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1、(10)授权公告号 CN 103239467 B (45)授权公告日 2015.01.14 CN 103239467 B (21)申请号 201210023033.9 (22)申请日 2012.02.02 A61K 31/715(2006.01) A61K 31/716(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C08B 37/00(2006.01) C08B 37/02(2006.01) (73)专利权人 北京悦康科创医药科技有限公司 地址 100176 北京市经济技术开发区景园街 6 号 (72)发明人 李玉娟 陶秀梅 牟昳 贺永莲 。
2、邓锐 (74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所 ( 普通合伙 ) 11130 代理人 孟旭 王为 CN 101067006 A,2007.11.07, 制备例 1-3. 张林波 等 . 姬松茸多糖的分离纯化及其初 步鉴定 .中国现代中药 .2009, 第 11 卷 ( 第 5 期 ),17-20. 孙培龙 . 姬松茸多糖的分离纯化、 结构鉴定 及抗肿瘤活性研究 .中国博士学位论文全文数 据库 工程科技 I 辑 .2008,( 第 02 期 ),B016-4. (54) 发明名称 姬松茸多糖及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种姬松茸多糖及其制备方 法， 包括总多糖的提取、 纯化、 。
3、均一分子量姬松茸 多糖的制备及结构确认、 质量控制方法。 本发明还 公开了该药物组合物药剂的制备方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 郑茹 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103239467 B CN 103239467 B 1/1 页 2 1. 一种含均一分子量的姬松茸多糖的药物组合物， 所述均一分子量的姬松茸多糖是一 种含 p- 毗喃型葡萄糖的蛋白聚糖， 为果糖与葡萄糖的多聚体， 其中果糖与葡萄糖的摩尔比 为 6 1， 相对分子质量为。
4、 50000， 其制备方法如下 ： 姬松茸粉碎过 10-20 目筛， 加入 8 倍量水， 沸石 10 粒， 物料提取前用微波预处理 8-12 分钟提高得率， 煮沸回流， 1 小时， 过滤， 提取 2 次， 提取液合并， 加入提取液体积 2/3 的 95 乙醇， 真空浓缩， 过滤并进行高效离心， 沉淀物在 50干燥， 干燥物在 280nm， 260nm 测定 吸收度， 发现有紫外吸收， 说明有蛋白存在， 多糖用 Sevage 法除蛋白， 条件为 ： 振荡时间为 30min， 试剂氯仿正丁醇 3 1， 样品试剂 4 1， 离心， 水溶液用紫外光谱检测， 不 含蛋白质， 然后， 30 H2O2脱色，。
5、 得到姬松茸总多糖 ； 取姬松茸总多糖稀释 15 倍， 5104相对分子质量膜超滤， 压力为 0.4MPa， 取相对分子 质量为 5104部分， 依次上 DEAE Sepharose 柱和 Sephadex G25 柱， 不同浓度的 NaCl 水洗 脱， 苯酚 - 硫酸法检测， 合并峰位， 收集流出物为单一色谱峰的物质， 冷冻干燥， 得均一分子 量的姬松茸多糖。 权 利 要 求 书 CN 103239467 B 2 1/6 页 3 姬松茸多糖及其制备方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种姬松茸多糖的提取纯化方法及其质量控制方法， 本发明还涉及该 多糖药物的制备方法。 背景技术 ： 000。
6、2 姬松茸 ( 又名巴西蘑菇 )， 学名为 Agaricus blazei murrill， 原产巴西、 秘鲁， 有 些直销业者称之为巴西蘑菇， 姬松茸是一种来源于自然生长在巴西圣保罗郊外山间的菌 类， 属名贵食用菌， 具药用价值。巴西蘑菇的神奇早在一九六年就被巴西日裔移民古本 隆寿发现， 由于当地的居民疾病罹患率极低， 古本隆寿推测是长期食用巴西蘑菇的结果， 因 此将这种菇菌引进日本， 送到日本三重试岩出菌学研究所， 请所长岩亥之助研究， 后来经 由多项实验证实确有抗癌、 提升免疫力的效果， 因而声名大燥。姬松茸新鲜子实体含水分 85 -87， 可食部分每 100 克干品中含粗蛋白 40-4。
7、5 克、 可溶性糖类 38-45 克、 粗纤维 6-8 克、 脂肪 3-4 克、 灰分 5-7 克 ； 蛋白质组成中包括 18 种氨基酸， 人体的 8 种必需氨基酸齐全， 还含有多种维生素和麦角甾醇。其所含甘露聚糖对抑制肿瘤 ( 尤其是腹水癌 )、 医疗痔瘘、 增强精力、 防治心血管病等都有疗效。其所含甘露聚糖对抑制肿瘤 ( 尤其是腹水癌 )、 医疗 痔瘘、 增强精力、 防治心血管病等都有疗效。 0003 姬松茸具有多种生物功能， 增强免疫系统功能， 降血糖、 降血脂、 调节血压、 改善肝 功能、 抗过敏反应等。抗肿瘤及增强免疫功能主要来自多糖体， 姬松茸含有活性多糖体， 具 有扶正固体、 增。
8、强人体免疫力等功效。姬松茸的多糖体含量高达 6.55g/100g， 是灵芝的 5 倍。独特的 -(1-6)-D- 葡萄糖结构直接作用于免疫力， 可快速提升自然免疫细胞的生长 活性， 辅助提高治疗效果。 姬松茸的保健作用是日本多家医疗单位的试验结果所证明的。 姬 松茸的多糖体能与许多氨基酸结合， 容易被人体的消化器官所吸收。 0004 姬松茸含有多种活性多糖， 其组份比灵芝高出 5 倍。目前已知在姬松茸的菌丝体 中发现约 10 多种多糖。用动物实验比较各种多糖的作用， 表明其中不少多糖均有抗瘤作 用， 以 B-D- 葡聚糖和蛋白结合的复合体作用最强， 对 S180 抑制率达 99， 而 a- 葡。
9、聚糖及 半乳糖葡聚糖也达 90以上。如与丝裂霉素 C 合并应用， 可达 100。此外， 除多糖外， 姬松茸的脂肪酸， 类固醇亦有提高免疫力作用。动物实验表明， 在 10 多种菌类 ( 包括灵芝， 猪苓等 ) 中， 姬松茸的作用最为显著。 0005 姬松茸所含 -(1-6)-D- 葡聚糖蛋白复合体是其它菌类所没有的， 它对癌症抑制 率是 99.4， 痊愈率达 90， 高于灵芝的功效 4.5 倍。姬松茸对多种肿瘤细胞有明显的抑 制作用， 如白血病、 胃癌、 肝癌、 食道癌、 结肠癌、 肺癌、 骨癌、 乳腺癌、 子宫癌、 前列腺癌、 膀胱 癌、 脑癌等。它还被作为保健品被人们服用。在日本、 美国、 。
10、巴西等国有大量的与姬松茸有 关的保健食品， 如从姬松茸子实体中提取的多糖制成的胶囊和将子实体进行粉碎后制成的 代茶冲泡饮料等， 在国际市场销路都很好。我国对姬松茸的研究起步很晚， 近年来， 我国一 些学者也开始对姬松茸多糖的提取方法、 液体发酵和生物活性进行初步研究， 并开发出口 服液、 颗粒剂等产品， 但种类较少。 说 明 书 CN 103239467 B 3 2/6 页 4 0006 为了更好的开发利用姬松茸的药用价值， 本发明对其活性多糖体的提取和分离纯 化进行了深入研究， 提供了一种均一分子量姬松茸多糖及其制备方法、 质量控制方法。 能够 更有效的保障姬松茸多糖产品的质量稳定和开发利用。
11、。 0007 查阅专利数据库， 未见有与本发明相类似的姬松茸均一分子量多糖的制备方法和 质量控制方法。 发明内容 ： 0008 本发明的目的之一是提供一种姬松茸多糖药物组合物。 0009 本发明的另外一种目的是提供该药物组合物的制备方法。 0010 本发明的目的还在于提供该药物组合物的一种质量控制方法。 0011 本发明所述的药物组合物是由药效成分或药效成分和药学上可接受的载体组成， 其中制备所述药效成分的原料为 ： 0012 姬松茸总多糖 ： 0013 制备过程为 ： 姬松茸子实体除杂， 称量， 粉碎， 预处理， 回流提取， 滤过， 滤渣复提， 浓缩， 醇沉， 滤过离心， 醇沉物加水复溶， 。
12、即得姬松茸总多糖。具体操作为姬松茸粉碎过筛 (10-20 目 ) 加入 8 倍量水， 沸石 10 粒， 物料提取前用微波预处理 8-12 分钟提高得率， 煮沸 回流， 1 小时， 过滤， 提取 2 次， 提取液合并， 加入提取液体积 2/3 的 95乙醇， 真空浓缩， 过 滤并进行高效离心， 沉淀物在 50干燥， 干燥物在 280nm， 260nm 测定吸收度， 发现有紫外吸 收， 说明有蛋白存在。多糖用 Sevage 法除蛋白， 条件为 ： 振荡时间为 30min， 氯仿正丁醇 3 1， 样品氯仿正丁醇 3 V( 氯仿 ) V( 正丁醇 ) 4 1， 离心， 水溶液用 紫外光谱检测， 不含蛋。
13、白质， 然后， 30 H2O2脱色， 得到姬松茸总多糖。 0014 优选 ： 0015 均一分子量的姬松茸多糖， 制备过程为 ： 取上述姬松茸总多糖， 稀释， 膜超滤纯化， 阴阳离子交换树脂法脱蛋白， 分级醇沉和凝胶过滤层析， 冷冻干燥， 即得均一分子量的姬松 茸多糖。具体为取姬松茸总多糖稀释 15 倍， 5104相对分子质量膜超滤， 压力为 0.4M Pa， 取相对分子质量小于 5104部分， 依次上 DEA E Sepharose 柱和 Sephadex G25 柱， 不同浓 度的 NaCL 水洗脱， 苯酚 - 硫酸法检测， 合并峰位， 收集流出物为单一色谱峰的物质， 冷冻干 燥， 即得均。
14、一分子量的姬松茸多糖。 0016 所述药效成分可以与药学上可接受的载体或赋形剂制成各种药学剂型， 如丸剂、 片剂、 口服液、 颗粒剂、 胶囊、 软胶囊、 注射液、 粉针剂等， 片剂包括普通片剂、 塑制片、 分散片 等。其中所述的药学上可接受的载体或赋形剂根据不同的剂型而选择。 0017 姬松茸多糖的结构鉴定 0018 采用旋光度法和凝胶过滤法来检测多糖组分的纯度， HPLC 法测定组分的分子量， 用柱后荧光衍生化方法、 酸水解法、 红外光谱和核磁共振等方法来测定多糖组分的结构。 见 附图 1 0019 1.1 姬松茸多糖组分的纯度检测方法 ： 0020 将多糖样品溶于适量的水， 置于电磁搅拌器。
15、上， 在搅拌下滴加乙醇， 使溶液中的乙 醇浓度为20， 再搅拌片刻， 使沉淀完全， 离心得到沉淀。 上清液中继续滴加乙醇， 使溶液中 乙醇浓度达到 40， 离心得到沉淀。前后两次沉淀分别经干燥后在相同条件下测定其水溶 说 明 书 CN 103239467 B 4 3/6 页 5 液的旋光度。 0021 将多糖组分配制成一定浓度的溶液， 用示旋光仪测定溶液的旋光度。按下式计算 比旋度 ： aDt 100a/Lc 式中， a 为比旋度 ； D 为钠光谱的 D 线， 589.44nm ； t 为测定时温 度 ； c 为每 100ml 溶液中含有多糖组分的质量 (g， 按干品或无水物计算 ) ； L 。
16、为测定管长度 (cm)。 0022 1.2 姬松茸多糖分子量鉴定方法 ： 0023 用高效液相色谱法测定， 色谱条件 ： 色谱柱为 C18 ； 流动相为水 ； 流速为 1mL/min ； 检测器为示差检测器。 0024 取不同分子量的多糖标准品测定， 用保留时间和已知分子量作标准曲线。得线性 方程为 ： W 98.3t+1980(r 0.9993)， 确定姬松茸多糖的分子量为 5104。 0025 1.3 姬松茸多糖单糖成分鉴定 0026 1.3.1 柱后荧光衍生化方法、 酸水解法 0027 1.3.1.1 测定方法 0028 用柱后荧光衍生化方法测定。色谱柱 ： Lichrosorb NH2。
17、柱串联 Hypersil APS 柱 ； 流动相 ： 85乙腈水溶液 ； 体积流量 ： 016mL/min ； 衍生化试剂 ： 50mmol/L 盐酸胍的 0.2mol/ L NaOH 溶液， 流速 ： 0.3mL/min ； 柱温 ： 室温 ； 反应温度 ： 80。 0029 1.3.1.2 样品处理方法 0030 姬松茸多糖经 0.05mol/L 三氟乙酸 (TFA)110封管水解 2、 3、 4、 5 或 6h， 或 2mol/ LTFA 110封管水解 2h， 水解液减压浓缩至干， 再加甲醇 3mL， 蒸干， 重复 3 次， 以除尽 TFA。 加少量水溶解水解产物， 过 0.45m 微。
18、孔滤膜， 取滤液 20L 用于液相分析， 与果糖、 葡萄 糖、 半乳糖、 甘露糖、 木糖、 阿拉伯糖和鼠李糖对照品的色谱图比较确定单糖的种类。 0031 当水解条件为 0.05mol/L TFA 110封管水解 5h 时， Shodex Sugar KS-802 凝胶 柱分析表明姬松茸多糖已完全水解， 所得水解产物仅略显淡黄色， 此时的色谱峰高比可近 似地代表果糖和葡萄糖在姬松茸多糖的中所占的比例， 经计算得姬松茸多糖中果糖与葡萄 糖的摩尔比为 6 1， 可见该姬松茸多糖为均一分子量多糖。 0032 1.3.2 红外光谱 0033 溴化钾压片， 傅里叶红外检测。通过红外光谱图和甲基化分析可知，。
19、 具有多糖特 征 ： 在 3500 3200cm-1出现的峰是 O-H 键的伸缩振动， 2900cm-1出现的峰为 C-H 键的伸缩 振动， 2100cm-1出现的峰为 C 三 C 键的伸缩振动， 1850cm-1出现的峰为 C C 键的伸缩振动 峰， 1650cm-1出现的峰为CO键的伸缩振动峰， 1400cm-1出现的峰为C-H的变角振动， 它和 C-H 键的伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰， 1200 1000cm-1之间的吸收峰是由两种伸缩 振动形成的， 一种是C-O-H， 另一种是C-O-C， 890cm-1处的吸收峰是-吡喃糖苷键的特征吸 收峰， 840cm-1处有吸收峰表明该多糖具。
20、有型糖苷键， 800cm-1处无吸收峰表明该多糖不含 甘露糖。 特征波长集中在832833cm-1， 878900cm-1， 12001000cm-1， 16341639cm-1， 1848 1852cm-1和 2184 2190cm-1这些波段， 可以基本确定含有果糖和葡萄糖， 后经水解 验证为果糖与葡萄糖摩尔比为 6 1 为主组成的均一多糖。 0034 1.3.3 核磁共振 0035 姬松茸多糖溶解于含有少量的 DMSO 的水溶液中， 1H NMR 谱中在异头氢区无强信 号， 这再次说明该多糖为果聚糖， 因为果糖是酮糖， 其 2 位异头碳上没有质子。氢谱中有一 说 明 书 CN 10323。
21、9467 B 5 4/6 页 6 个较弱的异头信号， 来源于姬松茸多糖中的微量葡萄糖基。 0036 姬松茸子实体多糖均一组分的 1HNMR 谱异头氢区域 4.5-5.4 只含有一个质子 信号， 位于 4.69 ； 13CNMR 谱的异头碳区域在 103.30 有一强的碳信号。由于在碳谱中 179.8、 182.3 出现可能是羰基的共振吸收峰， 39.1、 39.5 处出现多键的信号峰。所以判 定其由葡萄糖和果糖残基构成。 0037 姬松茸多糖的药剂学实验 0038 根据姬松茸多糖的理化性质， 进行了片剂和胶囊剂的研究。首先对填充剂、 崩解 剂、 粘合剂及润滑剂进行筛选， 通过崩解时限、 溶出度。
22、确定处方， 以片剂为例如下 ： 0039 2.1 处方如下 ： 0040 0041 2.2 制备工艺及工艺流程图 0042 (1) 工艺 0043 原辅料准备 ： 姬松茸多糖、 羟丙甲基纤维素、 微晶纤维素和乳糖分别过 100 目筛， 硬脂酸锌过 80 目筛， 备用 ； 0044 混料 ： 称取处方量的姬松茸多糖、 乳糖、 羟丙甲基纤维素、 微晶纤维素按等量递增 法混匀， 然后再与硬脂酸锌混匀， 备用 ； 0045 制粒 ： 将混料用干法制粒机压大片， 再用 18 目筛制粒， 备用 ； 0046 压片 ： 测定中间体含量， 分别用 浅凹冲压片 ； 0047 包装 ： 成品检验合格后， 双铝包装。
23、。 0048 (2) 工艺流程 ( 见图 2) 0049 2.3 质量标准和稳定性研究 0050 根据 中药质量控制分析方法验证技术指导原则 及 中药质量标准建立的规范化 过程技术指导原则 中的基本要求， 对姬松茸多糖片的外观、 片重差异、 溶出度、 含量等进行 了系统研究试验， 并初步确定各相应的质量标准及相应控制指标， 为以后有效控制产品质 量提供科学依据。 0051 姬松茸多糖的溶出和含量测定均选用目前比较成熟的蒽酮-硫酸比色法(以葡萄 糖为对照品， 采用蒽酮 - 硫酸比色法， 在 580nm 处测定姬松茸多糖的含量 ) 同时进行了必要 的方法学验证内容。 0052 2.3.1 方法学验。
24、证内容 0053 (1) 对照品溶液储备液的制备 0054 精密称取 105干燥至恒重的无水葡萄糖对照品约 25mg， 置于 25mL 容量瓶， 加蒸 馏水至刻度， 摇匀， 制成约 1mg/mL 的对照品储备液。 0055 (2) 供试品溶液储备液的制备 说 明 书 CN 103239467 B 6 5/6 页 7 0056 精密称取姬松茸多糖片 ( 相当于姬松茸多糖 100mg) 置 100mL 圆底烧瓶中， 加水 50mL， 超声溶解， 放冷， 稀释到刻度， 作为储备液。 0057 (3) 检测波长的选择 0058 精密吸取对照品溶液储备液和供试品溶液储备液各 1.0mL 分置 10mL 。
25、棕色具塞试 管中， 分别加入 0.2蒽酮 - 硫酸溶液 4.0mL， 混匀， 迅速置冰水浴中冷却 6min 后， 置 100 水浴中加热 10min， 取出置冰水浴 5min 后室温放置 10min， 于 400 800nm 范围内进行光谱 扫描， 结果表明 ： 对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为 580nm。 0059 (4) 标准曲线的绘制 0060 精密吸取对照品储备液1、 2、 3、 5、 10mL分别置于10mL量瓶中， 加蒸馏水至刻度， 摇 匀。精密吸取上述各溶液 1.0mL 置 10mL 棕色具塞试管中， 照检测波长项下操作， 580nm 处 测定吸光度值。以吸光度 A 为。
26、纵坐标， 浓度 C 为横坐标绘制标准曲线， 求得回归方程为 A 6.2136C+0.0326， r 0.9998。线性范围 0.010 0.100mg/mL。 0061 (5) 精密度试验 0062 取浓度为 0.050mg/mL 的标准品溶液， 重复测定 6 次， 记录其吸光度值， RSD 为 0.032， 结果表明仪器的精密度良好。 0063 (6) 稳定性试验 0064 精密吸取样品储备液溶液1.0mL置10mL棕色具塞试管中， 照检测波长选择项下操 作， 分别于 0、 2、 4、 6、 8h 测定其吸光度值， RSD 为 0.763， 结果表明 ： 本法所测样品在 8h 内 稳定。 0。
27、065 (7) 重复性试验 0066 分别精密称姬松茸多糖片平行 6 份， 按检测波长选择项下操作， 测定吸光度值， 计 算姬松茸多糖的百分含量， 得平均含量为 93.2， RSD 为 0.97， 结果所测样品的重复性良 好。 0067 (8) 精密度试验 0068 精密称取姬松茸多糖按照处方量 100、 80和 120加入相应的辅料， 分别取样 3 份， 按照检测波长选择项下操作， 测定 9 份样品吸光度值并计算回收率， 得平均回收率为 99.06， RSD 1.03 0069 2.3.2 样品含量测定 0070 取姬松茸多糖片按 “供试品溶液储备液” 项下方法制得供试品溶液。精密吸取上 述。
28、各供试品溶液1.0mL置10mL棕色具塞试管中， 照检测波长选择项下操作， 测定吸光度值， 按标准曲线法计算姬松茸多糖的标示含量。 0071 2.3.3 姬松茸多糖片的溶出度测定 0072 姬松茸多糖溶出度方法学验证参照姬松茸多糖含量测定法进行了溶出度方法学 验证内容的研究， 并确定溶出度方法为 ： 篮法100转/分， 在30分钟取样， 溶出均大于85。 0073 2.3.4 姬松茸多糖片稳定性研究 0074 按照上述处方和工艺， 分别制备 3 批， 每批 500 片的姬松茸多糖片， 进行影响因素 试验、 加速和长期稳定性研究。 0075 影响因素试验结果表明 ： 该制剂为湿和热比较敏感， 高。
29、湿 ( 相对湿度 92.5 ) 和 高热 (60 )， 样品的外观有些变黄， 硬度明显增大， 溶出相对减慢， 但是在相对湿度 75和 说 明 书 CN 103239467 B 7 6/6 页 8 40条件下， 经过 10 天影响因素试验研究样品的质量未发生明显的变化， 提示该品种需要 低温密封保存。 0076 目前进行完加速和长期试验 3 个月， 样品的各项检测指标均未发生明显的变化。 0077 同期我们也进行了姬松茸多糖胶囊的研究和考察。结果显示 ： 姬松茸多糖两种制 剂的处方、 工艺可行， 质量标准可控， 可用于工业化大生产。 附图说明 0078 图 1 是姬松茸总多糖的 HPLC 图谱 0079 图 2 是姬松茸多糖片的制备工艺流程图。 说 明 书 CN 103239467 B 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103239467 B 9 2/2 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103239467 B 10 。