一种阿霉素与膜联蛋白V偶联物及其制备方法和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110217929.6	申请日：	20110801
公开号：	CN102294018B	公开日：	20180123
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K38/17,A61K31/704,A61P35/00	主分类号：	A61K38/17,A61K31/704,A61P35/00
申请人：	南京大学
发明人：	华子春,谢德
地址：	210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路22号
优先权：	CN201110217929A
专利代理机构：	南京知识律师事务所	代理人：	胡锡瑜
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内容摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及一种具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的膜联蛋白V及其变体分子与抗癌药物阿霉素的偶联、制备方法及应用，以1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺为交联剂与阿霉素偶联，以及制备可溶性偶联物的方法。制备的偶联物具有更好的抗肿瘤活性，为进一步研究靶向抗肿瘤药物及其应用奠定了基础。

权利要求书

1.一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物，其特征是将膜联蛋白V的羧基与阿霉素的氨基通过小分子交联剂偶联，其中小分子交联剂是指N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺。 2.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，其特征是将膜联蛋白V先后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，然后加入阿霉素溶液进行反应，再加入2-巯基乙醇中和未反应的交联剂，终止偶联反应，然后对制备获得的絮状沉淀反应产物用含高盐的磷酸缓冲进行溶解；其中，所述的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的终浓度为5-15mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75-1.17。 3.根据权利要求2所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，其特征是制备的偶联物的分离方法是将制备获得絮状沉淀反应产物用含高盐的磷酸缓冲液溶解和稀释，进行超滤浓缩，重复稀释-浓缩过程直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。 4.权利要求1所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及阿霉素与膜联蛋白V的偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

阿霉素是一种蒽环类抗生素，用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等癌症，抗癌谱比较广。周密等人（Zhou, M.等人，2008，复旦学报*医药版，35:793-798）研究发现阿霉素是通过内源性的caspase-3途径诱导肝癌细胞凋亡。阿霉素对正常细胞也发生作用，造成很大的毒副作用，主要表现为心肌毒性、骨髓抑制和神经毒性。阿霉素对心肌组织的亲和力明显高于其他组织，造成心肌毒性。由于阿霉素对于肿瘤靶向性差、因此药物的副作用大。如何提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性成为阿霉素临床应用的一个重大难题。

膜联蛋白V是一种人体内源性蛋白，属于Ca 2 +依赖性磷脂结合蛋白家族，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合，它具有抗凝及抗炎的作用。近年来还发现膜联蛋白V具有抗肿瘤的作用。在肿瘤生长的过程中，肿瘤细胞会产生表面富含磷脂酰丝氨酸的微泡，微泡中含有可以促进肿瘤血管新生的表皮生长因子受体等物质。膜联蛋白V通过阻止这些微泡与肿瘤血管上皮细胞的融合，从而抑制了肿瘤血管新生和肿瘤的生长。膜联蛋白V蛋白在体内可以与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合。

发明内容

为了提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤活性，本发明的目的在于提供一种提高阿霉素抗肿瘤活性的方法及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物上的应用。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一种膜联蛋白V与阿霉素的偶联物，其中膜联蛋白V是指具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的野生型膜联蛋白V及其突变体或者截短体分子。

上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，可以通过下述步骤进行：

（1）膜联蛋白V活化：将膜联蛋白V溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），EDC能够将含有羧基的分子和含有氨基的分子偶联，加入不同浓度Sulfo-NHS用以增强偶联效果。

（2）活化反应中止：加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。

（3）浓缩中间产物：用截留分子量为10KD的超滤管离心浓缩中间产物溶液。

（4）偶联反应：将盐酸阿霉素饱和溶液与浓缩后的膜联蛋白V活化中间产物混合，室温搅拌反应。反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。

（5）膜联蛋白V-阿霉素偶联物的溶解与纯化：用含8M尿素的溶液溶解反应体系中产生的偶联物絮状沉淀，然后用0.1 M磷酸钠溶液稀释产物溶液，并反复进行浓缩和重复稀释过程，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。

上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的检测方法，可以通过下述步骤进行：

偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定蛋白质含量，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算。将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，扫描范围为190～700 nm。

上述制备的偶联物可以用以制备抗肿瘤药物。

与已有的技术相比，本发明有以下有益效果：（1）制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物利用了膜联蛋白V本身即具有抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长的活性、同时又能够与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合的性质，将阿霉素与膜联蛋白V偶联，通过增强阿霉素对肿瘤靶向性来达到增强阿霉素抗肿瘤活性的目的。利用该方法制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物1 μM时，细胞存活率仅为27.7%，而达到相同抑制率，阿霉素需要1.8 μM。因此，所需偶联物的剂量仅为阿霉素的55.6%。（2）在合成膜联蛋白V-阿霉素偶联物的反应过程中，除众所周知的偶联底物膜联蛋白V、阿霉素及偶联剂EDC的用量及其比例对于偶联物的得率具有很大影响外，N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）的浓度也对偶联物产生较大的影响。如果Sulfo-NHS 的终浓度为5 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75；当将Sulfo-NHS的浓度提高到15 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:1.17。Sulfo-NHS的浓度也对偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的比例、也就是偶联物的效率和质量产生较大的影响。（3）建立了膜联蛋白V-阿霉素偶联物絮状沉淀的溶解与纯化方法。由于阿霉素的疏水性，偶联物在生成后会形成絮状沉淀，但是制备的药物在应用中则要求偶联物必须是溶解状态的。本发明通过采用含有8 mol/L尿素的溶液将偶联物溶解，再将溶液换为0.1 M磷酸钠（pH=7.5）溶液，偶联物可以在此溶液中稳定存在，并具有良好的生物活性，为偶联物的应用提供了便利条件。

附图说明：

图1膜联蛋白V和阿霉素偶联物的紫外吸收光谱鉴定。

1：偶联物吸收光谱；2：膜联蛋白V吸收光谱；3：阿霉素吸收光谱；4：滤过液吸收光谱。

图2膜联蛋白V-阿霉素偶联物对MDA-MB-231细胞的杀伤作用。

--●—：膜联蛋白V-阿霉素偶联物；—■—：膜联蛋白V；—◆—：阿霉素；—▲—：膜联蛋白V与阿霉素混合物。

具体实施方式

实施例：

1．活化Annexin V表面的羧基： 2 mg Annexin V冻干粉溶解于2 ml的 0.05 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、0.5 M NaCl，pH=6.0溶液中，调节浓度至1 mg/ml, 加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），使其终浓度在 6 mM。加入N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），使其终浓度在 5 mM，混匀后室温反应15分钟，然后加入 2.8 μl 2-巯基乙醇，浓度至20 mM，反应10分钟，以中和未反应的EDC。

2．活化的Annexin V与阿霉素偶联：用截留分子量为10KD的超滤管离心浓缩中间产物溶液，尽量减少溶液体积，以降低对偶联反应缓冲液pH值的影响。将3 mg盐酸阿霉素加入 0.1M磷酸钠溶液（pH=7.5）中形成饱和溶液，再将超滤管浓缩的中间产物与阿霉素溶液混合，室温搅拌2小时。

3．偶联产物的溶解：反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。用含 8 M尿素的 0.1 M磷酸钠（pH=8.0）溶液溶解。

4．偶联产物的纯化：使用 0.1 M磷酸钠（pH=7.5）稀释产物溶液，进行超滤浓缩，重复稀释-浓缩操作四次，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。

5．偶联物的定量分析：偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算，C阿霉素=A495/10000 (mol/L)-1，其中10000 (mol/L)-1cm-1为阿霉素在495nm处的摩尔吸光系数。

6．偶联物的抗肿瘤活性分析：取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液消化，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成悬液，并稀释成1×104 细胞/ml 备用。取96孔培养板，每孔加入200 μl细胞悬液(含2×103 细胞)。次日，为了模拟癌细胞在体内的状态，先用0.2 mM的过氧化氢处理一小时，然后再加入不同浓度的偶联物、膜联蛋白V、阿霉素、以及阿霉素与膜联蛋白V的混合物，每一浓度重复做4孔。同时设无细胞组作为检测时的背景。置与相应的环境下培养72小时后，每孔加入25 μl MTT（5 mg/ml），继续培养4小时。吸出上清，加入200 μl DMSO，震荡15分钟，用酶标仪测A570值，存活率按下式计算：存活率= A／A0×100％，A0代表肿瘤细胞对照组吸光值，A代表药物处理组吸光值。偶联物的药物浓度以其中含有的阿霉素的浓度为准。

在合成膜联蛋白V-阿霉素偶联物的反应过程中，除众所周知的偶联底物膜联蛋白V、阿霉素及偶联剂EDC的用量及其比例对于偶联物的得率具有很大影响外，N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）的浓度也对偶联物产生较大的影响。例如，在上述反应条件下，如果Sulfo-NHS 的终浓度为5 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75；当将Sulfo-NHS的浓度提高到15 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:1.17。Sulfo-NHS的浓度也对偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的比例、也就是偶联物的效率和质量产生较大的影响。

经过将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，以0.1 M磷酸钠溶液为参照物，扫描范围为190～700 nm，由结果可以看出，偶联物和阿霉素溶液在450～550 nm处有较强的阿霉素特征吸收峰，而膜联蛋白V溶液和滤过液则几乎没有该特征吸收峰（图1），说明偶联反应是成功的。

在本发明的偶联反应的第一步活化反应中，pH值为6.0的情况下，由于膜联蛋白V蛋白上的氨基处于质子化的状态，所以EDC/sulfo-NHS在膜联蛋白V上活化形成的sulfo-NHS酯不会与其它蛋白分子上的氨基发生反应。然后再在反应体系中加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。由于大多蛋白中含有二硫键（包括膜联蛋白V），加入2-巯基乙醇会还原分子内的二硫键，所以在这一步加入2-巯基乙醇并不是适合所有的蛋白。另外，中和EDC这一步要尽量迅速，以免活化的酯水解。使用Sulfo-NHS，而不用NHS，也是为了使活化的酯的水解损失更少。加入含有阿霉素的碱性溶液可以使得阿霉素的氨基能够与活化酯形成酰胺键，完成偶联反应。在疏水小分子与大分子蛋白的偶联物中，偶联在蛋白质上的小分子有可能破坏蛋白的亲水性而产生沉淀，因此，在大多情况下，只能通过降低偶联分子比的方法来解决，但是这样会以牺牲药效为代价。而且，即使这样在有些半抗原的制备时也会产生沉淀。本发明为了解决偶联物容易形成沉淀、难以稳定溶解的难题，用含 8 M尿素的 0.1 M磷酸钠（pH=8.0）溶液溶解偶联物沉淀，然后将偶联物保存在0.1 M磷酸钠（pH=7.5）溶液稳定存在。

药理学试验证明：用上述方法制备并获得的偶联物对H2O2处理的MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤作用优于二者分别单独使用时的效果。MTT实验结果显示：偶联物浓度为1 μmol/L时，肿瘤细胞的存活率仅为27.7% (偶联物的浓度以其中所含阿霉素浓度为准)；而要达到相同的抑制率，单独使用阿霉素则需要1.8 μM。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110217929.6 (22)申请日 2011.08.01 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 102294018 A (43)申请公布日 2011.12.28 (73)专利权人南京大学地址 210093 江苏省南京市鼓楼区汉口路 22号 (72)发明人华子春谢德 (74)专利代理机构南京知识律师事务所 32207 代理人胡锡瑜 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35。

2、/00(2006.01) (56)对比文件 CN 101405017 A,2009.04.08,说明书第4 页. 徐昌金.谷胱甘肽的CdTe量子点的制备及其标记生物分子研究. 中国优秀硕士学位论文全文数据库 .2010, (第7期),22-23. 杨霞等.基于纳米金_功能化壳聚糖生物复合膜修饰的癌胚抗原免疫传感器的研究. 西南大学学报 .2007,第30卷(第7期),56-60. 许岸高等.单克隆抗体与阿霉素偶联物介入治疗胃癌. 现代临床医学生物工程杂志 .1999, 第5卷(第4期),265. 审查员刘超 (54)发明名称一种阿霉素与膜联蛋白V偶联物及其制备方法和应用 (57。

3、)摘要本发明属生物技术领域，具体涉及一种具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的膜联蛋白V及其变体分子与抗癌药物阿霉素的偶联、制备方法及应用，以1-乙基- （3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺为交联剂与阿霉素偶联，以及制备可溶性偶联物的方法。制备的偶联物具有更好的抗肿瘤活性，为进一步研究靶向抗肿瘤药物及其应用奠定了基础。权利要求书1页说明书4页附图1页 CN 102294018 B 2018.01.23 CN 102294018 B 1.一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物，其特征是将膜联蛋白V的羧基与阿霉素的氨基通过小分子交联剂偶联，其中小分子。

4、交联剂是指N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺。 2.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，其特征是将膜联蛋白V先后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，然后加入阿霉素溶液进行反应，再加入2-巯基乙醇中和未反应的交联剂，终止偶联反应，然后对制备获得的絮状沉淀反应产物用含高盐的磷酸缓冲进行溶解；其中，所述的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的终浓度为5-15mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75- 1.17。 3.根据权利要求2所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，其特征是制备的偶联物的分离方法是将制备。

5、获得絮状沉淀反应产物用含高盐的磷酸缓冲液溶解和稀释，进行超滤浓缩，重复稀释-浓缩过程直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。 4.权利要求1所述的一种膜联蛋白V与阿霉素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 102294018 B 2 一种阿霉素与膜联蛋白V偶联物及其制备方法和应用技术领域 0001 本发明属生物技术领域，具体涉及阿霉素与膜联蛋白V的偶联物及其制备方法和应用。背景技术 0002 阿霉素是一种蒽环类抗生素，用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等癌症，抗癌谱比较广。周密等人（Zhou, M.。

6、等人， 2008，复旦学报*医药版， 35:793-798）研究发现阿霉素是通过内源性的caspase-3途径诱导肝癌细胞凋亡。阿霉素对正常细胞也发生作用，造成很大的毒副作用，主要表现为心肌毒性、骨髓抑制和神经毒性。阿霉素对心肌组织的亲和力明显高于其他组织，造成心肌毒性。由于阿霉素对于肿瘤靶向性差、因此药物的副作用大。如何提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性成为阿霉素临床应用的一个重大难题。 0003 膜联蛋白V是一种人体内源性蛋白，属于Ca 2 +依赖性磷脂结合蛋白家族，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合，它具有抗凝及抗炎的作用。近年来还发现膜联蛋白V具有抗肿瘤的。

7、作用。在肿瘤生长的过程中，肿瘤细胞会产生表面富含磷脂酰丝氨酸的微泡，微泡中含有可以促进肿瘤血管新生的表皮生长因子受体等物质。膜联蛋白V通过阻止这些微泡与肿瘤血管上皮细胞的融合，从而抑制了肿瘤血管新生和肿瘤的生长。膜联蛋白V蛋白在体内可以与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合。发明内容 0004 为了提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤活性，本发明的目的在于提供一种提高阿霉素抗肿瘤活性的方法及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物上的应用。 0005 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一种膜联蛋白V与阿霉素的偶联物，其中膜联蛋白V是指具有与磷脂酰丝。

8、氨酸结合能力的野生型膜联蛋白V及其突变体或者截短体分子。 0006 上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，可以通过下述步骤进行： 0007 （1）膜联蛋白V活化：将膜联蛋白V溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）， EDC能够将含有羧基的分子和含有氨基的分子偶联，加入不同浓度Sulfo-NHS用以增强偶联效果。 0008 （2）活化反应中止：加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。 0009 （3）浓缩中间产物：用截留分子量为10KD的超滤管离心浓缩中间产物溶液。 0010 （4）偶联。

9、反应：将盐酸阿霉素饱和溶液与浓缩后的膜联蛋白V活化中间产物混合，室温搅拌反应。反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。 0011 （5）膜联蛋白V-阿霉素偶联物的溶解与纯化：用含8M尿素的溶液溶解反应体系中产生的偶联物絮状沉淀，然后用0.1 M磷酸钠溶液稀释产物溶液，并反复进行浓缩和重复稀释过程，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。说明书 1/4 页 3 CN 102294018 B 3 0012 上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的检测方法，可以通过下述步骤进行： 0013 偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定蛋白质含量，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸。

10、光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算。将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，扫描范围为190700 nm。 0014 上述制备的偶联物可以用以制备抗肿瘤药物。 0015 与已有的技术相比，本发明有以下有益效果：（1）制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物利用了膜联蛋白V本身即具有抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长的活性、同时又能够与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合的性质，将阿霉素与膜联蛋白V偶联，通过增强阿霉素对肿瘤靶向性来达到增强阿霉素抗肿瘤活性的目的。利用该方法制备的膜联蛋白V与阿霉素偶联物1 M时，细胞存活率仅为27.7%，而达到相同。

11、抑制率，阿霉素需要1.8 M。因此，所需偶联物的剂量仅为阿霉素的55.6%。（2）在合成膜联蛋白V-阿霉素偶联物的反应过程中，除众所周知的偶联底物膜联蛋白V、阿霉素及偶联剂EDC的用量及其比例对于偶联物的得率具有很大影响外， N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）的浓度也对偶联物产生较大的影响。如果Sulfo-NHS 的终浓度为5 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75；当将Sulfo-NHS的浓度提高到15 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:1.17。 Sulfo- NHS的浓度也对偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的比例、也就是。

12、偶联物的效率和质量产生较大的影响。（3）建立了膜联蛋白V-阿霉素偶联物絮状沉淀的溶解与纯化方法。由于阿霉素的疏水性，偶联物在生成后会形成絮状沉淀，但是制备的药物在应用中则要求偶联物必须是溶解状态的。本发明通过采用含有8 mol/L尿素的溶液将偶联物溶解，再将溶液换为0.1 M磷酸钠（pH=7.5）溶液，偶联物可以在此溶液中稳定存在，并具有良好的生物活性，为偶联物的应用提供了便利条件。 0016 附图说明： 0017 图1膜联蛋白V和阿霉素偶联物的紫外吸收光谱鉴定。 0018 1：偶联物吸收光谱； 2：膜联蛋白V吸收光谱； 3：阿霉素吸收光谱； 4：滤过液。

13、吸收光谱。 0019 图2膜联蛋白V-阿霉素偶联物对MDA-MB-231细胞的杀伤作用。 0020 -：膜联蛋白V-阿霉素偶联物；：膜联蛋白V；：阿霉素；：膜联蛋白V与阿霉素混合物。具体实施方式 0021 实施例： 0022 1 活化Annexin V表面的羧基： 2 mg Annexin V冻干粉溶解于2 ml的 0.05 mM 2- （N-吗啉代）乙磺酸（MES）、 0.5 M NaCl， pH=6.0溶液中，调节浓度至1 mg/ml, 加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），使其终浓度在 6 mM。加入N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺。

14、（Sulfo-NHS），使其终浓度在 5 mM，混匀后室温反应15分钟，然后加入 2.8 l 2-巯基乙醇，浓度至20 mM，反应10分钟，以中和未反应的EDC。 0023 2 活化的Annexin V与阿霉素偶联：用截留分子量为10KD的超滤管离心浓缩中间产物溶液，尽量减少溶液体积，以降低对偶联反应缓冲液pH值的影响。将3 mg盐酸阿霉素加入 0.1M磷酸钠溶液（pH=7.5）中形成饱和溶液，再将超滤管浓缩的中间产物与阿霉素溶液说明书 2/4 页 4 CN 102294018 B 4 混合，室温搅拌2小时。 0024 3 偶联产物的溶解：反应后，。

15、体系中产生偶联物的絮状沉淀。用含 8 M尿素的 0.1 M磷酸钠（pH=8.0）溶液溶解。 0025 4 偶联产物的纯化：使用 0.1 M磷酸钠（pH=7.5）稀释产物溶液，进行超滤浓缩，重复稀释-浓缩操作四次，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。 0026 5 偶联物的定量分析：偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算， C阿霉素=A495/10000 (mol/L)-1，其中10000 (mol/L)-1cm-1为阿霉素在495nm处的摩尔吸光系数。 0027 6 偶联物的抗肿瘤活。

16、性分析：取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液消化，用含10胎牛血清的DMEM培养液配成悬液，并稀释成1104 细胞/ml 备用。取96孔培养板，每孔加入200 l细胞悬液(含2103 细胞)。次日，为了模拟癌细胞在体内的状态，先用0.2 mM的过氧化氢处理一小时，然后再加入不同浓度的偶联物、膜联蛋白V、阿霉素、以及阿霉素与膜联蛋白V的混合物，每一浓度重复做4孔。同时设无细胞组作为检测时的背景。置与相应的环境下培养72小时后，每孔加入25 l MTT （5 mg/ml），继续培养4小时。吸出上清，加入200。

17、 l DMSO，震荡15分钟，用酶标仪测A570值，存活率按下式计算：存活率= A A0100， A0代表肿瘤细胞对照组吸光值， A代表药物处理组吸光值。偶联物的药物浓度以其中含有的阿霉素的浓度为准。 0028 在合成膜联蛋白V-阿霉素偶联物的反应过程中，除众所周知的偶联底物膜联蛋白 V、阿霉素及偶联剂EDC的用量及其比例对于偶联物的得率具有很大影响外， N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）的浓度也对偶联物产生较大的影响。例如，在上述反应条件下，如果Sulfo-NHS 的终浓度为5 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:0.75；当将 Su。

18、lfo-NHS的浓度提高到15 mM，偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的分子比为1:1.17。 Sulfo- NHS的浓度也对偶联物中膜联蛋白V和阿霉素的比例、也就是偶联物的效率和质量产生较大的影响。 0029 经过将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，以 0.1 M磷酸钠溶液为参照物，扫描范围为190700 nm，由结果可以看出，偶联物和阿霉素溶液在450550 nm处有较强的阿霉素特征吸收峰，而膜联蛋白V溶液和滤过液则几乎没有该特征吸收峰（图1），说明偶联反应是成功的。 0030 在本发明的偶联反应的第一步活化反应中， pH值为6.0的。

19、情况下，由于膜联蛋白V 蛋白上的氨基处于质子化的状态，所以EDC/sulfo-NHS在膜联蛋白V上活化形成的sulfo- NHS酯不会与其它蛋白分子上的氨基发生反应。然后再在反应体系中加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。由于大多蛋白中含有二硫键（包括膜联蛋白V），加入2-巯基乙醇会还原分子内的二硫键，所以在这一步加入2-巯基乙醇并不是适合所有的蛋白。另外，中和EDC这一步要尽量迅速，以免活化的酯水解。使用Sulfo-NHS，而不用NHS，也是为了使活化的酯的水解损失更少。加入含有阿霉素的碱性溶液可以使得阿霉素的氨基能够与活化酯形成酰胺键，完成偶联反应。。

20、在疏水小分子与大分子蛋白的偶联物中，偶联在蛋白质上的小分子有可能破坏蛋白的亲水性而产生沉淀，因此，在大多情况下，只能通过降低偶联分子比的方法来解决，但是这样会以牺牲药效为代价。而且，即使这样在有些半抗原的制备时也会产生沉淀。本发明为了解决偶联物容易形成沉淀、难以稳定溶解的难题，用含 8 M尿素的 0.1 M磷酸说明书 3/4 页 5 CN 102294018 B 5 钠（pH=8.0）溶液溶解偶联物沉淀，然后将偶联物保存在0.1 M磷酸钠（pH=7.5）溶液稳定存在。 0031 药理学试验证明：用上述方法制备并获得的偶联物对H2O2处理的MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤作用优于二者分别单独使用时的效果。 MTT实验结果显示：偶联物浓度为1 mol/L时，肿瘤细胞的存活率仅为27.7% (偶联物的浓度以其中所含阿霉素浓度为准)；而要达到相同的抑制率，单独使用阿霉素则需要1.8 M。说明书 4/4 页 6 CN 102294018 B 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 102294018 B 7 。

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