本发明涉及无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂用于治疗癌症的联 合疗法。
发明背景
无岩藻糖基化的抗体
单克隆抗体的细胞介导的效应器功能可以通过工程化改造其寡糖组分 来增强，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及 US 6,602,684的。IgG1型抗体（即在癌症免疫疗法中最常使用的抗体）是在 每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于 Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间，与多肽主链形成广泛的接 触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性 (ADCC)是至关重要的(Lifely，M.R.等,Glycobiology 5(1995)813-822;Jefferis, R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76;Wright,A和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15(1997)26-32)。P.等.Nature Biotechnol.17(1999)176-180 和WO 99/54342显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)（一种催化两 分型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提 高抗体的体外ADCC活性。N297碳水化合物的组成变化或其消除也影响Fc结 合FcγR和C 1q(Umana P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;Davies,J.等, Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294;Mimura,Y.等,J.Biol.Chem.276(2001) 45539-45547;Radaev,S.等,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483;Shields, R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Shields,R.L.等,J.Biol.Chem. 277(2002)26733-26740;Simmons,L.C.等,J.Immunol.Methods 263(2002) 133-147)。
Iida,S.等,Clin.Cancer Res.12(2006)2879-2887显示了通过添加岩藻糖 基化抗CD20抑制无岩藻糖基化抗CD20抗体的效力。无岩藻糖基化的和岩藻 糖基化的抗CD20的1:9混合物（10微克/mL）的效力次于单独的无岩藻糖基 化抗CD20的1,000倍稀释液（0.01微克/mL）的效力。他们推断出不包含岩藻 糖基化对应物的无岩藻糖基化IgG1可以经由其高的FcγRIIIa结合而逃避血浆 IgG对ADCC的抑制效果。Natsume,A.等在J.Immunol.Methods 306(2005) 93-103中显示了自人IgG1型抗体的复合型寡糖消除岩藻糖导致抗体依赖性 细胞的细胞毒性(ADCC)的大大增强。Satoh,M.等,Expert Opin.Biol.The r.6 (2006)1161-1173讨论了无岩藻糖基化治疗性抗体作为下一代治疗性抗体。 Satoh推断出认为仅由无岩藻糖基化人IgG1形式组成的抗体是理想的。Kanda, Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688比较岩藻糖基化CD20抗体（96% 岩藻糖基化，CHO/DG441H5）与无岩藻糖基化CD20抗体。Davies,J.等, Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294报告了，对于CD20抗体，升高的ADCC 与升高的对FcγRIII的结合相关联。
通过减少岩藻糖量来增强单克隆抗体的细胞介导的效应器功能的方法 记载于例如WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739、Niwa,R.等,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa, T.等,J.Biol.Chem.278(2003)3466–3473；WO 03/055993或US2005/0249722。 CD20和抗CD20抗体
CD20分子（又称作人B淋巴细胞限制性分化抗原或Bp35）是一种位于前 B和成熟B淋巴细胞上的具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine, M.A.等,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287;及Einfeld,D.A.等,EMBO J.7 (1988)711-717;Tedder,T.F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212; Stamenkovic,I.等,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980;Tedder，T.F.等,J. Immunol.142(1989)2560-2568)。CD20在来自外周血或淋巴样器官的大于 90%的B细胞表面上有找到，并且在早期前B细胞发育期间表达，而且保持到 浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞及恶性B细胞两者上。特别地，CD20 在大于90%的B细胞非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson,K.C. 等,Blood 63(1984)1424-1433))，但是在造血干细胞、原B细胞、正常的浆细 胞、或其它正常的组织上没有找到(Tedder，T.F.等,J,Immunol.135(1985) 973-979)。
CD20蛋白的85个氨基酸的羧基端区位于胞质内。此区的长度与其它B细 胞特异性表面结构诸如IgM、IgD、和IgG重链或组织相容性抗原类I1a或β链 （其分别具有3、3、28、15、和16个氨基酸的相对较短的胞质内区）的长度 形成对比(Komaromy,M.等NAR 11(1983)6775-6785)。在最后61个羧基端氨 基酸中，21个是酸性残基，而仅2个是碱性，指示此区具有强的净负电荷。 GenBank登录号是NP-690605。认为CD20可能牵涉调节B细胞的活化和分化 过程中的早期步骤(Tedder，T.F.等,Eur.J.Immunol.16(1986)881-887)，并且 可以发挥钙离子通道的功能(Tedder，T.F.等,J.Cell.Biochem.14D(1990) 195)。
存在着在其CD20结合模式和生物学活性上显著差异的两种不同类型的 抗CD20抗体(Cragg,M.S.等,Blood 103(2004)2738-2743；及Cragg,M.S.等, Blood 101(2003)1045-1052)。I型抗体，如例如利妥昔单抗(rituximab)在补体 介导的细胞毒性中是有力的，而II型抗体，如例如托西莫单抗(Tositumomab) (B1)、11B8、AT80或人源化B-Ly1抗体经由不依赖于胱天蛋白酶的凋亡及伴 随的磷脂酰丝氨酸暴露而有效启动靶细胞死亡。
表1中汇总了I型和II型抗CD20抗体共享的共同特征。
表1：I型和II型抗CD20抗体的特性
mTOR和mTOR抑制剂
mTOR是雷帕霉素(rapamycin)的哺乳动物靶物(mTOR)，又称为雷帕霉素 的机械论靶物或FK506结合蛋白12-雷帕霉素关联蛋白1(FRAP1)，其是一种 在人中由FRAP1基因编码的蛋白质(Brown,E.J.等,Nature 369(1994)756-758; Moore,P.A.等,Genomics 33(1996)331-332)。mTOR是一种调节细胞生长、细 胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白质合成、和转录的丝氨酸/苏氨酸蛋白质 激酶。(Hay,N.等,Genes Dev.18(2004)1926–1945;Beevers,C.S.等,Int.J. Cancer 119(2006)757–764)。
mTOR整合来自上游途径的输入，包括胰岛素、生长因子（诸如IGF-1 和IGF-2）、和丝裂原。mTOR还感测细胞营养物和能量水平及氧化还原状态。 mTOR途径在人疾病，尤其是某些癌症中失调。雷帕霉素是一种可以通过与 其胞内受体FKBP12联合来抑制mTOR的细菌产物。FKBP12-雷帕霉素复合物 直接结合mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)域。
mTOR是两种分子复合物的催化亚基。mTOR复合物1(mTORC1)由 mTOR、mTOR的调节关联蛋白(Raptor)、哺乳动物LST8/G-蛋白β-亚基样蛋 白(mLST8/GβL)和最近鉴定的配偶体PRAS40和DEPTOR构成。此复合物的特 征在于通过发挥营养物/能量/氧化还原传感器功能并控制蛋白质合成实现的 mTOR的典型特征。此复合物的活性受胰岛素、生长因子、血清、磷脂酸、 氨基酸（特别是亮氨酸）、和氧化应激刺激。
mTORC1受到低营养物水平、生长因子剥夺、还原应激、咖啡因、雷帕 霉素、法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylic acid,FTS)和姜黄素抑制。两种 表征最好的mTORC1靶物是p70-S6激酶1(S6K1)和4E-BP1，即真核起始因子 4E(eIF4E)结合蛋白1[3]。
mTORC1在至少两个残基上磷酸化S6K1，其中在苏氨酸残基(T389)上发 生最至关重要的修饰。此事件刺激随后PDK1对S6K1的磷酸化。活性S6K1 继而可以经由激活S6核糖体蛋白（即一种核糖体组分）和翻译机器的其它组 分来刺激蛋白质合成的启动。S6K1还可以通过在两个位点处磷酸化mTOR的 负调节域而与mTORC1一起参与正反馈环；这些位点处的磷酸化表现为刺激 mTOR活性。
已经显示了mTORC1以分层方式磷酸化4E-BP1的至少四个残基。非磷酸 化的4E-BP1紧密结合翻译起始因子eIF4E，阻止其结合5’-加帽的mRNA，并 且将它们募集至核糖体起始复合物。在被mTORC1磷酸化后，4E-BP1释放 eIF4E，容许其实施其功能。mTORC1的活性表现为经由mTOR和Raptor间的 动态相互作用（其由GβL介导）调节。Raptor和mTOR共享接近mTOR的激酶 域的强N端相互作用和较弱的C端相互作用。在感测到刺激信号时，诸如高 营养物/能量水平，mTOR-Raptor C端相互作用被削弱，而且有可能完全丧失， 容许开启mTOR激酶活性。在撤回刺激信号时，诸如低营养物水平， mTOR-Raptor C端相互作用得到加强，基本上关掉mTOR的激酶功能。
mTOR复合物2(mTORC2)由mTOR、mTOR的雷帕霉素不敏感性伴侣 (Rictor)、GβL、和哺乳动物应激激活的蛋白质激酶相互作用蛋白1(mSIN1) 构成。已经显示了mTORC2经由其对F-肌动蛋白应力纤维、桩蛋白、RhoA、 Rac1、Cdc42和蛋白质激酶Cα(PKC α)的刺激来发挥细胞骨架的重要调节物的 功能。mTORC2也表现为拥有先前令人困惑的称为“PDK2”的蛋白质的活 性。mTORC2在丝氨酸残基S473处磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶 Akt/PKB。丝氨酸的磷酸化刺激PDK1对苏氨酸T308残基处的Akt磷酸化，并 且导致完全的Akt激活；姜黄素通过阻止丝氨酸的磷酸化来抑制这两者。
mTORC2表现为受到胰岛素、生长因子、血清、和营养物水平调节。最 初，mTORC2鉴定为雷帕霉素不敏感性实体，因为对雷帕霉素的短期暴露不 影响mTORC2活性或Akt磷酸化。然而，随后的研究已经显示了至少在一些 细胞系中，对雷帕霉素的长期暴露虽然不影响先前存在的mTORC2，但是可 以结合游离的mTOR分子，如此抑制新的mTORC2的形成。
假设一些饮食方案，如热量限制和甲硫氨酸限制通过降低mTor活性而引 起寿命延长。
mTOR抑制剂
已经鉴定出mTOR的许多抑制剂，并且几种处于用于治疗癌症的临床试 验中（例如RAD001（又称为依维莫司(Everolimus)；Novartis）；CCI-779（又 称为坦西莫司(Temsirolimus)；Wyeth）；AP23573(Ariad Pharmaceuticals)；和 KU-0059475(Kudus Pharmaceuticals)；Mita,M.M.等,Cancer Biology& Therapy 2,增刊1(2003)S169-S177)。此类mTOR抑制剂与其它抗癌剂的组合 的潜在有效性也已经得到提示，并且正在临床试验中进行测试(Adjei,A.A. 和Hidalgo,M.,J.Clin.Oncol.23(2005)5386-5403)。此类组合包括mTOR抑制 剂与蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂的组合(Sawyers,C.L.,Cancer Cell 4(2003) 343-348;Gemmill,R.M.等,Br.J.Cancer 92(2005)2266-2277;Goudar，R.K.等, Mol.Cancer Therapeutics 4(2005)101-112;国际专利公开文本WO 2004/004644;Birle,D.C.等,94th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research,Washington,D.C.,第44卷,第二版,Proc.Am.Assoc. Cancer Res.(2003年7月)第932页,#R4692)。
发明概述
本发明包括具有60%或更少的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用 于制造与mTOR抑制剂联合治疗癌症的药物的用途。
本发明的一方面是一种治疗患有癌症的患者的方法，其通过对需要此类 治疗的患者施用与mTOR抑制剂组合的具有60%或更少的岩藻糖量的无岩藻 糖基化抗CD20抗体。
本发明的另一方面是与mTOR抑制剂组合治疗癌症的具有60%或更少的 岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体。
优选地，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%和60%之间。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体，而所述癌 症是表达CD20的癌症，优选地，B细胞非何杰金（Hodgkin）氏淋巴瘤(NHL)。
优选地，mTOR抑制剂是雷帕霉素（rapamycin）或雷帕霉素类似物或衍 生物。优选地，mTOR抑制剂是坦西莫司（Temsirolimus）或依维莫司 （Everolimus）。
本发明的一个实施方案是一种用于治疗癌症的组合物，其包含具有60% 或更小的岩藻糖量的抗CD20无岩藻糖基化抗体和mTOR抑制剂。
令人惊讶地，我们现在已经发现了mTOR抑制剂与无岩藻糖基化抗CD20 抗体的组合在治疗癌症中显示协同（例如大于叠加）的抗增殖效果。
我们现在已经发现了无岩藻糖基化抗CD20抗体的组合显示协同（例如 甚至大于叠加）的抗增殖效果。
附图简述
图1无岩藻糖基化II型抗CD20抗体(GA101=B-HH6-B-KV1GE)与 mTOR抑制剂（坦西莫司）的联合治疗与相应的单一疗法相比的体 内抗肿瘤活性。
发明详述
本发明包括具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的岩藻糖量 的无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地IgG1或IgG3同种型的，更优选地IgG1 同种型的）用于制造与mTOR抑制剂联合治疗癌症的药物的用途。
优选地，mTOR抑制剂是雷帕霉素、或雷帕霉素类似物或衍生物。优选 地，mTOR抑制剂是坦西莫司或依维莫司。
优选地，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%至60%。
术语“抗体”涵盖各种抗体形式，包括但不限于完整的抗体、人抗体、 人源化抗体和遗传工程抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体或重组抗体及此类抗 体的片段，只要依照本发明的特征性特性得到保留。如本文中所使用的，术 语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的 制备物。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生 的可变和恒定区的展现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单 克隆抗体是由杂交瘤生成的，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的自具有包 含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小 鼠获得的B细胞。
术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自一种来源 或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分 的单克隆抗体。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。此类鼠 /人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋 白恒定区的DNA区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发明所涵盖的“嵌 合抗体”的其它形式是那些其中类别或亚类已经自初始抗体的类别或亚类修 饰或改变的。此类“嵌合”抗体又称为“类别转换抗体”。用于生成嵌合抗 体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见例如 Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238 和US 5,204,244。
术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过 修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白的 CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中 以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.等,Nature 332(1988)323-327; 及Neuberger,M.S.等,Nature 314(1985)268-270。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白 序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A. 和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。基于此类技 术，可以生成针对极其多种靶物的人抗体。人抗体的例子记载于例如 Kellermann,S.A.等,Curr.Opin.Biotechnol.13(2002)593-597。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、 表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者 自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或 抗体而言转基因的动物（例如小鼠）分离的抗体。此类重组人抗体具有重排 形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人 抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸 序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体 内的人抗体种系全集内的序列。
如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指用纯化的野生型 抗原在体外测定法中，优选地在等离振子共振测定法(BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中抗体对肿瘤抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka （来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数）、kD（解离常数）、和KD(kD/ka) 限定。结合或特异性结合意指10-8mol/l或更小，优选地10-9M至10-13mol/l的结 合亲和力(KD)。如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体以10-8mol/l或更小， 优选地10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)特异性结合肿瘤抗原。
如本文中所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。 核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。
“恒定域”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是牵涉效应器功能（ADCC、 补体结合、和CDC）。
如本文中所使用的，“可变区”（轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)）意 为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链对之每种。人轻链和重链可变域具有 相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”（或互补决定区，CDR） 连接的其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采用b-片层构象，而CDR 可以形成连接b-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结 构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。
术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负 责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨 基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那 些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大 的区。CDR和FR区依照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
依照本发明的mTOR抑制剂可以是目前本领域中已知的或者会在未来鉴 定的任何mTOR抑制剂，并且包括在对患者施用后导致对患者中的mTOR的 抑制的任何化学实体。mTOR抑制剂可以通过任何生物化学机制来抑制 mTOR，包括在ATP结合位点处的竞争、在mTOR激酶的催化位点处的其它地 方的竞争、非竞争性抑制、不可逆抑制（例如，共价蛋白质修饰）、或以导 致抑制mTOR激酶活性的方式调控其它蛋白质亚基或结合蛋白与mTOR激酶 的相互作用（例如，调控mTOR与FKBP12、GβL(mLST8)、RAPTOR (mKOG1)、或RICTOR(mAVO3)的相互作用）。mTOR抑制剂的具体例子包括： 雷帕霉素；其它雷帕霉素大环内酯类、或雷帕霉素类似物、衍生物或前药； 依维莫司(Everolimus)（又称为RAD001、依维莫司/RAD001是一种披露于美 国专利No.5,665,772的烷基化雷帕霉素(40-O-(2羟乙基)-雷帕霉素)； Novartis）；坦西莫司（又称为CCI-779，坦西莫司/CCI-779是一种披露于美国 专利No.5,362,718的雷帕霉素酯（与3-羟基-2-羟甲基-2-甲基丙酸的42-酯）； Wyeth）；AP23573或AP23841(Ariad Pharmaceuticals)；ABT-578(40-表-(四唑 基)-雷帕霉素；Abbott Laboratories)；KU-0059475(Kudus Pharmaceuticals)； 和TAFA-93（一种雷帕霉素前药；Isotechnika）。本领域中已知的雷帕霉素类 似物和衍生物的例子包括那些记载于下列美国专利的化合物：No.6,329,386； 6,200,985；6,117,863；6,015,815；6,015,809；6,004,973；5,985,890；5,955,457； 5,922,730；5,912,253；5,780,462；5,665,772；5,637,590；5,567,709；5,563,145； 5,559,122；5,559,120；5,559,119；5,559,112；5,550,133；5,541,192；5,541,191； 5,532,355；5,530,121；5,530,007；5,525,610；5,521,194；5,519,031；5,516,780； 5,508,399；5,508,290；5,508,286；5,508,285；5,504,291；5,504,204；5,491,231； 5,489,680；5,489,595；5,488,054；5,486,524；5,486,523；5,486,522；5,484,791； 5,484,790；5,480,989；5,480,988；5,463,048；5,446,048；5,434,260；5,411,967； 5,391,730；5,389,639；5,385,910；5,385,909；5,385,908；5,378,836；5,378,696； 5,373,014；5,362,718；5,358,944；5,346,893；5,344,833；5,302,584；5,262,424； 5,262,423；5,260,300；5,260,299；5,233,036；5,221,740；5,221,670；5,202,332； 5,194,447；5,177,203；5,169,851；5,164,399；5,162,333；5,151,413；5,138,051； 5,130,307；5,120,842；5,120,727；5,120,726；5,120,725；5,118,678；5,118,677； 5,100,883；5,023,264；5,023,263；和5,023,262；通过提及而将它们都收入本 文。雷帕霉素衍生物也披露于例如WO 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、或WO 99/15530，通过提及而将其收入本文。此类类似物和衍生 物包括32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32-脱氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧 -32(S或R)-二氢-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氢-40-O-(2-羟乙基)- 雷帕霉素、40-0-(2-羟乙基)-雷帕霉素、32-脱氧雷帕霉素和16-戊-2-炔基氧 -32(S)-二氢-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物还可以包括所谓的雷帕类似物 (rapalogs)，例如，如披露于WO 98/02441和WO 01/14387的（例如，AP23573、 AP23464、AP23675或AP23841）。雷帕霉素衍生物的其它例子是那些以名称 比欧莫司(biolimus)-7或比欧莫司-9(BIOLIMUS A9TM)(Biosensors International,Singapore)披露的。任何上述雷帕霉素类似物或衍生物可以通过 如上述参考文献中描述的规程容易地制备。可用于本文中所描述的发明的 mTOR抑制剂的其它例子包括那些在美国专利申请流水号11/599,663中披露 并要求保护的。
优选地，mTOR抑制剂是雷帕霉素或雷帕霉素类似物或衍生物，更优选 地，雷帕霉素类似物或衍生物。优选的雷帕霉素类似物或衍生物是例如坦西 莫司或依维莫司。
术语“无岩藻糖基化抗体”指在Fc区中在Asn297处具有改变的糖基化样 式，具有降低的岩藻糖残基水平的IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型 的）抗体。在Asn297处发生人IgG1或IgG3的糖基化，作为以多至两个Gal残 基为末端的核心岩藻糖化双触角复合寡糖糖基化。根据末端Gal残基的量， 这些结构称为G0、G1（α1,6或α1,3）或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcess Int. 1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如由Routier,F.H., Glycoconjugate J.14(1997)201-207描述。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组 表达的抗体在Asn297处通常以至少85%的量进行岩藻糖基化。
如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体意指其中的岩藻糖量占Asn297 处的寡糖（糖）总量的60%或更少（这意味着在Fc区中Asn297处的寡糖的至 少40%或更多是无岩藻糖基化的）的IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种 型的）抗体。在一个实施方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的40% 至60%。在另一个实施方案中，岩藻糖量是50%或更小，并且在又一个实施 方案中，岩藻糖量占Fc区中Asn297处的寡糖的30%或更小。依照本发明，“岩 藻糖的量”意指通过MALDI-TOF质谱术测量的，并以平均值计算的，相对 于附着于Asn297的所有寡糖（糖）（例如复合的、杂合的和高甘露糖结构） 的总和，Asn297处寡糖（糖）链内所述寡糖（岩藻糖）的量（测定岩藻糖量 的详细规程记载于例如WO 2008/077546）。此外，优选地，Fc区的寡糖是两 分的。可以在工程化改造成表达至少一种下述核酸的糖修饰的宿主细胞中表 达依照本发明的无岩藻糖基化抗体，所述核酸编码具有GnTIII活性的多肽， 其量足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖。在一个实施方案中，具有GnTIII活 性的多肽是融合多肽。或者，可以依照US 6,946,292降低或消除宿主细胞的 α1,6-岩藻糖基转移酶活性以生成糖修饰的宿主细胞。可以例如通过发酵条件 （例如发酵时间）或者通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗体来预 先确定抗体岩藻糖基化的量。此类无岩藻糖基化抗体及相应的糖工程方法记 载于WO 2005/044859,WO 2004/065540,WO 2007/031875,Umana,P.等, Nature Biotechnol.17(1999)176-180,WO 99/154342,WO 2005/018572,WO 2006/116260,WO 2006/114700,WO 2005/011735,WO 2005/027966,WO 97/028267,US2006/0134709,US2005/0054048,US2005/0152894,WO 2003/035835,WO 2000/061739。这些糖工程抗体具有升高的ADCC。依照本 发明产生无岩藻糖基化抗体的其它糖工程方法记载于例如Niwa,R.等,J. Immunol.Methods 306(2005)151-160;Shinkawa,T.等,J.Biol.Chem.278 (2003)3466-3473;WO 03/055993或US2005/0249722。
如此，本发明的一方面是IgG1或IgG3同种型的（优选地IgG1同种型的）， 特异性结合肿瘤抗原的，具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的60%或更少的 岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造与mTOR抑制剂联合治疗癌 症的药物的用途。优选地，岩藻糖量占Asn297处的寡糖（糖）总量的40%至 60%。
CD20（又称为B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、 Bp35、BM5、和LF5；序列以SwissProt数据库条目P11836为特征）是一种位 于前B和成熟B淋巴细胞上的具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine, M.A.等,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287;Tedder,T.F.等,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212;Stamenkovic,I.等,J.Exp.Med.167(1988) 1975-1980;Einfeld,D.A.等,EMBO J.7(1988)711-717;Tedder，T.F.等,J. Immunol.142(1989)2560-2568)。相应的人基因是跨膜4-域，A亚家族，成员 1，又称为MS4A1。此基因编码跨膜4A基因家族的成员。此初生蛋白质家族 的成员以共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界为特征，并且在造 血细胞和非淋巴样组织中展现出独特的表达样式。此基因编码B淋巴细胞表 面分子，其在B细胞发育及分化成浆细胞中发挥作用。在一簇家族成员中， 此家族成员定位于11q12。此基因的可变剪接产生编码同一蛋白质的两种转 录物变体。
术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，而且包括由细胞 天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同 等型和物种同系物。本发明的抗体对CD20抗原的结合通过灭活CD20而介导 对表达CD20的细胞（例如，肿瘤细胞）的杀伤。对表达CD20的细胞的杀死 杀伤可以通过下列一项或多项机制而发生：细胞死亡/凋亡诱导、ADCC和 CDC。
如本领域中认可的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细 胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5、和LF5。
依照本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原的抗体。根 据针对CD20抗原的抗CD20抗体的结合特性和生物学活性，两种类型的抗 CD20抗体（I型和II型抗CD20抗体）可以依照Cragg,M.S.等,Blood 103(2004) 2738-2743;及Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052区别，参见表2。
表2：I型和II型抗CD20抗体的特性
II型抗CD20抗体的例子包括例如人源化B-Ly1抗体IgG1（一种嵌合的人 源化IgG1抗体，如披露于WO 2005/044859中的）、11B8IgG1（如披露于WO 2004/035607中的）、和AT80IgG1。通常，IgG1同种型的II型抗CD20抗体显 示特征性的CDC特征。与IgG1同种型的I型抗体相比，II型抗CD20抗体具有 降低的CDC（若为IgG1同种型的话）。
I型抗CD20抗体的例子包括例如利妥昔单抗、HI47IgG3（ECACC，杂 交瘤）、2C6IgG1（如披露于WO 2005/103081中的）、2F2IgG1（如披露于 WO 2004/035607和WO 2005/103081的）和2H7IgG1（如披露于WO 2004/056312中的）。
优选地，依照本发明的无岩藻糖基化抗CD20抗体是II型抗CD20抗体， 更优选地，无岩藻糖基化的人源化B-Ly1抗体。
依照本发明的无岩藻糖基化抗CD20抗体具有升高的抗体依赖性细胞的 细胞毒性(ADCC)。
“具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的无岩藻糖基化抗 CD20抗体”意指具有如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测 定的升高的ADCC的无岩藻糖基化抗CD20抗体，如该术语在本文中所定义 的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达被抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞 (PBMC)作为效应细胞；
3)依照下列方案来实施测定法：
i)使用标准的密度离心规程来分离PBMC，并将其以5x 106个细胞/ml在 RPMI细胞培养基中悬浮；
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90%的存活力 的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里51Cr 标记，用细胞培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培 养基中重悬浮；
iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔；
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将50微 升所得的抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测 试覆盖上述整个浓度范围的多种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，平板中含有经标记的靶细胞的3个另外的孔 接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2%(VN)水 溶液，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vi)对于自发释放(SR)对照，平板中含有经标记的靶细胞的3个另外的孔 接受50微升RPMI细胞培养基，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4°C温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液（上述第i点）添加至每孔以产生效应:靶细胞 比率25:1，并将平板在培养箱中在5%CO2气氛下于37°C放置4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放 射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100对每个抗体浓度计算比裂解(specific lysis)的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化（参见上述第ix点） 的平均放射性，MR是对MR对照（参见上述第v点）量化（参见上 述第ix点）的平均放射性，而SR是对SR对照（参见上述第vi点）量 化（参见上述第ix点）的平均放射性；
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最 大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解 的最大百分比的一半所需要的抗体浓度降低。ADCC的升高相对于用上 述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、 配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改 造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
可以通过所述抗体的糖工程来获得所述“升高的ADCC”，其意味着通过 工程化改造其寡糖组分来增强单克隆抗体的所述天然的、细胞介导的效应器 功能，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US 6,602,684的。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指在存在补体的情况中依照本发明 的抗体对人肿瘤靶细胞的溶解。优选地，通过在存在补体的情况中用依照本 发明的抗CD20抗体处理表达CD20的细胞的制备物来测量CDC。若抗体在浓 度100nM时在4小时后诱导20%或更多的肿瘤细胞溶解（细胞死亡），则发现 CDC。优选地，用经51Cr或Eu标记的肿瘤细胞及释放的51Cr或Eu测量来实施 测定法。对照包括将肿瘤靶细胞与补体但不与抗体一起温育。
“利妥昔单抗”抗体（参照抗体；I型抗CD20抗体的例子）是一种针对 人CD20抗原的含有遗传工程嵌合人γ1鼠恒定域的单克隆抗体。利妥昔单抗 不是无岩藻糖基化的，具有占Asn297处的寡糖（糖）总量的约85%或更多的 岩藻糖量。此嵌合抗体含有人γ1恒定域，并且在1998年4月17日公告的归于 IDEC Pharmaceuticals Corporation的US 5,736,137（Andersen等）中以名称 “C2B8”鉴定。利妥昔单抗批准用于治疗复发性或顽固性低级或滤泡性、 CD20阳性、B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者。体外作用机制研究已经显示了利 妥昔单抗展现出人补体依赖性细胞毒性(CDC)(Reff，M.E.等,Blood 83(1994) 435-445)。另外，它在测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定法中展 现出显著的活性。利妥昔单抗不是无岩藻糖基化的。
术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO 2005/044859和WO 2007/031875中所 披露的人源化B-Ly1抗体，其通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化及接着的人 源化自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1（鼠重链可变区(VH)：SEQ ID NO:1；鼠 轻链可变区(VL)：SEQ ID NO:2，参见Poppema,S.和Visser,L.,Biotest Bulletin 3(1987)131-139）获得（参见WO 2005/044859和WO2007/031875）。这些“人 源化B-Ly1抗体”详细披露于WO 2005/044859和WO 2007/031875中。
优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有选自下组的重链可变区(VH)：SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:20（WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH2至 B-HH9和B-HL8至B-HL17）。特别优选的是Seq.ID No.3、4、7、9、11、13 和15（WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH2、B-HH3、B-HH6、B-HH8、 B-HL8、B-HL11和B-HL13）。优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有轻链可变区 (VL)SEQ ID NO:20（WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-KV1）。优选 地，“人源化B-Ly1抗体”具有重链可变区(VH)SEQ ID NO:7（WO 2005/044859 和WO 2007/031875的B-HH6）和轻链可变区(VL)SEQ ID NO:20（WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-KV1）。此外，优选地，人源化B-Ly1抗 体是IgG1抗体。依照本发明，依照记载于WO 2005/044859、WO 2004/065540、 WO 2007/031875、Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及WO 99/154342中的规程在Fc区中糖工程化改造(GE)此类无岩藻糖基化的人源化 B-Ly1抗体。无岩藻糖基化的糖工程化人源化B-Ly1(B-HH6-B-KV1GE)在本 发明的一个实施方案中是优选的。此类糖工程人源化B-Ly1抗体在Fc区中具 有改变的糖基化样式，优选地具有降低的岩藻糖残基水平。优选地，岩藻糖 量占Asn297处的寡糖总量的60%或更少（在一个实施方案中，岩藻糖的量是 40%至60%，在另一个实施方案中，岩藻糖的量是50%或更少，且在又一个 实施方案中，岩藻糖的量是30%或更少）。此外，优选地，Fc区的寡糖是两 分的。这些糖工程化人源化B-Ly1抗体具有升高的ADCC。
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳 定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定(specific) 生物学活性。此类特性可能不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡 糖的特定结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些 寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用而介导糖蛋白自血流 的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并触发不想要的免疫反应 (Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。
由于哺乳动物细胞以对于人应用最相容的形式糖基化蛋白质的性能，它 是用于生成治疗性糖蛋白的优选的宿主(Cumming,D.A.等,Glycobiology 1 (1991)115-30;Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。细菌糖基 化蛋白质非常罕见，并且与其它类型的常见宿主，诸如酵母、丝状真菌、昆 虫和植物细胞一样，其产生与自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和 （在一些特定的情况中）降低的生物学活性有关的糖基化样式。在哺乳动物 细胞中，在过去二十年期间最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在给予合适 的糖基化样式外，这些细胞容许遗传稳定的、高生产性克隆细胞系的一致生 成。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度，并容 许开发安全且可再现的生物工艺。其它通常使用的动物细胞包括幼仓鼠肾 (BHK)细胞、NSO和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。新近，还已经测试了自转基因动 物的生成(Jenkins,N.等,Nature Biotechnol.14(1996)975-981)。
所有抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物结构，其中每 种同种型拥有独特的一批N连接的碳水化合物结构，其可变地影响蛋白质装 配、分泌或功能性活性(Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15(1997) 26-32)。根据加工程度，附着的N连接的碳水化合物结构变化得相当大，并 且可以包括高甘露糖的、多分支的及双触角的复合寡糖(Wright,A.和Morrison, S.L.,Trends Biotech.15(1997)26-32)。通常，存在着特定糖基化位点处附着 的核心寡糖结构的异质加工，使得甚至单克隆抗体以多种糖形存在。同样地， 已经显示了细胞系间存在抗体糖基化的主要差异，而且甚至对不同培养条件 下培养的给定细胞系看到次要差异(Lifely，M.R.等,Glycobiology 5(1995) 813-822。
一种在维持简单的生成过程并潜在地避免显著的、不想要的副作用的情 况中获得效力大幅升高的方式是通过工程化改造单克隆抗体的寡糖组分来 增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及US 6,602,684的。IgG1型抗体（即在癌症免疫 疗法中最常使用的抗体）是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的 糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域 间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如 抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely,M.R.等, Glycobiology 5(1995)813-822;Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163(1998)59-76; Wright,A和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15(1997)26-32)。
先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶I11(“GnTII17y”)（一种催化两分 型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高 由工程化改造的CHO细胞生成的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的 体外ADCC活性（参见Umana,P.等,Nature Biotechnol.17(1999)176-180；及 WO 99/154342，在此通过提及而收录其全部内容）。抗体chCE7属于具有高 肿瘤亲和力和特异性，但是在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中生产时具有 太少的效力以致在临床上无用的一大类未缀合的单克隆抗体(Umana,P.等, Nature Biotechnol.17(1999)176-180)。所述研究第一次显示了可以通过工程 化改造抗体生成细胞以表达GnTIII来获得ADCC活性的大幅升高，其还导致 恒定区(Fc)结合的两分型寡糖（包括两分型非岩藻糖基化寡糖）比例的增加， 高于天然存在的抗体中找到的水平。
如本文中所使用的，术语“癌症”包括淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺 癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、 头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内 膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、 内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、 阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、 肝细胞癌、胆癌(biliary cancer)、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱轴肿瘤、 脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形细胞瘤、 神经鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞 状细胞癌、垂体腺瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式、或一种或多种上述 癌症的组合。优选地，术语癌症指表达CD20的癌症。
术语“表达CD20”抗原意图指示细胞中，的CD20抗原的显著水平的表 达，优选地在T或B细胞的细胞表面上，更优选地分别来自肿瘤或癌症的B细 胞，优选地非实体瘤。可以通过本领域已知的标准测定法来确定具有“表达 CD20的癌症”的患者。例如，使用免疫组织化学(IHC)检测、FACS或者经由 相应mRNA的基于PCR的检测来测量CD20抗原表达。
如本文中所使用的，术语“表达CD20的癌症”指癌细胞显示CD20抗原 表达的所有癌症。优选地，如本文中所使用的，表达CD20的癌症指淋巴瘤 （优选地B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)）和淋巴细胞性白血病。此类淋巴 瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤、b)小无核裂细胞淋巴瘤 (Small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤（包括地方性伯 基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤）、c)边缘区淋巴 瘤（包括结外边缘区B细胞淋巴瘤（粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT）、结 边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤）、d)套细胞淋巴瘤(MCL)、e)大细胞 淋巴瘤（包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、 免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细 胞淋巴瘤）、f)毛细胞白血病、g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦 (waldenstrom)氏巨球蛋白血症、h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细 胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、i) 浆细胞新生物、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、j)何杰金氏病。
更优选地，表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。特别地， 表达CD20的癌症是套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢 性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏 淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、移 植后淋巴增殖性病症(PTLD)、HIV有关的淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白 血症、或原发性CNS淋巴瘤。
术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指设计为降低或消 除患者中的癌细胞数目，或者减轻癌症症状的规程或作用过程。癌症或另一 种增殖性病症的“治疗方法”不必意味着实际上会消除癌细胞或其它病症， 实际上会降低细胞数目或病症，或实际上会减轻癌症或其它病症的症状。经 常，甚至会实施具有较低的成功概率，但是然而鉴于医学史和估计的患者存 活预期认为诱导总体有益的作用过程的治疗癌症的方法。
术语“共施用”指施用所述无岩藻糖基化抗CD20和所述mTOR抑制剂作 为一种单一配制剂或者作为两种分开的配制剂。共施用可以是同时的或者以 任意次序序贯的，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的 时段。同时或序贯（例如经由静脉内(i.v.)经由连续输注（对于抗CD20抗体一 次，及最终对于所述mTOR抑制剂一次））共施用所述无岩藻糖基化抗CD20 抗体和所述mTOR抑制剂。在序贯共施用这两种治疗剂时，在同一天在两次 分开的施用中施用剂量，或者在第1天施用药剂之一，而在第2天至第7天， 优选地在第2天至第4天共施用第二种。如此，术语“序贯地”意指在第一组 分（抗CD20抗体或mTOR抑制剂）的剂量后7天内，优选地在第一组分的剂 量后4天内；而术语“同时地”意指同时。术语“共施用”就所述无岩藻糖 基化抗CD20抗体和所述mTOR抑制剂的维持剂量而言意指若治疗周期对于 这两种药物都是合适的，例如每周，则可以或是同时共施用维持剂量。或者， 例如，例如每第一至第三天施用所述mTOR抑制剂，而每周施用所述无岩藻 糖基化抗体。或者，在一天内或在几天内序贯共施用维持剂量。
不证自明的是，以“治疗有效量”（或仅为“有效量”）对患者施用抗体， 所述治疗有效量是各种化合物或组合会引发研究人员、兽医、医学医生或其 它临床医生寻找的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量。
所述抗CD20无岩藻糖基化抗体和所述mTOR抑制剂的共施用量和共施 用时机会取决于所治疗患者的类型（物种、性别、年龄、重量、等）和状况 和所治疗疾病或状况的严重性。可以一次或在一系列治疗里对患者适当地共 施用所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述mTOR抑制剂。
若施用是静脉内的，则所述无岩藻糖基化抗CD20抗体或所述mTOR抑制 剂的初始输注时间可以比随后的输注时间长，例如初始输注为约90分钟，而 随后的输注为约30分钟（若初始输注耐受良好的话）。
根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg（例如0.1-20mg/kg）所 述无岩藻糖基化抗CD20抗体和1μg/kg至50mg/kg（例如0.1-20mg/kg）所述 mTOR抑制剂是对患者共施用这两种药物的初始候选剂量。在一个实施方案 中，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地无岩藻糖基化的人源化B-Ly1抗 体）的优选剂量会在约0.05mg/kg至约30mg/kg的范围中。如此，可以对患者 共施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/kg（或其任何组 合）的一剂或多剂。所述mTOR抑制剂的优选剂量会在0.01mg/kg至约 30mg/kg，例如0.1mg/kg至10.0mg/kg的范围中。根据患者的类型（物种、性 别、年龄、重量、等）和状况及无岩藻糖基化抗CD20抗体的类型，所述无 岩藻糖基化抗体的剂量和施用日程表可以随所述mTOR抑制剂而有所不同， 例如，可以例如每1至3周施用所述无岩藻糖基化抗CD20抗体，并且可以每 天或每2至10天施用所述mTOR抑制剂。也可以施用较高的初始加载剂量，接 着是较低的一剂或多剂。
优选地，所述人源化B-Ly1抗体在一个6周剂量周期的第1天、第8天、第 15天以800至1200mg的剂量，然后在多至五个4周剂量周期的第1天以800至 1200mg的剂量施用。或者，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体的优选剂量可以 是在多至八个3周剂量周期的第1天的800至1200mg（优选地1000mg）。
优选地，根据淋巴瘤疾病的类型，所述mTOR抑制剂以25mg/周至175mg/ 周的剂量施用。例如，所述mTOR抑制剂在套细胞淋巴瘤(MCL)中以75mg/ 周的剂量施用。对于复发性或顽固性MCL，进一步的175mg每周一次剂量持 续3周，接着一周一次75mg(175/75)是有可能的。对于滤泡性NHL、DLBCL 和CLL，例如使用25mg/周的剂量。
在一个优选的实施方案中，药物可用于预防或降低患有癌症，优选地表 达CD20的癌症的此类患者中的转移或进一步散布。药物可用于延长此类患 者的存活持续时间，延长此类患者的无进展存活，延长响应的持续时间，导 致经治疗的患者的统计学显著的且临床上有意义的改善，如通过存活的持续 时间、无进展存活、响应率或响应的持续时间所测量的。在一个优选的实施 方案中，药物可用于提高患者组中的响应率。
在本发明的上下文中，可以在无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述mTOR 抑制剂的癌症联合治疗中使用另外的其它细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增 强此类药剂的效果的化合物（例如细胞因子）。合适地，此类分子以对于意 图的目的有效的量组合存在。优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所 述mTOR抑制剂联合治疗在没有所述另外的细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或 增强此类药剂的效果的化合物的情况中使用。
此类药剂包括例如：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，诸如环磷酰胺 (cyclophosphamide)（CTX；例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)（CHL； 例如瘤可宁）、顺铂(cisplatin)（CisP；例如）、白消安 (busulfan)（例如，马利兰）、美法仑(melphalan)、卡莫司汀 (carmustine)(BCNU)、链脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺 (triethylenemelamine)(TEM)、丝裂霉素C(mitomycin C)，等等；抗代谢物， 诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、依托泊苷(etoposide)（VP16；例如凡毕 士）、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine) (6TG)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡 培他滨(capecitabine)（例如，希罗达）、达卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC)，等等；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin) （DXR；例如阿霉素）、柔红霉素(daunorubicin)（道诺霉素 (daunomycin)）、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)，等等；生物 碱，诸如长春花生物碱诸如长春新碱(vincristine)(VCR)、长春碱(vinblastine)， 等等；及其它抗肿瘤剂，诸如帕西他赛(paclitaxel)（例如泰素）和帕 西他赛衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素诸如地塞米松(dexamethasone) （DEX；例如地卡特隆）和皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、 核苷酶抑制剂诸如羟基脲、氨基酸消减酶(amino acid depleting enzyme)诸如 天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物、和相似的多种多 样的抗肿瘤剂。也可以使用下列药剂作为另外的药剂：氨磷汀(arnifostine)（例 如）、更生霉素(dactinomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)（氮 芥）、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、多柔比星脂质体(doxorubicin lipo)（例如，）、吉西他滨 (gemcitabine)（例如健择）、柔红霉素脂质体(daunorubicin lipo)（例 如）、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、多西他赛 (docetaxel)（例如泰索帝）、阿地白介素(aldesleukin)、卡铂 (carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱 (camptothecin)、CPT 11（伊立替康(irinotecan)）、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、 氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比 星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、 托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑 (melphalan)、巯嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶 (pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素 (plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯 (testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。优选地，无岩 藻糖基化抗CD20抗体和所述mTOR抑制剂联合治疗在没有此类另外的药剂 的情况中使用。
上文所描述的细胞毒剂和抗癌剂及抗增殖性靶物特异性抗癌药物，如蛋 白质激酶抑制剂在化学疗法方案中的使用一般在癌症疗法领域中得到充分 表征，并且其在本文中的使用归入关于监测耐受性和效力及关于控制施用路 径和剂量的相同考虑，伴有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以随通 过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞应答而变化。一般地，与在没有 另外的其它药剂的情况中使用的量相比，剂量会是降低的。
有效细胞毒剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围中，并且在通过体外 应答或动物模型中的应答指示的情况中，可以降低多至约一个数量级的浓度 或量。如此，实际剂量会取决于内科医生的判断、患者的状况、和治疗方法 的有效性，其基于原代培养的恶性细胞或组织培养组织样品的体外响应性， 或合适的动物模型中观察到的响应。
在本发明的上下文中，在表达CD20的癌症的无岩藻糖基化抗CD20抗体 和所述mTOR抑制剂联合治疗外，可以实施有效量的电离辐射和/或可以使用 放射性药物。放射源可以是在所治疗的患者外部或内部。在来源在患者外部 时，已知疗法为外部束放射疗法(EBRT)。在放射源在患者内部时，治疗称作 近程疗法(BT)。本发明的上下文中使用的放射性原子可以选自下组，包括但 不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、 碘-131、和碘-111。也有可能用此类放射性同位素标记抗体。优选地，无岩 藻糖基化抗CD20抗体和所述mTOR抑制剂联合治疗在没有此类电离辐射的 情况中使用。
放射疗法是一种用于控制不可切除的或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移 的标准治疗。已经在组合放射疗法与化学疗法时看到改善的结果。放射疗法 基于如下的原则，即对靶区域投递的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织两者 中的繁殖性细胞(reproductive cell)死亡。放射剂量方案一般在放射吸收剂量 (Gy)、时间和分级方面限定，并且必须由肿瘤学家仔细限定。患者接受的放 射量会取决于各种考虑因素，但是两项最重要的是肿瘤相对于身体的其它重 要结构或器官的位置和肿瘤已经扩散的程度。患者经历放射疗法的典型治疗 过程会是在1至6周时段里的治疗日程表，以单一每日分数约1.8至2.0Gy一周5 天对患者施用10-80Gy的总剂量。在本发明的一个优选的实施方案中，在用 本发明的联合治疗和放射治疗人患者中的肿瘤时存在着协同。换言之，在与 放射，任选地有另外的化学治疗剂或抗癌剂组合时，依靠构成本发明的组合 的药剂对肿瘤生长的抑制得到增强。例如，辅助放射疗法的参数包含在 WO99/60023中。
依照已知的方法，通过静脉内施用（以推注或者通过在一段时间里连续 输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内 路径对患者施用无岩藻糖基化抗CD20抗体。抗体的静脉内或皮下施用是优 选的。
依照已知的方法，例如通过静脉内施用（以推注或者通过在一段时间里 连续输注），通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘 内、或经口路径对患者施用mTOR抑制剂。静脉内或腹膜内施用是优选的。
如本文中所使用的，“药学可接受载体”意图包括与药学施用相容的任 何和所有材料，包括溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张 和吸收延迟剂、和与药学施用相容的其它材料和化合物。除非任何常规的介 质或药剂与活性化合物不相容，涵盖其在本发明的组合物中的使用。也可以 将补充的活性化合物掺入组合物中。
药物组合物：
可以通过用药学可接受的无机或有机载体加工依照本发明的抗CD20抗 体和/或mTOR抑制剂来获得药物组合物。可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生 物、滑石、硬脂酸或其盐等，例如诸如片剂、包衣片剂、锭剂和硬明胶胶囊 的载体。适合于软明胶胶囊的载体是例如植物油、蜡、脂肪、半固体和液体 多元醇等。然而，根据活性物质的性质，通常在软明胶胶囊的情况中不需要 载体。适合于生成溶液和糖浆剂的载体是例如水、多元醇、甘油、植物油等。 适合于栓剂的载体是例如天然的或硬化的油、蜡、脂肪、半液体或液体多元 醇等。
此外，药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、 增甜剂、着色剂、香料、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。 它们也可以含有其它治疗上有价值的物质。
本发明的一个实施方案是在治疗癌症，特别是表达CD20的癌症中使用 的组合物，其包含所述具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20 抗体（优选地，所述无岩藻糖基化的人源化B-Ly1抗体）和所述mTOR抑制 剂两者。
所述药物组合物可以进一步包含一种或多种药学可接受载体。
本发明进一步提供了（特别在癌症中使用的）药物组合物，其包含(i)第 一有效量的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体（优选地 无岩藻糖基化的人源化B-Ly1抗体），和(ii)第二有效量的mTOR抑制剂。任选 地，此类组合物包含药学可接受载体和/或赋形剂。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂 (Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干 配制剂或水溶液形式为贮存制备依照本发明使用的仅无岩藻糖基化抗CD20 抗体的药物组合物。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓 度对于接收者无毒，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸； 抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄 基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯 甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇； 3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（小于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血 清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基 酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、 二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂诸如EDTA； 糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子诸如钠；金属复合 物（例如，Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、 PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
mTOR抑制剂的药物组合物可以与上文对无岩藻糖基化抗CD20抗体描 述的药物组合物类似。
在本发明的又一个实施方案中，优选地，依照本发明的药物组合物对于 所述无岩藻糖基化抗CD20抗体和所述mTOR抑制剂是两种分开的配制剂。
活性成分也可以包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶 囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶 囊），在胶状药物投递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米 颗粒和纳米胶囊），或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体 疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。 持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或 聚(乙烯醇)）、聚交酯(US 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、 不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）、及 聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这容易通过过滤流过无菌滤膜 来实现。
本发明进一步提供了一种用于治疗癌症的方法，包括对需要此类治疗的 患者施用(i)第一有效量的具有60%或更小的岩藻糖量的无岩藻糖基化抗 CD20抗体（优选地无岩藻糖基化的人源化B-Ly1抗体），和(ii)第二有效量的 mTOR抑制剂。
优选地，岩藻糖量是40%至60%。
优选地，所述癌症是表达CD20的癌症。
优选地，所述表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是II型抗CD20抗体。
优选地，所述抗体是人源化B-Ly1抗体。
优选地，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素、或雷帕霉素类似物或衍生物。 优选地，所述mTOR抑制剂是坦西莫司或依维莫司。
优选地，在一个6周剂量周期的第1天、第8天、第15天以800至1200mg 的剂量，然后在多至五个4周剂量周期的第1天以800至1200mg的剂量施用所 述人源化B-Ly1抗体。优选地，根据淋巴瘤疾病的类型，所述mTOR抑制剂 以25mg/周至175mg/周的剂量施用。例如，所述mTOR抑制剂在套细胞淋巴 瘤(MCL)中以75mg/周的剂量施用。对于复发性或顽固性MCL，进一步的 175mg每周一次剂量持续3周，接着一周一次75mg(175/75)是有可能的。对于 滤泡性NHL、DLBCL和CLL，例如施用25mg/周的剂量。
如本文中所使用的，术语“患者”优选地指出于任何目的需要用无岩藻 糖基化抗CD20抗体治疗的人（例如，患有表达CD20的癌症的患者），且更优 选地需要此类治疗以治疗癌症、或癌前状况或损伤的人。然而，术语“患者” 也可以指非人动物，优选地哺乳动物诸如犬、猫、马、牛、猪、绵羊和非人 灵长类，等等。
本发明进一步包括与mTOR抑制剂联合治疗癌症的具有60%或更小的岩 藻糖量的无岩藻糖基化抗CD20抗体。
本发明进一步包括在治疗癌症中使用的具有60%或更小的岩藻糖量的 无岩藻糖基化抗CD20抗体和mTOR抑制剂。
优选地，所述无岩藻糖基化抗CD20抗体是人源化B-Ly1抗体。
优选地，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素、或雷帕霉素类似物或衍生物。 优选地，所述mTOR抑制剂是坦西莫司或依维莫司。
优选地，所述癌症是表达CD20的癌症，更优选地B细胞非何杰金氏淋巴 瘤(NHL)。
提供以下实施例和图以帮助理解本发明，其真正的范围在所附权利要求 书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对列出的规程做出 修改。
序列表
SEQ ID NO:1鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1的重链可变区(VH)的氨 基酸序列。
SEQ ID NO:2鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1的轻链可变区(VL)的氨 基酸序列。
SEQ ID NO:3-19人源化B-Ly1抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列 （B-HH2至B-HH9、B-HL8、和B-HL10至B-HL17）。
SEQ ID NO:20人源化B-Ly1抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列 （B-KV1）。
实验规程
II型抗CD20抗体(B-HH6-B-KV1GE)与坦西莫司的联合治疗的抗 肿瘤活性。
测试剂
II型抗CD20抗体B-HH6-B-KV1GE（=人源化B-Ly1，糖工程化 B-HH6-B-KV1=GA101；见WO 2005/044859和WO 2007/031875）自GlycArt, Schlieren,Switzerland提供。抗体缓冲液包含组氨酸、海藻糖和聚山梨酯20。 为了在先注射将抗体溶液自储液在PBS中适当稀释。坦西莫司25mg/ml,Wyeth Pharmaceuticals)由Oncodesign供应，并依照供应商的用法说 明书于+4°C避光贮存。
细胞系和培养条件
将SU-DHL-4人淋巴瘤细胞(DSMZ NO.:ACC 495)以悬浮液于37°C在增 湿的气氛（5%CO2，95%空气）中培养。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(Ref BE12-702F,批次N°8MB0056,Lonza,Verviers,Belgium)且补充有10%胎牛血 清(Ref 3302,批次N°P282005,Lonza)的RPMI 1640。将细胞在血球计数器中 计数，并且通过0.25%锥虫蓝排斥评估其存活力。
动物
雌性CB17SCID米色小鼠（5-6周龄且重量为16-20g）获自Charles River (L’Arbresle,France)。在处理前在我们的无特定病原体(SPF)动物护理装置中 对动物观察7天。
动物护理单元得到法国农业和研究部(French ministries of Agriculture and Research)批准（协议No A21231011）。依照动物实验伦理准则(1)和英国 实验性新生物形成中动物福利准则(English guidelines for welfare of animals in experimental neoplasia)(2)实施动物实验。
SCID米色小鼠中SC SU-DHL-4肿瘤的诱导
将100μl具有基质胶(matrigel)的PBS(50:50,BD Biosciences,France)中的 1000万(107)个SU-DHL-4肿瘤细胞皮下(SC)注射入52只雌性SCID米色小鼠的 右体侧中。
监测
使用Vivo软件(Biosystemes,Dijon,France)管理所有研究数据， 包括动物体重测量、肿瘤体积、临床和死亡率记录、和药物处理管理。
使用异氟烷Forene(Minerve,Bondoufle,France)麻醉动物，之后进行肿瘤 细胞的SC接种、化合物的IV注射和处死。每天记录死亡率、临床体征和行为。 一周两次监测并记录动物体重和肿瘤体积。
动物的处理
在肿瘤达到173±95mm3的均值体积时，将52只携带肿瘤的裸鼠中的40 只在4个10只小鼠的组中分配。如下选择处理日程表：
·来自组1的小鼠接受每周一次媒介物的IV推注，连续4周(Q7Dx4)。
·来自组2的小鼠接受每周一次3mg/kg/inj的抗CD20抗体GA101 (B-HH6-B-KV1GE)的IV推注，连续4周(Q7Dx4)。
·来自组3的小鼠接受每天一次3mg/kg/inj的的IP注射，在每
次剂量给药间间隔3天且总共10次注射(Q3Dx10)。
·来自组4的小鼠接受每周一次3mg/kg/inj的抗CD20抗体GA101 (B-HH6-B-KV1GE)的IV推注，连续4周(Q7Dx4)，组合每天一次 3mg/kg/inj的的IP注射，在每次剂量给药间间隔3天且总共
10次注射(Q3Dx10)。
体内肿瘤生长抑制研究
检查单独的和与组合的抗CD20抗体GA101(B-HH6-B-KV1GE) 的抗肿瘤效力。使用以单一药剂注射的作为参照化合物。与来自经 媒介物处理的动物的肿瘤相比，SU-DHL-4肿瘤生长在仅用3mg/kg抗CD20抗 体GA101(B-HH6-B-KV 1GE)或处理的小鼠中部分延迟。与单独的任 一种药剂相比，抗CD20抗体GA101(B-HH6-B-KV1GE)加上的联合 治疗改善体内抗肿瘤活性。对于组合，肿瘤生长延迟值比相应剂量的单独的 抗CD20抗体GA101(B-HH6-B-KV1GE)或的肿瘤生长延迟值高。一 致地，肿瘤生长在联合治疗组中比在单一药剂组中慢。
在肿瘤细胞注射后第46天，处理组与媒介物组相比的T/C(%)值在抗 CD20抗体GA101(B-HH6-B-KV1GE)、Torisel和两者的组合的情况中分别是 51、60和35。
图1中显示了治疗期间的肿瘤体积形成的结果。