技术领域
本发明涉及甘草香豆素作为PBK/TOPK蛋白抑制剂的一种新用途。
背景技术
一直以来，癌症被认为是人类的“头号杀手”，被称为不治之症。国际癌症研究机 构发表的《2014年世界癌症报告》显示，2012年，全球新增癌症病例达到1400多万 例，并预计在未来20年达到每年2200万的水平，同期癌症死亡人数也将从每年820 万飙升至1300万。
2000年，Gaudet等在Hela细胞cDNA文库中克隆出了一种与hDlg(human homologueoftheDrosophilaDiscs-large)分子PDZ结构域结合的分子 PBK(PDZbinding-kinase,PBK)。同年，Abe等在活化型淋巴因子激活的杀伤性T细胞 (lymphokine-activatedkillerTcells，T-LAKcells)的cDNA文库中,克隆和表 达出新型蛋白激酶T-LAK细胞源蛋白激酶PBK/TOPK(T-LAKcelloriginatedprotein kinase,PBK/TOPK),通过序列分析发现两者为同一种分子,即命名为PBK/PBK/TOPK蛋 白。
PBK/TOPK蛋白是一种有丝分裂激酶，在许多恶性肿瘤中高表达，比如血液肿瘤、 结肠癌、乳腺癌、肺癌和胆管癌。另外，由于PBK在调节肿瘤细胞有丝分裂，细胞周 期、凋亡以及细胞恶性转化中都起着非常重要的作用。PBK/TOPK有可能成为广谱性的 肿瘤潜在的药物开发靶点。PBK/TOPK能够调控细胞周期，促进肿瘤细胞增殖并且能够 诱导肿瘤细胞抵抗凋亡。目前，PBK/TOPK与肿瘤关系的研究日益受到关注，靶向 PBK/TOPK的特异性阻断剂已被应用于肿瘤治疗研究中。
发明内容
本发明的目的是提供甘草香豆素作为PBK/TOPK蛋白抑制剂中的一种新用途。
本发明首先保护甘草香豆素在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a)和 /或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)和/或(g)和/或(h)和/或(i) 和/或(j)和/或(k)和/或(l)：
(a)抑制肿瘤细胞增殖；
(b)诱导肿瘤细胞凋亡；
(c)抑制PBK/TOPK蛋白磷酸化；
(d)抑制histoneH3磷酸化；
(e)与PBK/TOPK蛋白结合；
(f)检测PBK/TOPK蛋白；
(g)抑制PBK/TOPK蛋白的活性；
(h)抑制PBK/TOPK蛋白表达；
(i)降低细胞中的PBK/TOPK蛋白水平；
(j)降低细胞中的磷酸化PBK/TOPK蛋白水平；
(k)降低细胞中的磷酸化histoneH3水平；
(l)治疗肿瘤。
所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞。所述 (a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞细胞。 所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞株或人前列腺癌 细胞细胞。所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为HepG2细胞、HCT-116细胞、DU-145 细胞或Huh-7细胞。
所述(i)和/或(j)和/或(k)中，所述细胞为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞为表达 PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞 细胞。所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞株或人前列腺癌细胞细胞。所述肿 瘤细胞为HepG2细胞、HCT-116细胞、DU-145细胞或Huh-7细胞。
所述(l)中，所述肿瘤为表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞引起的肿瘤。所述(l) 中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞细 胞。所述(l)中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞 株或人前列腺癌细胞细胞。所述(l)中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为HepG2 细胞、HCT-116细胞、DU-145细胞或Huh-7细胞。
本发明还保护一种产品，其活性成分为甘草香豆素；所述产品的用途为如下((a) 和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)和/或(g)和/或(h)和/ 或(i)和/或(j)和/或(k)和/或(l)：
(a)抑制肿瘤细胞增殖；
(b)诱导肿瘤细胞凋亡；
(c)抑制PBK/TOPK蛋白磷酸化；
(d)抑制histoneH3磷酸化；
(e)与PBK/TOPK蛋白结合；
(f)检测PBK/TOPK蛋白；
(g)抑制PBK/TOPK蛋白的活性；
(h)抑制PBK/TOPK蛋白表达；
(i)降低细胞中的PBK/TOPK蛋白水平；
(j)降低细胞中的磷酸化PBK/TOPK蛋白水平；
(k)降低细胞中的磷酸化histoneH3水平；
(l)治疗肿瘤。
所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞。所述 (a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞细胞。 所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞株或人前列腺癌 细胞细胞。所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤细胞为HepG2细胞、HCT-116细胞、DU-145 细胞或Huh-7细胞。
所述(i)和/或(j)和/或(k)中，所述细胞为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞为表达 PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞 细胞。所述肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞株或人前列腺癌细胞细胞。所述肿 瘤细胞为HepG2细胞、HCT-116细胞、DU-145细胞或Huh-7细胞。
所述(l)中，所述肿瘤为表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞引起的肿瘤。所述(l) 中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为肝癌细胞、结肠癌细胞株或前列腺癌细胞细 胞。所述(l)中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为人肝癌细胞、人结肠癌细胞 株或人前列腺癌细胞细胞。所述(l)中，所述表达PBK/TOPK蛋白的肿瘤细胞为HepG2 细胞、HCT-116细胞、DU-145细胞或Huh-7细胞。
以上任一所述PBK/TOPK蛋白(TOPK蛋白)具体可如序列表的序列1所示。
本发明的发明人用一系列生物实验证明了甘草香豆素可以通过与PBK/TOPK蛋白 的直接互作从而抑制PBK/TOPK蛋白的活性，从而抑制PBK/TOPK高表达的恶性肿瘤。
由于PBK在调节肿瘤细胞有丝分裂，细胞周期、凋亡以及细胞恶性转化中都起着 非常重要的作用。PBK/TOPK有可能成为广谱性的肿瘤潜在的药物开发靶点。本发明为 研制PBK/TOPK抑制剂及应用于肿瘤治疗的靶向PBK/TOPK的特异性阻断剂提供充分的 理论依据。
本发明对于肿瘤治疗具有巨大的应用价值，在防癌抗癌，保护人体健康方面具有 广泛前景，能获得很好的社会效益。本发明首次发现甘草香豆素可以抑制PBK/TOPK 的表达，为研制组分明确，疗效确切的保健食品或药品提供充分依据，市场前景广阔。
附图说明
图1为实施例1的结果。
图2为实施例2的结果。
图3为实施例3的结果。
图4为实施例4的结果。
图5为实施例5的结果。
图6为实施例6的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。
甘草香豆素如式(Ⅰ)所示，制备方法和表征数据见参考文献(甘草香豆素即文 献中的化合物6a)：朱大元，宋国强,蒋福祥；甘草化学成分的研究-异甘草黄酮醇及 甘草香豆素的结构；化学学报；ACTACHIMICASINICA,1984，42,1080-1084。
HepG2细胞(人肝癌细胞株)：ATCC，HB-8065。HCT-116细胞(人结肠癌细胞株)： ATCC，CCL-247。DU-145细胞(人前列腺癌细胞株)：ATCC，HTB-81。Huh-7细胞(人肝 癌细胞株)：RIKENCellBank，RCB1366。胰酶：北京索莱宝科技有限公司，T1300。
甘草香豆素溶液的溶剂为DMSO。
实施例1、甘草香豆素能够抑制PBK/TOPK蛋白的磷酸化
本实施例中采用的表达PBK/TOPK的肿瘤细胞为HepG2细胞、HCT-116细胞、DU-145 细胞或Huh-7细胞，分别进行如下操作：
1、取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化后用特定培养液制成浓度为3×105个细 胞/mL的细胞悬液。HepG2细胞采用的特定培养液为含10％(体积比)胎牛血清的DMEM 培养液。Huh-7细胞采用的特定培养液为含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养液。 DU-145细胞采用的特定培养液为含10％(体积比)胎牛血清的RPMI1640培养液。HCT-116 细胞采用的特定培养液为含10％(体积比)胎牛血清的McCoy’s5A培养液。
2、取步骤1得到的细胞悬液，接种于6孔培养板(每孔2mL)，培养至细胞贴壁 且丰度达到80％。
3、完成步骤2后，取所述6孔培养板，吸弃上清液，然后分组处理如下：
试验组一：每孔加入2mL25μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
试验组二：每孔加入2mL50μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
试验组三：每孔加入2mL75μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
对照组：每孔加入2mLDMSO，培养24小时；
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置6个重复处理。
4、完成步骤3后，取细胞，提取总蛋白，然后进行westernblot检测。western blot检测中，用于检测p-PBK/TOPK的一抗为抗p-PBK/TOPK(CST,4941)，用于检测 β-actin的一抗为抗β-actin(CST,4970)，二抗为兔二抗(MBL,458))。最后使用ECL 发光试剂盒(北京普瑞金科技有限公司，E500)进行显影。
结果见图1。结果表明，甘草香豆素处理后，p-PBK/TOPK的水平显著降低，且呈 剂量依赖效应。
实施例2、甘草香豆素能够抑制PBK/TOPK蛋白下游靶蛋白histoneH3的磷酸化
1、取HepG2细胞，胰酶消化后用含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养液悬浮， 得到浓度为3×105个细胞/ml的细胞悬液。
2、取步骤1得到的细胞悬液，接种于6孔培养板(每孔2mL)，培养至细胞丰度 达到80％。
3、完成步骤2后，取所述6孔培养板，吸弃上清液，然后分组处理如下：
试验组一：每孔加入2mL25μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
试验组二：每孔加入2mL50μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
试验组三：每孔加入2mL75μmol/L甘草香豆素溶液，培养24小时；
对照组：每孔加入2mLDMSO，培养24小时；
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置6个重复处理。
4、完成步骤3后，取细胞，提取总蛋白，然后进行westernblot检测。western blot检测中，用于检测p-histoneH3的一抗为抗p-histoneH3(CST,3642S)，用于检 测β-actin的一抗为抗β-actin(CST,4970)，二抗为兔二抗(MBL,458))。最后使用 ECL发光试剂盒(北京普瑞金科技有限公司，E500)进行显影。
结果见图2。结果表明，甘草香豆素处理后，p-histoneH3的水平显著降低，且 呈剂量依赖效应。
实施例3、甘草香豆素能够与PBK/TOPK蛋白直接相互作用。
一、甘草香豆素-Sepharose4B珠子复合体的制备。
1、Sepharose4B(GE，17-0430-01)在1mMHCl水溶液中洗涤三次以使其充分溶 胀，然后置于含有10mM甘草香豆素的孵育液中4℃孵育16小时。
2、完成步骤1后，取Sepharose4B，用孵育液洗涤5次，然后在封闭液中4℃封 闭16小时。
3、完成步骤2后，取Sepharose4B，用洗液Ⅰ洗涤3次，再用洗液Ⅱ洗涤3次， 然后重悬于PBS缓冲液中，得到甘草香豆素-Sepharose4B珠子复合体。
孵育液(pH8.3)：含0.1MNaHCO3和0.5MNaCl的水溶液。
封闭液(pH8.0)：0.1MTris-HCl水溶液。
洗液Ⅰ：pH4.0、0.1M醋酸缓冲液。
洗液Ⅱ(pH8.0)：含0.1MTris-HCl和0.5MNaCl的水溶液。
PBS缓冲液：北京索莱宝科技有限公司，P1020。
用等体积DMSO代替甘草香豆素，其他同步骤一，得到DMSO-Sepharose4B珠子复 合体。
二、TOPK蛋白的制备
TOPK蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
1、将序列表的序列2自5’末端第389-1357(开放阅读框)所示的双链DNA分子 插入pET-46(pET-46Ek/LICkit中的组件，Novagen,USA)的多克隆位点，得到重组 质粒pETa46-WT-TOPK。
2、将步骤1得到的重组质粒pETa46-WT-TOPK导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
3、在37℃条件下培养步骤2得到的重组菌，培养过程中加入IPTG以诱导目的蛋 白表达，诱导4h后收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，超声破碎，然后离心并收取上清液。
5、取步骤4得到的上清液，按25:1的比例加入Nibeads(NOvagen公司， 139280054)，4℃颠倒16h。
6、完成步骤5后，3000rpm离心10min，收集Beads沉淀物。
7、重复进行三次如下步骤：取上一步骤得到的沉淀物，加40ml冰冷PNI20washing buffer(20mM磷酸盐、0.5MNaCl、20mM咪唑，余量为水)，悬浮(敲打)，然后4℃ 颠倒5min,然后3000rmp离心10min，收集沉淀。
8、取步骤7得到的沉淀物，用40mlPNI40washingbuffer(20mM磷酸盐、0.5M NaCl、40mM咪唑，余量为水)漂洗3次，收集沉淀。
9、取步骤8得到的沉淀物，用7.5mlPNI400elutionbuffer(20mM磷酸盐、0.5M NaCl、400mM咪唑，余量为水)悬浮,颠倒10min,3000rpm离心10min,取上清，即为 TOPK蛋白溶液。
10、取步骤9得到的TOPK蛋白溶液，分装，-80℃保存备用。
三、体外pull-down实验
将珠子复合体(甘草香豆素-Sepharose4B珠子复合体或DMSO-Sepharose4B珠 子复合体)进行如下步骤：
1、将珠子复合体与PBK/TOPK纯蛋白在反应液中4℃孵育16小时。
反应液：50mMTris(pH7.5),5mMEDTA,150mMNaCl,1mMDTT,0.01％NP-40, 2μg/ml牛血清白蛋白，0.02mMPMSF和1xproteaseinhibitors。
2、完成步骤1后，取珠子复合体，用Tris缓冲液洗涤5次，利用westernblot 方法检测甘草香豆素与PBK/TOPK蛋白的结合情况。
Tris缓冲液：50mMTris(pH7.5),5mMEDTA,250mMNaCl,1mMDTT,0.01％NP-40 和0.02mMPMSF。
结果见图3。DMSO-Sepharose4B珠子本身不能结合PBK/TOPK蛋白，而甘草香豆 素-Sepharose4B珠子可以与PBK/TOPK蛋白直接作用并结合。
实施例4、利用三维定量构效关系模型进行计算机模拟PBK/TOPK蛋白与甘草香豆 素的直接作用。
利用分析软件获得PBK/TOPK蛋白的预测空间三维结构。并将PBK/TOPK蛋白与甘 草香豆素的空间三维结构进行分子对接。
结果见图4。甘草香豆素结合于PBK/TOPK蛋白的ATP结合位点(图4A、B),且与 该位点嵌合良好(图4C)。甘草香豆素的末端烯烃结构能与ATP结合位点的第46、198、 174位缬氨酸及第115位蛋氨酸具有疏水相互作用，形成疏水补丁；同时，甘草香豆 素的羟基基团能够与ATP结合位点的第64、121位赖氨酸及第186位的天门冬氨酸形 成氢键(图4D)。综上，甘草香豆素通过以上相互作用力与PBK/TOPK蛋白直接作用
实施例5、结晶紫法检测甘草香豆素对HepG2细胞增殖的影响
1、取HepG2细胞，胰酶消化后用含10％胎牛血清的DMEM培养液悬浮，得到浓度 为3×105个细胞/ml的细胞悬液。
2、取步骤1得到的细胞悬液，接种于6孔培养板(每孔2mL)，培养至细胞丰度 达到80％。
3、完成步骤2后，取所述6孔培养板，吸弃上清液，然后分组处理如下：
试验组一：每孔加入2mL25μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
试验组二：每孔加入2mL50μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
试验组三：每孔加入2mL75μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
对照组：每孔加入2mLDMSO，培养36小时；
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置6个重复处理。
4、完成步骤3后，取所述6孔培养板，吸弃上清液，用PBS缓冲液洗涤两次，然 后每孔加入2ml2.5％戊二醛溶液并振荡反应15分钟，吸弃上清液，用PBS缓冲液洗 涤两次，然后每孔加入2ml0.02％结晶紫溶液并振荡反应30分钟，吸弃上清液，用蒸 馏水洗涤5次，倒置，将6孔培养板中水倒净，用滤纸吸干，室温干燥30min。
5、完成步骤4后，取所述6孔培养板，用酶标仪于570nm波长下测定吸光度。
结果见图5。甘草香豆素抑制HepG2细胞增殖，且呈剂量依赖效应。
实施例6、流式细胞仪检测甘草香豆素诱导HepG2细胞凋亡
1、取HepG2细胞，胰酶消化后用含10％胎牛血清的DMEM培养液悬浮，得到浓度 为3×105个细胞/ml的细胞悬液。
2、取步骤1得到的细胞悬液，接种于6孔培养板(每孔2mL)，培养至细胞丰度 达到80％。
3、完成步骤2后，取所述6孔培养板，吸弃上清液，然后分组处理如下：
试验组一：每孔加入2mL25μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
试验组二：每孔加入2mL50μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
试验组三：每孔加入2mL75μmol/L甘草香豆素溶液，培养36小时；
对照组：每孔加入2mLDMSO，培养36小时；
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置6个重复处理。
4、完成步骤3后，取所述6孔培养板中的细胞，进行胰酶消化，然后用PBS洗涤 两次。
5、完成步骤4后，取细胞，依照AnnexinV/PI说明书(MBL4700)将其悬于含 有5μLAimexinV和10μlPI的85μL结合缓冲液中避光常温孵育15分钟，补加400 μl结合缓冲液后立即与流式细胞仪(BeckmanCoulter，EpicsXL)上测定并记录染 料的荧光强度。
结果见图6。甘草香豆素诱导HepG2细胞凋亡，且呈剂量依赖效应。
综上，研究数据充分表明，甘草香豆素能够与PBK/TOPK蛋白直接作用从而抑制其 表达，表明其可称为一种PBK/PBK/TOPK的抑制剂及应用在PBK/TOPK高表达的恶性肿 瘤治疗中，具有良好的开发应用前景。