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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410531039.6 (22)申请日 2014.10.09 A61K 31/585(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街 2699 号 申请人 长春百克生物科技股份公司 (72)发明人 苏维恒 姜春来 孔维 陈嘉雯 (74)专利代理机构 北京北翔知识产权代理有限 公司 11285 代理人 张广育 姜建成 (54) 发明名称 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在抑制肠道病毒71 型感染中的新用途 (57) 摘要 本申请涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的新用 途， 。
2、具体地， 涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基用于制 备用于预防和治疗手足口病的药物的用途， 尤其 是用于制备抗肠道病毒 71 型药物的用途。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 CN 105560254 A 2016.05.11 CN 105560254 A 1/1 页 2 1. 华蟾酥毒基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途。 2. 酯蟾毒配基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途。 3.权利要求1或2的用途， 其中所述受试者是人， 优选地， 所述受试者为16岁以下的儿 童， 更优选地， 所述。
3、受试者为 5 岁以下的儿童。 4.权利要求1或2的用途， 其中所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型的 药物， 优选地， 所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。 5. 用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒 71 型引起的细胞病变效应的方法， 所述方法包括使 浓度为 5-3000nM 的华蟾酥毒基与细胞接触， 优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 10-250nM， 更优 选地， 华蟾酥毒基的浓度为 15-70nM。 6. 用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒 71 型引起的空斑形成的方法， 所述方法包括使浓度 为 5-3000nM 的华蟾酥毒基与细胞接触， 优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 10-500nM。
4、， 更优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 15-125nM。 7. 用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒 71 型引起的细胞病变效应的方法， 所述方法包括使 浓度为 50-60000nM 的酯蟾毒配基与细胞接触， 优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 98-12500nM， 更优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 195-3000nM， 最优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 250-1500nM。 8. 用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒 71 型引起的空斑形成的方法， 所述方法包括使浓度 为 50-3000nM 的酯蟾毒配基与细胞接触， 优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 100-1500nM。 9. 权利要求 5-8 任一项的方法， 其中所。
5、述细胞是人细胞。 10. 权利要求 9 的方法， 其中所述细胞是是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤细胞。 权 利 要 求 书 CN 105560254 A 2 1/11 页 3 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在抑制肠道病毒 71 型感染中的 新用途 技术领域 0001 本申请涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的新用途， 具体地， 涉及华蟾酥毒基和酯蟾 毒配基用于制备用于预防和治疗手足口病的药物的用途， 尤其是用于制备抗肠道病毒 71 型药物的用途。 背景技术 0002 手足口病是一种常见的急性病毒性儿童传染病， 主要病原是肠道病毒 71 型 (Enterovir。
6、us 71， 简称为EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16， 简称为CA16)， 其中 EV71 型引发的病症尤为严重。近年来， 手足口病在亚太地区的频繁爆发已经成为了严 重的社会健康问题。据统计， 我国从 2008 年至 2012 年， 超过七百万例的手足口病被报道， 并导致了 2443 例死亡。 0003 目前仍没有上市的疫苗来预防手足口病。在治疗方面， 目前临床上常使用阿昔洛 韦、 更昔洛韦、 利巴韦林等常规抗病毒药物， 并结合板蓝根、 注射用双黄连、 清开灵冲剂等。 虽然以上药物已经用于治疗手足口病， 但是它们都属于广谱的清热解毒药物， 直接作用机 制不明。
7、且针对性不强。仍缺乏专门针对 EV71 的特效治疗药物。 0004 虽然现在已经发现一些天然化合物， 如 ： 猫眼草黄素 (chrysosplenetin) 和垂 叶黄素 (penduletin) 等均表现出抗 EV71 活性， 对于人横纹肌肉瘤细胞， 猫眼草黄素的 IC50( 半数抑制浓度 ) 为 0.20M， 垂叶黄素的 IC50为 0.37M ； 但是两者的细胞毒性均 较大， 对于人横纹肌肉瘤细胞， 猫眼草黄素的 CC50( 细胞存活率为 50时的药物浓度 ) 为 13.9M， 垂叶黄素的CC50为74.18M(Zhu et al.， 2011)。 所以仍然需要开发针对EV71的 低细胞。
8、毒性特效治疗药物。 0005 华蟾酥毒基 (cinobufagin)， 化学式为 C26H34O6， 分子量为 442.54， 其结构式如下 ： 0006 0007 酯蟾毒配基 (resibufogenin)， 化学式为 C24H32O4， 分子量为 384， 其结构式如下 ： 0008 说 明 书 CN 105560254 A 3 2/11 页 4 0009 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基是传统中药蟾酥中的活性成分， 属于蟾蜍二烯羟酸内酯 类化合物。研究表明， 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基具有抗炎、 强心、 镇痛、 抗癌的作用。另外， 华蟾酥毒基还可以抑制细胞内乙肝病毒 (HBV) 的复制。但是尚未报道过。
9、华蟾酥毒基和酯蟾 毒配基对肠道病毒 71 型的抗病毒作用。 发明内容 0010 发明人从天然产物单体库中筛选获得了两个蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物华 蟾酥毒基、 酯蟾毒配基， 并惊讶地发现华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对肠道病毒 71 型造成的细 胞病变效应和空斑效应有抑制作用 , 对 EV71 病毒衣壳蛋白的合成有浓度依赖性地抑制作 用， 而且对细胞的毒性较低， 因此华蟾酥毒基和酯蟾毒配基可以成为抗手足口病病毒 的候 选药物的先导化合物， 可以用于预防或治疗手足口病。 0011 本发明提供了华蟾酥毒基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中 的用途。优选地， 所述受试者是人。更优选地， 所述受试者。
10、为 16 岁以下的儿童。最优选地， 所述受试者为 5 岁以下的儿童。 0012 优选地， 所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒 71 型的药物。 0013 优选地， 所述药物包含活性成分华蟾酥毒基和一种或多种可药用载体。 0014 优选地， 所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。 0015 本发明还提供了一种用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒 71 型引起的细胞病变效应的 方法， 所述方法包括使浓度为 5-3000nM 的华蟾酥毒基与细胞接触。 0016 优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 10-250nM， 更优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 15-70 nM。 0017 优选地， 所述细胞是人。
11、细胞， 更优选地， 所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤细胞。 0018 本发明还提供了一种用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒 71 型引起的空斑形成的方 法， 所述方法包括使浓度为 5-3000nM 的华蟾酥毒基与细胞接触。 0019 优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 10-500nM， 更优选地， 华蟾酥毒基的浓度为 15-125nM。 0020 优选地， 所述细胞是人细胞， 更优选地， 所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤细胞。 0021 本发明提供了酯蟾毒配基在制备用于预防或治疗受试者中。
12、的手足口病的药物中 说 明 书 CN 105560254 A 4 3/11 页 5 的用途。优选地， 所述受试者是人。更优选地， 所述受试者为 16 岁以下的儿童。最优选地， 所述受试者为 5 岁以下的儿童。 0022 优选地， 所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒 71 型的药物。 0023 优选地， 所述药物包含活性成分酯蟾毒配基和一种或多种可药用载体。 0024 优选地， 所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。 0025 本发明还提供了一种用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒 71 型引起的细 胞病变效应 的方法， 所述方法包括使浓度为 50-60000nM 的酯蟾毒配基与细胞接触。。
13、 0026 优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 98-12500nM， 更优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 195-3000nM， 最优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 250-1500nM。 0027 优选地， 所述细胞是人细胞， 更优选地， 所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤细胞。 0028 本发明还提供了一种用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒 71 型引起的空斑形成的方 法， 所述方法包括使浓度为 50-3000nM 的酯蟾毒配基与细胞接触。 0029 优选地， 酯蟾毒配基的浓度为 100-1500nM。 0030 优选地， 所述细胞是人细胞， 更优选地。
14、， 所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染 肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤细胞。 0031 在本发明中由肠道病毒71型引起的细胞病变效应是指由肠道病毒71型病毒在宿 主细胞内大量增殖， 导致细胞病变甚至死亡的效应。 0032 在本发明中由肠道病毒 71 型和 / 或柯萨奇病毒 A16 型引起的空斑形成是指肠道 病毒 71 型感染已形成致密单层状态的细胞群体时， 经过一定培养时间使每个感染细胞周 围的细胞逐渐感染、 死亡、 脱落， 形成肉眼可见的空斑。所述细胞是人细胞， 更优选地， 所述 细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒 71 型受体 hSCARB2 的人横纹肌肉瘤。
15、细胞。 具体实施方式 0033 除非另外说明， 实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品。 0034 实施例 1 ： 构建 RDS 细胞 0035 将合成的两端有 EcoR I&Xba I 酶切位点的 EV71/CA16 受体 hSCARB2 基因片段 (NCBI登录号:NM_005506.3， 由上海捷瑞公司合成)插入慢病毒载体Lenti-X pLVX-Puro载 体(购自Clontech)， 并使用慢病毒载体试剂盒中的转染试剂(购自Clontech)按说明书转 染人横纹肌肉瘤细胞 (RD 细胞， 购自 ATCC， 登录号 #CCL-136)， 获得稳定转染 hSCARB2 的 RD 细胞。
16、， 简称RDS细胞(RDS细胞的具体构建方法参见Li et al.Virology Journal,10:250)。 0036 实施例 2 ： 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对细胞的细胞毒性以及对肠道病毒 71 型造成 的细胞病变效应的抑制作用 0037 取对数生长期的 RD 细胞和 RDS 细胞， 分别以 3104个 / 孔和 6104个 / 孔的浓 度接入 96 孔培养板， 培养 24 小时。RD 细胞和 RDS 细胞均在 37和 5 CO2下培养， ， 其中 培养RD细胞使用的培养液为补充有10胎牛血清的DMEM培养基(简称为10FBS-DMEM， FBS( 胎牛血清 ) 和 DMEM 均购自 。
17、Sigma)， 培养 RDS 细胞使用的培养液为含有 0.5g/ml 嘌 呤霉素 ( 购自 Clontech) 的 10 FBS-DMEM。 0038 向各孔加入50L含不同浓度的华蟾酥毒基或酯蟾毒配基(购自中国药品生物制 说 明 书 CN 105560254 A 5 4/11 页 6 品检定所 ) 的 DMEM 细胞培养液 ( 购自 Sigma)， 使华蟾酥毒基的终浓度为 2000nM,1000nM, 500nM,250nM,125nM,62.50nM,31.25nM,15.62nM,7.81nM,3.91nM ； 酯蟾毒配基的终浓度为 50000nM,25000nM,12500nM,625。
18、0nM,3125nM,1563nM,781nM,391nM,195nM,98nM。每个浓度 设 3 个复孔， 继续培养细胞 48 小时， 用荧光细胞活性检测试剂盒 ( 购自 Promega 公司 ) 检 测细胞活性。操作按照试剂盒说明书进行， 在多标记微孔板检测系统 (Multilabel Plate Reader 2030， 购自 Perkin Elmer 公司 ) 上测定 560nm 下的荧光值， 荧光值的大小反映细胞 的活性。 0039 在检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对由 EV71 造成的细胞病变效应的抑制作用时， 加药的同时各孔加入 50L EV71 病毒 (EV71-C4b， 获自吉林。
19、大学艾滋病疫苗国家工程实验 室， 参见 Li et al.Virology Journal,10:250) 进行感染 ( 该病毒在 RDS/RD 细胞中的感染 复数为 0.008)， 继续培养细胞 48 小时后， 如上所述测定 560nm 下的荧光值。 0040 同时还设置了仅加入DMEM细胞培养液处理的细胞对照及仅加入EV71进行感染的 病毒对照， 除了加入的物质不同以外， 其他操作同上。 0041 细胞毒性用 CC50( 细胞存活率为 50时的药物浓度 ) 表示， 细胞存活率 ( 给药 组荧光值 / 细胞对照组荧光值 )100 ； 0042 EV71 细胞病变效应抑制率 ( 感染 EV71。
20、 并给药组荧光值 - 感染 EV71 对照组荧 光值 )/ 细胞对照组荧光值 100 ； 根据不同浓度的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对每孔细 胞病变效应的抑制率分别算出抑制率为 50时的药物浓度， 用半数抑制浓度 IC50表示 ； 0043 药物抗 EV71 的效果以治疗指数 SI50评价， SI50 CC50/IC50， 独立实验重复两次， 结 果取两次平均值。 0044 实验结果如下 ： 0045 表 1 华蟾酥毒基对 RDS 细胞的细胞毒性及对 EV71 的抑制率 0046 说 明 书 CN 105560254 A 6 5/11 页 7 0047 表 2 华蟾酥毒基对 RD 细胞的细胞毒性及对。
21、 EV71 抑制率 0048 0049 表 3 酯蟾毒配基对 RDS 细胞的细胞毒性及对 EV71 的抑制率 0050 说 明 书 CN 105560254 A 7 6/11 页 8 0051 表 4 酯蟾毒配基对 RD 细胞的细胞毒性及对 EV71 的抑制率 0052 说 明 书 CN 105560254 A 8 7/11 页 9 0053 表 5 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对 RDS 细胞的治疗效果 0054 0055 0056 表 6 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对 RD 细胞的治疗效果 0057 0058 这些结果结果表明 ： 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对RDS细胞株的细胞毒性很低(CC50 分别为。
22、 1277.24nM 和 1385.41nM)， 而且对 EV71 造成的细胞病变效应有一定的抑制作用 ； 说 明 书 CN 105560254 A 9 8/11 页 10 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在 RDS 细胞中对 EV71 的半数抑制浓度 IC50分别为 10.94nM 和 218.31nM(表5) ； 可用治疗指数SI50综合评价华蟾酥毒基和酯蟾毒配基药物抗EV71病毒的 效果， 当 SI502 时为有效， SI50 1 时既有效又有毒， SI501 时为毒性作用较强， 华蟾酥毒基 和酯蟾毒配基在 RDS 细胞中对 EV71 的 SI50分别为 116.73 和 6.35， 表明华蟾酥毒。
23、基和酯蟾 毒配基是低毒性且具有抗 EV71 作用的药物。 0059 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对 RD 细胞株也具有较低的细胞毒性 (CC50分别为 58.05nM 和 1291.66nM)， 它们对 EV71 造成的细胞病变效应也有一定的抑制作用 ( 但效果不 明显 ； 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在 RD 细胞中对 EV71 的半数抑制浓度 IC50分别为 31.05nM 和 433.84nM( 表 6) ； 根据华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的治疗指数 SI50进行综合评价， 发现华 蟾酥毒基和酯蟾毒配基在 RD 细胞中对 EV71 的 SI50分别为 1.87 和 0.34， SI50酯蟾毒配基 在 R。
24、D 细胞中对 EV71 的 SI501， 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基有较强的毒性作用。 0060 实施例 3 ： 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对 EV71 造成的空斑形成的抑制作用 0061 取对数生长期的 RDS 细胞， 以 6105个 / 孔的浓度接入 12 孔培养板， 培养 24 小 时。 0062 各孔吸去培养基， 加入300L含不同浓度华蟾酥毒基的DMEM细 胞培养液使其终 浓度为 62.50nM,31.25nM,15.63nM,7.81nM,3.90nM 或加入 300L 含不同浓度酯蟾毒配基 的 DMEM 细胞培养液， 使其终浓度为 1563nM,781nM,391nM,195nM,98n。
25、M， 每个浓度设 3 个复 孔 ； 加药的同时各孔加入300L EV71(100 PFU/孔)病毒感染 ； 并设置仅加入DMEM细胞培 养液的细胞对照及仅加入加 EV71 感染的病毒对照 ； 继续培养细胞 1 小时后， 吸去培养液上 清并用无菌 PBS 漂洗细胞两遍， 向加药组加入含相应浓度华蟾酥毒基或酯蟾毒配基的 1 琼脂2FBS-DMEM培养基， 向细胞对照和病毒对照组加入1琼脂2FBS-DMEM培养基， 来 覆盖细胞 ； 待培养基凝固后， 倒置培养 72 小时， 观察空斑 ； 观察后用结晶紫 ( 购自北京鼎国 公司 ) 染色， 计数空斑。 0063 EV71 空斑形成抑制率 ( 感染 E。
26、V71 对照组空斑数 - 感染 EV71 并给药组空斑 数 )/ 感染 EV71 对照组空斑数 100； 根据不同浓度的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对每孔 空斑形成的抑制率分别算出抑制率为 50时的药物浓度， 用 EC50表示。 0064 实验结果如下 ： 0065 表 7 华蟾酥毒基对 EV71 空斑形成的抑制率 0066 说 明 书 CN 105560254 A 10 9/11 页 11 0067 表 8 酯蟾毒配基对 EV71 空斑形成的抑制率 0068 0069 0070 结果表明 ： 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对 EV71 的空斑形成均有明显的抑制作用， 且 呈浓度依赖性 ； 经计算， 华蟾酥。
27、毒基在 RDS 细胞中对 EV71 的半数空斑抑制浓度 EC50分别为 24.99nM ； 酯蟾毒配基在 RDS 细胞中对 EV71 的半数空斑抑制浓度 EC50分别为 330nM， 与实施 例 2 中计算出的半数抑制浓度 IC50很接近。该实验再次证明华蟾酥毒基和酯蟾毒配基是具 有抗 EV71 作用的药物。 0071 实施例 4 ： 华蟾酥毒基 / 酯蟾毒配基对 RDS 细胞中 EV71 病毒衣壳蛋白合成的抑制 作用 0072 取对数生长期的 RDS 细胞， 以 2.5106个 / 瓶的浓度接入小培养瓶中， 培养 24 小 时。 0073 各瓶加入2.5mL含不同浓度华蟾酥毒基的10FBS-。
28、DMEM细胞培养液， 使其终浓度 为125nM,62.50nM,31.25nM,15.63nM,7.81nM,3.90nM或加入2.5mL含不同浓度酯蟾毒配基 的 10 FBS-DMEM 细胞培养液， 使其终浓度为 1563nM,781nM,391nM,195nM,98nM， 每个浓度 设 3 个复瓶 ； 加药的同时各孔加入 2.5mL EV71( 感染复数 (MOI) 1) 病毒感染 ； 并设置仅 加入 10 FBS-DMEM 细胞培养液的细胞对照及仅加入加 EV71 感染的病毒对照 ； 继续培养细 胞 12 小时后， 吸去培养液上清并用无菌 PBS 漂洗细胞两遍， 用 200L 无菌 PB。
29、S 重悬并在液 说 明 书 CN 105560254 A 11 10/11 页 12 氮中反复冻融 3 次， 10000rpm 离心 1min， 取上清用 EV71 抗原 ELISA 检测试剂盒 ( 购自北京 天成新脉生物技术有限公司 ) 检测病毒衣壳蛋白浓度变化情况。药物对 EV71 病毒衣壳蛋 白抑制率 ( 感染 EV71 组衣壳蛋白水平 - 感染 EV71 并给药组衣壳蛋白水平 )/ 感染 EV71 组衣壳蛋白水平 100 0074 实验结果如下 ： 0075 表 9 华蟾酥毒基对 EV71 病毒衣壳蛋白合成的抑制率 0076 0077 0078 表 10 酯蟾毒配基对 EV71 病毒衣。
30、壳蛋白合成的抑制率 0079 0080 结果表明 ： 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基均对 EV71 病毒衣壳蛋白的合成有抑制作用， 且呈浓度依赖性 ； 从分子水平上进一步证明华蟾酥毒基和酯蟾毒配基具有抗 EV71 作用， 可 以用作预防和治疗抗 EV71 的药物。 0081 参考文献 ： 说 明 书 CN 105560254 A 12 11/11 页 13 0082 1.Zhu,Q.C.,Wang,Y.,Liu,Y.P.,Zhang,R.Q.,Li,X.,Su,W.H.,Long,F.,Luo,X. D.,Peng,T.,2011.Inhibition of enterovirus 71 replic。
31、ation by chrysosplenetin and penduletin.European journal of pharmaceutical sciences:offi cial journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 44,392-398. 0083 2.Cui X,Inagaki Y,Xu H,Wang D,Qi F,Kokudo N,Fang D,Tang W.,2010. Anti-hepatitis B virus activities of cinobufacini and its act。
32、ive components bufalin and cinobufagin in HepG2.2.15 cells.Biol Pharm Bull33,1728-1732 0084 3.Li X,Fan P,Jin J,Su W,An D,Xu L,Sun S,Zhang Y,Meng X,Gao F,Kong W,Jiang C.,2013.Establishment of cell lines with increased susceptibility to EV71/CA16 by stable overexpression of SCARB2.Virol J10(250) 0085 所有的参考文献以引用的方式全文纳入本文。 说 明 书 CN 105560254 A 13 。