流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

RS102221-Ⅲ组：将脑片置于灌流槽内，用含有10μmol/L RS102221的人工脑脊 液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银- 氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直 流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

RS102221-Ⅳ组：将脑片置于灌流槽内，用含有20μmol/L RS102221的人工脑脊 液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃；用内含银- 氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼吸放电经直 流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处理和分析；

MK212+RS102221组：将脑片置于灌流槽内，先用人工脑脊液以2-4mL/min持续灌 流10min，然后用含有10μmol/L MK212的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min， 然后用人工脑脊液冲洗20min，然后用含有10μmol/L RS102221和10μmol/L MK212 的人工脑脊液以2-4mL/min持续灌流15min，pH保持7.35-7.45，温度保持27-29℃； 用内含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，将舌下神经根基本节律性呼 吸放电经直流前置放大器放大后输入BL-420生物信号采集和处理系统进行记录、处 理和分析。

三、结果分析

1、对照组的结果分析

对照组脑片的RRDA在60min内无变化，说明本模型稳定可靠。0-60分钟内，每10 分钟的检测结果见图1和表2（均为从该检测时间点开始连续6个呼吸的平均值）。表1 中，将10min时间点的检测结果作为100，表格中显示的是其它各个时间点的检测结果 与10min时间点的检测结果的比值。10min时间点的检测结果为：TI=0.69s，IA=349.26 μV·s，RC=18.92s。

表1对照组的RRDA在60min内的变化（n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 10min时间点 100 100 100 20min时间点 98.50±5.47 103.17±10.05 101.83±10.70 30min时间点 101.17±4.54 102.67±6.28 99.67±8.36 40min时间点 99.67±4.03 99.17±6.85 101.67±9.44 50min时间点 101.50±8.26 104.17±9.06 105.50±11.00 60min时间点 98.67±6.59 97.83±7.41 97.50±7.77 F 0.294 0.693 0.607 P 0.912 0.528 0.695

2、MK212组的结果分析

MK212组脑片灌流MK212后RRDA发生了改变，10μmol/L MK212的处理组5min 达到稳定效果。MK212对RRDA有兴奋作用：5μmol/L浓度的MK212即可延长TI、缩 短RC、增强IA，10μmol/L浓度的MK212可达到最大效果，10μmol/L浓度的MK212 与20μmol/L浓度的MK212处理组之间没有显著差异。对照组、MK212-Ⅰ组、MK212- Ⅱ组、MK212-Ⅲ组和MK212-Ⅳ组10分钟时间点的检测结果见图2和表2（均为从该 检测时间点开始连续6个呼吸的平均值）。MK212-Ⅲ组0分钟时间点、1分钟时间点、 5分钟时间点和10分钟时间点的检测结果见表3（均为从该检测时间点开始连续6个 呼吸的平均值）。表2中，将对照组的检测结果作为100，表格中显示的是其它各个 处理组的检测结果与对照组的检测结果的比值，对照组的检测结果为：TI=0.71s， IA=362.11μV·s，RC=17.85s。表3中，将0min时间点的检测结果作为100，表格中 显示的是其它各个时间点的检测结果与0min时间点的检测结果的比值，0min时间点 的检测结果为：TI=0.68s，IA=347.26μV·s，RC=18.67s。

表2对照组、MK212-Ⅰ组、MK212-Ⅱ组、MK212-Ⅲ组和MK212-Ⅳ组的检测结果 （n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 对照组 100 100 100 MK212-Ⅰ组 100.17±3.31 101.17±4.71 101.52±7.97 MK212-Ⅱ组 105.50±2.88** 107.67±3.56** 93.02±4.09** MK212-Ⅲ组 113.33±5.68** 116.50±5.13** 86.71±5.85** MK212-Ⅳ组 113.67±6.44** 117.17±5.81** 84.39±4.46** F 16.181 39.132 35.541 P 0.005 0.000 0.000

**P<0.01vs对照组；MK212-Ⅲ组和MK212-Ⅳ组的检测结果没有显著差异。

表3MK212-Ⅲ组0分钟、1分钟、5分钟和10分钟的检测结果（n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 0min时间点 100 100 100 1min时间点 103.17±2.20* 105.33±3.67* 93.17±6.79* 5min时间点 112.00±3.75** 118.67±4.82** 88.11±4.51** 10min时间点 113.33±5.68** 116.50±5.13** 86.71±5.85** F 24.400 27.392 19.075 P 0.000 0.000 0.001

*P<0.05、**P<0.01vs0min时间点；5min时间点和10min时间点的检测结果没有显著 差异。

3、RS102221组的结果分析

RS102221组脑片灌流MK2121min后RRDA发生了改变，10μmol/L RS102221的 处理组5min达到稳定效果。RS102221对RRDA有抑制作用，可缩短TI、延长RC、降 低IA。对照组、RS102221-Ⅰ组、RS102221-Ⅱ组、RS102221-Ⅲ组和RS102221-Ⅳ组 10分钟时间点的检测结果见图3和表4（均为从该检测时间点开始连续6个呼吸的平 均值）。RS102221-Ⅲ组0分钟时间点、1分钟时间点、5分钟时间点和10分钟时间 点的检测结果见表5（均为从该检测时间点开始连续6个呼吸的平均值）。表4中， 将对照组的检测结果作为100，表格中显示的是其它各个处理组的检测结果与对照组 的检测结果的比值，对照组的检测结果为：TI=0.69s，IA=363.04μV·s，RC=17.69s。 表5中，将0min时间点的检测结果作为100，表格中显示的是其它各个时间点的检测 结果与0min时间点的检测结果的比值，0min时间点的检测结果为：TI=0.71s， IA=361.33μV·s，RC=18.56s。

表4对照组、RS102221-Ⅰ组、RS102221-Ⅱ组、RS102221-Ⅲ组和RS102221-Ⅳ组的 检测结果（n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 对照组 100 100 100 RS102221-Ⅰ组 98.33±3.08 97.33±3.01 103.63±4.23 RS102221-Ⅱ组 94.17±3.31** 92.17±3.66** 108.10±3.88** RS102221-Ⅲ组 86.00±4.90** 85.17±3.37** 117.88±4.07** RS102221-Ⅳ组 85.33±5.75** 84.50±4.51** 116.59±4.59** F 51.310 76.347 42.285 P 0.000 0.000 0.000

**P<0.01vs对照组；RS102221-Ⅲ组和RS102221-Ⅳ组的检测结果没有显著差异。

表5RS102221-Ⅲ组0分钟、1分钟、5分钟和10分钟的检测结果（n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 0min时间点 100 100 100 1min时间点 98.83±2.64 95.67±3.96* 100.44±3.45 5min时间点 87.67±3.27** 82.33±7.17** 116.90±4.03** 10min时间点 85.83±4.58** 83.67±6.89** 117.88±4.07** F 36.677 40.142 28.324 P 0.001 0.000 0.001

*P<0.05、**P<0.01vs0min时间点；5min时间点和10min时间点的检测结果没有显著 差异。

4、MK212+RS102221组的结果分析

MK212+RS102221组的处理过程中，分为如下四个阶段：第一个阶段为人工脑脊液 处理10min，第二个阶段为MK212处理15min，第三个阶段为人工脑脊液洗涤20min，第 四个阶段为MK212+RS102221处理15min。用人工脑脊液灌流起始作为0min,之后连续计 时，即1-10min人工脑脊液灌流，11-25min MK212灌流，26-45min人工脑脊液洗涤， 46-60min MK212+RS102221灌流。

5分钟时间点（即人工脑脊液处理5min）、20分钟时间点（即MK212处理5min）、40 分钟时间点（即人工脑脊液洗涤处理15min）和55分钟时间点（即MK212+RS102221处 理10min）的检测结果见表6（均为从该检测时间点开始连续6个呼吸的平均值）。MK212 对RRDA有兴奋作用，第二个阶段与第一个阶段、第三个阶段和第四个阶段均有显著差 异。第一个阶段和第四个阶段无差异，即RS102221可完全阻断MK212对RRDA的作用。

表6MK212+RS102221组的结果（n=6）

  TI(s) IA(μV·s) RC(s) 5min时间点 0.68±0.05 353.27±21.48 19.55±3.04 20min时间点 0.77±0.07** 389.57±24.75** 15.97±2.78** 40min时间点 0.67±0.06## 349.63±30.25## 19.51±2.66## 55min时间点 0.69±0.07# 344.63±34.67## 19.17±3.60## F 7.945 22.027 18.074 P 0.002 0.000 0.000

**P<0.01vs第一阶段,#P<0.05、##P<0.01vs第二阶段。