技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体是基因治疗领域，更具体的是let-7/miR-98家族在制备治疗FAS基因相关疾病的药物中的应用。
背景技术
Fas(又称CD95)是一细胞膜表面分子，Fas、FasL以膜分子或可溶性分子存在。Fas与FasL结合可引起Fas阳性细胞发生凋亡，这一信号途径受细胞内外许多因子的调控。Fas、FasL及相关调控因子组成Fas系统，具有重要的生物学功能，尤其在免疫系统的发育、分化和成熟以及保持其功能稳定性方面发挥重要作用。当Fas系统功能发生障碍时，活化的T细胞就会堆积在体内，引起自身免疫性疾病。lpr为MRL品系Fas基因编码缺失型基因突变株小鼠，体内Fas表达缺陷，可引起自身反应性T细胞的蓄积和自身抗体的产生，导致出现系统性红斑狼疮等自身免疫病[1]。
在肿瘤细胞中，Fas表达下降，直接参与或间接促进了肿瘤逃避机体免疫系统的监视。乳腺癌Fas表达失调不仅参与了肿瘤的免疫逃逸和免疫耐受，还与肿瘤的浸润密切相关[2]。胰腺癌Fas表达的丢失与胰腺细胞的恶性转化和生物学侵袭行为相关，并可抵抗凋亡，逃避机体免疫监视[3]。Fas/FasL信号调节网络在设计药物或基因治疗上具有一定的前景。Chopin[4]等报道，丁酸钠可增加乳腺癌细胞系MCF-7的Fas表达水平，从而使肿瘤细胞的凋亡增加。Yoshimoto[5]等报道：阿霉素在活体内能诱导路易斯肺癌Fas表达增加，使肿瘤细胞对Fas介导的凋亡更敏感。
有文章报道风湿病患者淋巴细胞表面Fas及血清中的可溶性FAS明显增加，并与疾病的活动性及脏器损伤相关，特别是在系统性红斑狼疮(SLE)及类风湿性关节炎(RA)中[6-10]。在SLE中过度表达的FAS使细胞凋亡产物如核小体等自身抗原清除障碍，刺激致病性TH细胞和B细胞，产生大量的自身抗体，进而诱发自身免疫病的发生及病情的恶化。针对FAS通路的各种生物制剂在RA动物模型及人体 试验中均显现出治疗效果。此外现已应用于治疗RA的肿瘤坏死因子阻断剂能够诱导滑膜细胞的凋亡，这一作用至少一部分是由FAS介导的[11-13]。
Lee等研究发现，体外培养的小鼠肾癌细胞经IFN-γ和TNF-α仅处理后其Fas表达上调，对Fas介导的凋亡作用变得敏感[14]。Chen等报道激活的巨噬细胞所分泌的TNF-α、IFN-γ能上调脑胶质瘤细胞Fas及FasL的表达，增加肿瘤细胞凋亡[15]。Longley等发现，氟尿嘧啶使乳腺癌细胞和结肠癌细胞的Fas表达上调，增强了Fas系统介导的凋亡[16]。Aragane等Fas表达质粒直接注入瘤体内，28d后发现瘤体重量明显轻于对照组[17]。
因此，在本领域中，已经普遍公认FAS直接介导肿瘤的致病和转移。研究人员通过实验也揭示了调控Fas对于治疗肿瘤有直接的联系。因此，开发Fas调节剂对于治疗肿瘤疾病有重大意义。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约21-25nt的不编码蛋白质的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。目前研究显示miRNA参与了生物体发育、分化、生长、免疫应答等生理过程，且其表达及功能失调可能导致肿瘤发生，自身免疫性疾病以及病毒感染等多种病理现象。
成熟的miRNA可与其他蛋白质一起组成RISC(RNA-Induced silencingcomplex)复合体，通过核酸序列互补与靶基因mRNA结合以发挥抑制靶基因mRNA翻译或降解靶基因mRNA的作用[18]。不同于以往的有或无的调节特点，miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节。这一特点是siRNA单靶点强大的调节作用或一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的。这展示了miRNA在临床应用方面的巨大前景。
let-7/miR-98家族是一组序列高度同源，功能相似的miRNA，包括miR-98，let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g，let-7i。let-7/miR-98家族在物种间高度保守，某些成员受甲基化、转录后修饰及Lin28基因的调控，同时也调节RAS、MYC、HMGA2、CDC25A、CDK6等靶基因，与生命中的多种的生物学现象和生理过程息息相关，特别是在生物发育、细胞增殖与分化以及肿瘤相关方面的作用尤为突出。人体内let-7/miR-98家族成员表达失调参与一些疾病的发生发展，比如miR-98异常表达在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、骨关节炎中起着一定的作用 [19-30]。
到目前为止还没有miRNA能调节FAS的相关报道。对于let-7/miR-98家族的miRNA的功能也缺乏清楚的了解。因此，本领域仍然对于调节FAS的新靶点和手段有迫切的需要。
发明内容
本研究首次证实let-7/miR-98可直接抑制FAS的表达，这为调节Fas/FasL信号网络提供了新的靶点和手段。
因此，本发明的一个目的是提供新的治疗FAS相关疾病的药物。
在一个方面，提供了let-7/miR-98家族miRNA或其调节剂在制备治疗FAS基因相关疾病的药物中的用途。在该方面的一个具体实施方式中，FAS基因相关疾病是由于FAS基因过度表达引起的，所述疾病是自身免疫性疾病，选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和骨关节炎。在另一个具体实施方式中，FAS基因相关疾病是由于FAS基因表达被抑制引起的，所述疾病是肿瘤，特别是癌症，特别选自乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔癌，肺癌。
在该方面的一个具体实施方式中，let-7/miR-98家族miRNA选自miR-98，let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g，let-7i。
在该方面的另一个具体实施方式中，上述调节剂选自抑制剂和增效剂。特别是抑制剂是反义核酸序列。
在另一个具体实施方式中，增效剂是模拟核酸。
特别是，增效剂选自以下模拟核酸：
Hsa-miR-98模拟核酸(双链)：5’UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU3’
3ACUCCAUCAUUCAACAUAACAA5
Hsa-let-7d模拟核酸(双链)：5’AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU3’
3UCUCCAUCAUCCAACGUAUCAA5
Hsa-let-7g模拟核酸(双链)：5’UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU3’
3ACUCCAUCAUCAAACAUGUCAA5
特别是，抑制剂选自以下抑制核酸：
Hsa-miR-98抑制核酸(单链)：5’AACAAUACAACUUACUACCUCA3’
附图说明
图1是let-7/miR-98及miR-23与FAS基因3’UTR二级结构的结合部位。
图2A显示了miRNA对于FAS蛋白的影响。图2B显示了miR-98的模拟核酸和抑制核酸对其表达的作用。
图3A-D显示了miR-98对FAS基因表达的影响。
图4A-E显示了let-7/miR-98对FAS基因3′UTR及其突变体的作用。其中图4A显示了各家族成员的序列、与FAS 3′UTR作用的位点。图4B显示了报告基因载体psiCHECKTM-2的图谱。图4C显示了let-7d、let-7g和miR-98模拟核酸对于FAS 3′UTR及其突变体的表达的影响。图4D显示了miR-98模拟核酸对FAS基因的调节作用。图4E显示了miR-98抑制核酸对FAS基因的调节作用。图4F显示了miR-98模拟核酸对FAS基因的调节作用有浓度依赖性。
图5A显示了流式细胞计数分析miR-98对细胞凋亡的作用。其中可见miR-98模拟核酸对凋亡有明显抑制作用，而miR-98抑制核酸对凋亡有明显促进作用。图5B显示了miR-98模拟核酸/抑制核酸及相关对照对Hela细胞凋亡率的影响。注：Q1代表坏亡的细胞，Q2代表坏死加晚期凋亡的细胞，Q3代表活细胞，Q4代表凋亡的细胞，*：p＜0.05，**：p＜0.001。
具体实施方式
miRNA的模拟核酸是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA抑制核酸是化学修饰的专门针对细胞中特异性的靶miRNA的抑制剂，在此使用了原RNA序列的反义序列。
人工合成的miRNA已经成功应用于沉默预期靶基因表达及其功能研究。miRNA模拟核酸能够进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内蛋白的表达量，进行功能获得性研究。相反，使用化学合成的方法合成miRNA抑制核酸，特异的靶向抑制单个的miRNA分子，可以削弱内源miRNA对特定基因的沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性研究，可用来筛选miRNA靶点，筛选调控某一基因表达的miRNA，筛选影响细胞发育过程的miRNA。化学合成的miRNA模拟核酸和抑制核酸已经成为研究动植物基因家族的功能的有用工具，并且也是癌症治疗和临床研究的一种新策 略。
序列分析表明，至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关，而且越来越多的试验也证明miRNA还有许多功能未被发现。研究基因的功能通常是将其从基因组中敲除，然后观察敲除前后的变化，但在miRNA的功能研究中，研究人员一般采用增强或减弱该miRNA的表达来鉴定其功能。
miRNA的模拟核酸和抑制核酸可以从各生物公司购得。例如，本文所用的Thermo SCIENTIFIC公司，或如广州锐博生物科技有限公司等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1miR-98的计算机预测靶位
miR-98及miR-23的结合部位的计算机预测分析：
miR-23是一种与神经元生长有关的微小RNA。用生物信息学TargeScan(http://www.targetscan.org)分析显示let-7/miR-98和miR-23a/b可调节FAS基因的表达，其结合部位分别存在于FAS基因3’UTR二级结构的茎环结合部位和茎干部位(见图1)。图1显示了let-7/miR-98及miR-23与FAS基因3’UTR二级结构的结合部位。let-7/miR-98与FAS基因3’UTR二级结构的结合部位存在于FAS基因3’UTR二级结构的茎环结合区，而miR-23与FAS基因3’UTR二级结构的结合部位存在于FAS基因3’UTR二级结构的茎干区。有报道提示miRNA靶基因3’UTR二级结构影响miRNA与靶序列的结合，如果靶序列位于二级结构的环形区域则利于miRNA结合到靶序列，而如果靶序列位于茎干区域则不利于miRNA发挥作用[31]。miR-98与miR-23a/b对FAS基因的不同影响可能源于其靶序列二 级结构的差异。在此，申请人进一步测试了它们的实际对FAS蛋白的影响。
实施例2.流式细胞计数分析微小RNA对FAS蛋白的影响
(1)细胞培养：Hela细胞Hela细胞来源于美国菌种保藏中心(ATCC)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞所。用DMEM加10％胎牛血清培养以及100U/ml青霉素-链霉素培养，37℃5％CO2孵育，2～3天换液一次。
(2)细胞转染：转染前一天将2×105个细胞均匀接种在6孔细胞培养板中。第二天转染时每孔细胞的覆盖率应为30-50％；用Lipofectamine 2000Reagent(Invitrogen公司)转染miR-98、miR-23a/b的模拟核酸和抑制核酸，以及对照。这些核酸序列如下：
Hsa-miR-98模拟核酸(双链)：5’UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU3’
3ACUCCAUCAUUCAACAUAACAA5
Hsa-miR-98抑制核酸(单链)：5’AACAAUACAACUUACUACCUCA3’
Hsa-miR-23a模拟核酸(双链)：5’AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC3’
3UAGUGUAACGGUCCCUAAAGG5
Hsa-miR-23a抑制核酸(单链)：5’GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU5’
Hsa-miR-23b模拟核酸(双链)：5’AUCACAUUGCCAGGGAUUACC3’
3UAGUGUAACGGUCCCUAAUGG5
Hsa-miR-23b抑制核酸(单链)：5’GGUAAUCCCUGGCAAUGUGAU3’
所有实验和以下各实施例中采用的对照序列如下：
模拟对照(双链)：5’UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA3’
3AGUGUUGGAGGAUCUUUCUCAUCU5
抑制对照(单链)：5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3’
以上产品均购于Thermo SCIENTIFIC公司，终浓度为100nM。
(3)流式细胞仪检测FAS抗原的表达：
调整Hela细胞浓度为5×105/mL，用染色缓冲液(PBS pH7.4，含2％灭活胎牛血清，0.1％叠氮钠)洗2次，以阻止非特异性结合。加入用APC标记的抗鼠抗人 FAS McAb(购于eBioscience公司)工作液10μL，冰上孵育30min，染色缓冲液洗2次；最后用200μL固定液重悬细胞上机进行检测。每批标本均设阴性对照和同型对照。进行流式细胞计数测定细胞膜上FAS抗原表达的荧光强度。
图2A显示了微小RNA对FAS蛋白表达的影响。MFI是平均荧光强度。从图中可见，miR-98的模拟核酸和抑制核酸对于FAS的表达都起到了作用。miR-98的模拟核酸能刺激miR-98的过表达，而使得FAS的表达下降；而miR-98的抑制核酸能够抑制miR-98的活性，从而使得FAS的荧光强度上升。而miR-23a/b无论是抑制剂或者是模拟核酸都对于FAS的表达没有明显影响。这和实施例1中的预测结果也是相一致的。
(4)模拟核酸和抑制核酸对于miR-98表达的作用：
转染前一天将2×105个Hela细胞均匀接种在6孔细胞培养板中。第二天转染时每孔细胞的覆盖率应为30-50％；用Lipofectamine 2000Reagent转染miR-98模拟核酸和抑制核酸及如上对照序列，使其终浓度为100nM。转染48小时后用0.5mlTrizol处理细胞并用酚氯仿法抽提Trizol(Invitrogen公司产品)总RNA，紫外分光光度计测定其浓度。用TaqMan Human microRNA Assays Kit(美国应用生物系统公司)将100ng RNA逆转为特异性cDNA，并用miR-98、U48(内参)特异性探针(美国应用生物系统公司)在ABI Prism7900高通量荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)上检测miR-98及U48表达。结果见图2B，可见在模拟核酸的存在下，miR-98的表达提高，而在抑制核酸的存在下，miR-98的表达下降。
实施例3miR-98对FAS基因表达的影响
如实施例2所述，在Hela细胞中转染miR-98模拟核酸使miR-98高表达，转染miR-98抑制核酸抑制miR-98的功能。48小时后，用聚合酶链反应(RT-PCR)的方法来研究miR-98对内源性FAS mRNA的影响。
(1)miR-98的RT-PCR定量：
miR-98逆转录引物和Real-time PCR反应探针直接从ABI(Applied Biosystems公司)购买获得。靶基因定量引物以核糖体蛋白L13a(RPL13A)作为内参照基因，以Oligo 6.71软件设计扩增模板的引物如下：FAS正义链5′accaaggttctcatgaatctcc3 ′，反义链5′tgactccagcaatagtggtgata3′；由上海生工公司合成。RPL13A引物正义链5′CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA3′，反义链5′TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA 3′，也为上海生工公司合成。
(2)RNA抽提和逆转录：转染48小时后用0.5ml Trizol(Invitrogen)抽提总RNA，紫外分光光度计(nanodrop ND-1000)测定其浓度。总RNA用oligo dT逆转录，使用Primescri pt RT Reagent kit(TaKaRa公司)逆转录为cDNA。
(3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)：在ABI Prism7900(Applied Biosystems公司)上进行实时荧光定量PCR操作。FAS基因SYBR Green定量反应条件为95℃×15s，然后95℃×5s和60℃×30s进行40个循环，接着95℃×15s，60℃×15s 95℃×15s。
图3显示了miR-98对FAS基因表达的影响。如图3所示，A：过表达miR-98可抑制FAS mRNA的表达。B：降低miR-98的表达可增加FAS mRNA的表达。C：过表达miR-98对FAS蛋白的抑制作用。D：降低miR-98增加FAS蛋白的表达。E：平均荧光强度分析显示过表达miR-98可降低FAS蛋白的平均荧光强度，降低miR-98增加FAS蛋白的平均荧光强度。注：＊：p＜0.05，＊＊：p＜0.001。
实施例4双荧光报道基因系统检测let-7/miR-98家族成员对FAS基因的调节作用
(1)将含有let-7/miR-98结合位点的FAS基因mRNA 3UTR片段克降插入到psiCHECK□-2载体(见图4A和图4B)：
首先设计PCR扩增引物(正义链：5一CCA CTC GAG CTA TCC ACA GGCTAA CCC CA一3，反义链：5一TAG CGG CCG CGG GTG GGG GAA AAATAA GAA一3，对FAS基因进行PCR扩增。克隆出一段635bp大小的DNA片段。经限制酶(not1和xho1)切割后插入到psiCHECK□-2载体中。
(2)通过点突变的方式得到FAS 3UTR突变载体：
突变克隆的正义链为：5一AGA ATT TAA ATA AGA ATA TAA TCA TAAGAC CTT TGC ACA一3，反义链为：5一TGT GCA AAG GTC TTA TGA TTA TAT TCT TAT TTA AAT TCT一3。
(3)转染细胞：
将Hela细胞以2×104个细胞/孔接种于96孔板，24h后使用Lipofectamine2000Reagent将let-7d、let-7g、miR-98模拟核酸、miR-23的模拟核酸及相关对照和步骤(1)和(2)中得到的FAS基因mRNA 3UTR载体共同转染于细胞，具体方法见Invitrogen的产品说明。再过24小时用CENTRO XS3 LB 960(BERTHOLDTECHNOLOGIES公司)进行检测，具体操作步骤参照CENTRO XS3 LB 960产品说明。
上述let-7d、let-7g的模拟核酸序列如下：
Hsa-let-7d模拟核酸(双链)：5’AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU3’
3UCUCCAUCAUCCAACGUAUCAA5
Hsa-let-7g模拟核酸(双链)：5’UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU3’
3ACUCCAUCAUCAAACAUGUCAA5
采用模拟对照序列作为对照。
图4A显示了let-7/miR-98家族的各个成员的序列以及与FAS 3′UTR结合的位点。结果显示，过表达这些miRNA可降低FAS3’UTR克隆质粒的荧光值(见图4C)。然而，采用miR-23的模拟核酸和抑制核酸对Fas的表达没有任何效果(图2A)。
(4)miR-98对FAS基因的调节作用：
如上用相同的方法，使用miR-98模拟核酸和抑制核酸与FAS3′UTR报告质粒共转染Hela细胞。miR-98模拟核酸引起的过表达导致FAS荧光大大减弱，抑制核酸则升高FAS 3′UTR克隆质粒的荧光值。而使用3′UTR突变体时，这种效应恢复(见图4D和4E)。使用不同浓度的miR-98模拟核酸转染，则明显对FAS荧光的抑制有浓度梯度效应(图4F)。以上结果说明，miR-98能直接调节FAS的表达。
实施例5miR-98对凋亡的影响
在来自实施例2的Hela细胞中，48小时后加入LEAF纯化抗人CD95抗体(购自BiolLegend)诱导细胞凋亡，终浓度为2.5μg/ml。12小时后用ApoScreen锚定蛋白(Annexin)V凋亡试剂盒(购自Southern Biotech)检测细胞凋亡。
结果显示过表达miR-98可以抑制细胞凋亡，而抑制miR-98可增加细胞的凋亡(见图5)。
讨论
上述研究证实，let-7/miR-98家族可以直接作用于FAS 3’UTR，调节FAS基因的表达，并影响FAS介导的细胞凋亡。分析公共数据我们发现let-7/miR-98家族的表达和FAS的表达负相关：let-7/miR-98在SC1型细胞中低表达，在SC2型细胞中高表达，而FAS则在SC1型细胞中高表达，在SC2型细胞中低表达[28]。这与我们发现的let-7/miR-98家族负向调节FAS是一致的。由此，可利用let-7/miR-98家族对FAS的调节作用治疗凋亡和自身免疫相关的疾病。
引用文献
[1]Watanabe-Fukunaga R，Brannan Cl，Copeland NG，et al.介导凋亡的Fas抗原中的缺陷解释了小鼠中的淋巴增殖疾病(Lymphoproliferation disorder in miceexplained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis).自然杂志1992；356：314 7。
[2]Cian ga C，Cian gaP，CozmaL等，Fas/FasL分子系统在乳腺癌中的rl 1le显著性(rl 1le significance of Fas/FasL molecular system in breast cancer).Chir ScrMed Nat lasi，2004，108(2)：440-444。
[3]Bernstorff，W.V.，等，正常胰腺和胰腺肿瘤中的Fas(CD95/APO-1)和Fas配体表达，免疫豁免和免疫逃匿的推断(Fas(CD95/APO-1)and Fasligand expression innormal pancreas and pancreatic tumors.Implicationsfor immune privilege and immuneescape)，Cancer，2002.94(10)：p.2552-60。
[4]Chopin V，Toillon RA，Jolly N等.丁酸钠诱导p53非依赖的Fas介导的MCF-7人乳腺癌细胞中的凋亡(Sodium butyrate induces p53 independent，Fas.mediated apoptosis in MCF-7human breast cancer cells).Br J pharmacol，2002，135(1)：79-86
[5]Yoshimoto Y，Kawada M，Ikeda D等柔红比星诱导的Fas表达参与柔红比星对体内Lewis肺癌的抗肿瘤作用(Involvement of doxorubicin-induced Fas expression in the antitumor effect of doxorubicin on Lewis lung carcinoma in vivo).IntImmunopharmacol，2005，5(2)：281-288
[6]Nozawa K，Kayagaki N，Tokano Y，Yagita H，Okumura K，Hasimoto H.可溶性Fas(APO-1、CD95)和可溶性Fas配体在风湿病中(Soluble Fas(APO-1，CD95)andsoluble Fasligand in rheumatic diseases).类风湿性关节炎杂志1997；40：1126 9.
[7]Ates A，Kinikli G，Turgay M，Duman M.患有类风湿性关节炎和全身性硬化的病人中血清可溶性Fas的水平(The levels of serum-soluble Fas in patients withrheumatoid arthritis and systemic sclerosis).Clin Rheumatol 2004；23：421 5.
[8]Sahin M，Aydintug O，Tunc SE，Tutkak H，Naziroglu M.自身免疫性风湿病病人中血清可溶性Fas的水平(Serum soluble Fas levels in patients with autoimmunerheumatic diseases).临床生物化学杂志2007；40：6 10.
[9]Cheng J，Zhou T，Liu C等.Fas分子的可溶形式对Fas介导的凋亡的保护(Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule).科学杂志1994；263：1759 62.
[10]Ekaterina Telegina.Tatiana Reshetnyak等Fas配体介导的“反向信号转导”在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的发病中可能的作用(A possible role ofFas-ligand-mediated □reverse signaling□ in pathogenesis of rheumatoid arthritis andsystemic lupus erythematosus).免疫学通信2009：122：12-17
[11]Ohshima S，Mima T，Sasai M等.肿瘤坏死因子α(TNF-α)参与类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞中Fas-介导的凋亡性细胞死亡：一种可能的类风湿性滑膜增生的可能机制和RA抗-TNF-α治疗的临床益处(Tumour necrosis factor α(TNF-α)interferes with Fas-mediated apoptotic cell death on rheumatoid arthritis(RA)synovialcells：a possible mechanism of rheumatoid synovial hyperplasia and a clinical benefit ofanti-TNF-αtherapy for RA).细胞因子2000；12：281 8.
[12]Catrina Al，Trollmo C，af Klint E等.用依那西普和英夫利昔单抗的抗肿瘤坏死因子治疗在类风湿性关节炎关节中诱导巨噬细胞凋亡，而不诱导淋巴细胞凋亡的证据：延伸报告(Evidence that anti-tumor necrosis factor therapy with bothetanercept and infliximab induces apoptosis in macrophages，but not lymphocytes，inrheumatoid arthritisjoints：extended report).类风湿性关节炎2005；52：61 72.
[13]S.L.Peng.Fas(CD95)相关凋亡和类风湿性关节炎(Fas(CD95)-relatedapoptosis and rheumatoid arthritis).风湿病学2006；45：26 30
[14]Lee，J.K.，等，小鼠肾癌细胞中Fas过表达对体内肿瘤进程的IFN-γ依赖性延迟(IFN-gamma-dependent delay of in vivo tumor progression by Fasoverexpression on murine renal cancer cells).J Immunol，2000.164(1)：p.231-9。
[15]Chen，G.G.，等，巨噬细胞诱导的胶质瘤凋亡同时涉及死亡受体依赖性和非依赖性途径(Glioma apoptosis induced by macrophages involves both deathreceptor-dependent and independent pathways).J Lab Clin Med，2003.141(3)：p.190-9。
[16]Longley，D.B.，等，胸腺苷酸合成酶和p53在调节抗代谢物的Fas-介导的凋亡中的作用(The roles of thymidylate synthase and p53 in regulating Fas-mediatedapoptosisin response to antimetabolites).Clin Cancer Res，2004.10(10)：p.3562-71。
[17]Aragane，Y.，等，CD95(Fas/APO-1)基因转移在体内抑制黑素瘤细胞生长(Inhibition of growth of melanoma cells by CD95(Fas/APO-1)gene transfer in vivo).JInvest Dermatol，2000.115(6)：p.1008-14。
[18]Taganov KD，Boldin MP，Baltimore D等，微小RNA和免疫性：大球场上的小玩家(MicroRNAs and immunity：tiny players in a big field)免疫.2007，26(2)：133-137
[19]Pasquinelli，A.E.等.let-7异时性调节RNA的序列保守性和时间表达(Conservation of the sequence and temporal expression of let-7heterochronic regulatoryRNA).自然杂志.2000；408，86 89
[20]Lee，C.T.等.微小RNA调控回路的进化保守性：微小RNA基因复杂性的检测和保守的微小RNA目标在多细胞动物细胞发生过程中的作用(Evolutionaryconservation of microRNA regulatory circuits：an examination of microRNA genecomplexity and conserved microRNA-target interactions through metazoan phylogeny).DNA细胞生物学.2007；26，209 218
[21]Shogo Tokumaru等let-7调节Dicer表达和组成负回馈回路(let-7regulatesDicer expression and constitutes a negative feedback loop)致癌作用.2008；29，2073 2077
[22]Kiefer，J.C.发展中的实验胚胎学(Epigenetics in development).Dev.Dyn.2007；236，1144 1156
[23]Boyerinas，B.等let-7调控的癌胚基因的鉴定(Identification oflet-7-regulated oncofetal genes).癌症研究2005；68，2587 2591
[24]Johnson，S.M.等RAS受到let-7微小RNA家族调控(RAS is regulated bythe let-7microRNA family).细胞2005；120，635 647
[25]Sampson，V.B.等微小RNA let-7a下调MYC并逆转Burkitt淋巴瘤细胞中MYC诱导的生长(MicroRNA Let-7a down-regulates MYC and reverts MYC-inducedgrowth in Burkitt lymphoma cells).癌症研究2007；67，9762 9770
[26]Lee，Y.S.和Dutta，A.肿瘤抑制性微小RNAlet-7抑制HMGA2原癌基因(The tumor suppressor microRNA let-7represses the HMGA2 oncogene).基因发展2007；21，1025 1030
[27]Johnson，C.D.等let-7微小RNA抑制人细胞中细胞增殖途径(The let-7microRNA represses cell proliferation pathways in human cells).癌症研究2007；67，7713 7722
[28]Carla Hebert，等高迁移性组A2是miRNA-98在头颈鳞状细胞癌中的靶标(High mobility group A2 is a target for miRNA-98 in head and neck squamous cellcarcinoma).分子癌症2007；6：5.
[29]Jones SW，等在骨关节组织中差异表达的、调节TNF-α和MMP13产生的微小RNA的鉴定(The identification of differentially expressed microRNA inosteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13).骨关节炎软骨2009；17(4)：464-72.
[30]Bhat-Nakshatri P等雌二醇调节的微小RNA控制乳腺癌细胞中的雌二醇反应(Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells).核酸研究2009；1 12；doi：10.1093/nar/gkp500
[31]Kertesz M，lovino N，Unnerstall U，Gaul U，Segal E.微小RNA鉴定中位点可到达性的作用(The role of site accessibility in microRNA target recognition).自然遗传学.2007；39：1278 1284.doi：10.1038/ng2135
[32]Scott Shell，Sun-Mi Park，AmiR Reza Radjabi等Let-7表达确定了癌症的 两种分化阶段(Let-7expression defines two differentiation stages of cancer).美国国家科学院，2007，104(27)：11400-11405。