技术领域
本发明属于联合用药领域，尤其涉及ZCHH片剂的制备方法及ZCHH与抗 生素合用逆转MRSA耐药性的方法。
背景技术
MRSA是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)的缩写。金黄色葡萄球菌是非常常见的病菌，据调查，大约25-30 ％的人的鼻腔中都生长着这种病菌，在健康人的皮肤上也经常发现。有时候它 会进入人体内而引起感染。这种感染轻微的会在皮肤上长疮和丘疹，严重的则 可引起肺炎或血液感染。对葡萄球菌引起的感染通常用青霉素类的抗生素甲氧 西林治疗，在大部分情况下非常有效。但是有些葡萄球菌菌株对甲氧西林形成 了抗药性，也就是MRSA。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus,MRSA)感 染的流行，已经成为严重的临床及公共卫生问题。自1961年首次发现MRSA 以来，MRSA的分离率逐年增加，已成为医院感染重要的革兰氏阳性细菌，并 且多重耐药现象日益严重，部分地区已经出现对万古霉素耐药、中介耐药以及 异质性耐药MRSA细菌。
近年来，世界各要相继出现了致病力很强的社区获得性耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌，并且流行范围不断扩大。
中国是MRSA感染的流行强度较高地区，抗菌药物不规范使用比较普遍， 防治形势十分严峻。
MRSA传染源为MRSA定植者和感染者，传播途径为接触传播(医护人员、 器械传播)，MRSA传染特性如下：
第一、不均一耐药性。
MRSA菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群，即一株MRSA中只有一小部 分细菌约10-4～10-7，对甲氧西林高度耐药，在50μg／ml甲氧西林条件下尚 能生存，而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时内大 量敏感菌被杀死，但少数耐药菌株却缓慢生长，在数小时反又迅速增殖。
第二、广谱耐药性。
MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺 类和头孢类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶， 降低膜通透性产生大量PABA等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环 素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，唯对万古霉素敏 感。
第三、生长特殊性。
MRSA生长缓慢，在30℃，培养基pH7.0及高渗(40g/LNaCl溶液)条件 下生长较快。在30℃时，不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药，在37℃又 恢复不均一耐药。
均一耐药株在>37℃或pH<5.2时，均一耐药性可被抑制而表现为敏感。
增加NaCl浓度，低温孵育和延长时间，可使不均一耐药株群体中敏感亚 群中的耐药性得到充分表达，即能耐受较高浓度的甲氧西林，而对其中耐药亚 群无影响。
但也有报道，高渗下延长培养时间，会影响MRSA的检出结果，因为在高 盐情况下，培养48天，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌易产生大量β-内酰胺 酶，可缓慢水解甲氧西林，导致细菌生长，而误认为MSSA。
所以一般MRSA在高盐环境孵育24天，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球 菌(MRCNS)由于耐药亚群菌数少于金葡菌，应孵育48小时观察结果。
MRSA易感人群为长期住院使用抗生素患者、ICU患者、皮肤病患者、烧 伤病房患者、糖尿病(胰岛素依赖型)、长期腹膜透析／血液透析人群。
MRSA感染率越来越高，且病情严重；治疗更加困难；感染其他住院病人； 不仅存在于医院，监狱和学校也有出现。
MRSA是引起不少深部感染的主要致病菌，如肺部感染、脓毒性关节炎、 心内膜炎、败血症等；MRSA能引起许多皮肤、皮肤结构与软组织感染，如脓 疱病、烧伤感染、创伤感染、烫伤样皮肤综合征、中毒性休克综合征(TSS)； MRSA引起的感染具有很高的发病率和病死率。
目前对MRSA的治疗对策为采用万古霉素、替考拉宁、利奈唑烷、链阳霉 素、TMPCo、利福平。
根据《野生动物疾病》杂志的一项最新研究，人类当中最难以治疗的细菌 之一，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，发现于野生动物当中。
研究人员从两只兔子和一只沙鸥中分离出了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)，而兔子身上的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)也对四环素 有抗性。
是否环境当中的野生动物是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)一个储 存器，是否它们能够把超级细菌传播给动物和人类仍然是一个未解决的问题。
这些感染能够从人类中传播出来，比如说医院垃圾、污水或者农业。而且 我们不清楚的是是否动物们能够摆脱自身的感染、它们是否能够交叉感染或者 它们是否曾经把病毒传播回人类。
因此，探讨研究如何联合用药以逆转MRSA耐药性是摆在人类面前的急需 解决的难题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种ZCHH片剂的制备方法及ZCHH与抗生 素合用逆转MRSA耐药性的方法，旨在解决人类面临的如何科学合理的联合用 药逆转MRSA耐药性盲区的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种ZCHH片剂的制备方法，该ZCHH片剂 的制备方法包括以下步骤：
取药物ZCHH与乳糖混匀，ZCHH与乳糖的重量比为40：9；
用10％淀粉浆制湿颗粒，过16目筛，湿颗粒于60～70℃干燥；
整粒，加入颗粒总重量1％的硬脂酸镁；
压制成型制成ZCHH片剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种ZCHH与抗生素合用逆转MRSA 耐药性的方法，该ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法采用ZCHH 与β-内酰胺类抗生素合用逆转MRSA耐药性，步骤如下：
临床分离MRSA菌株；
单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体外抗菌；
单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体内抗菌；
观察ZCHH单用、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用后MRSA菌体的细胞壁、 细胞膜结构层次；
统计分析ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用体内外抗菌结果。
进一步，临床分离MRSA菌株的具体方法为：
K-B纸片扩散法及mecA基因检测法鉴定分离MRSA。
进一步，单用ZCHH体外抗菌观察记录ZCHH对MRSA的MIC；ZCHH 与β-内酰胺类抗生素联合应用体外抗菌观察记录ZCHH的最佳协同抗菌浓度， 联合应用的抗生素选用青霉素、苯唑西林、泰能、头孢唑林和头孢西丁。
进一步，ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体内抗菌观察记录ZCHH与 β-内酰胺类抗生素联合应用对MRSA腹腔感染小鼠的ED50。
进一步，统计分析ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用体内外抗菌结果的方法 为：
单用ZCHH组、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用组、空白未用药组比较， 分析单用ZCHH组、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用组、空白未用药组对β-内 酰胺酶的抑制作用。
本发明提供的ZCHH片剂的制备方法制作工艺简单，节省人力资源和资本 投入；ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法采用ZCHH与β-内酰胺类 抗生素合用的方法，通过破坏细菌细胞壁，减少PBP2a的表达，阻断 mecRl-mecI-mecA信号通路中的mecA及耐药辅助基因femA、femB的mRNA 表达，从而降低MRSA的耐药性，填补了目前人们关于联合用药逆转MRSA 耐药性的作用机制这一盲区，为临床用药提供重要理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的ZCHH片剂的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法 流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的ZCHH片剂的制备方法的流程。为了便于说明， 仅仅示出了与本发明相关的部分。
如图1所示，本发明的实施例提供的ZCHH片剂的制备方法包括以下步骤：
取药物ZCHH与乳糖混匀，ZCHH与乳糖的重量比为40：9；
用10％淀粉浆制湿颗粒，过16目筛，湿颗粒于60～70℃干燥；
整粒，加入颗粒总重量1％的硬脂酸镁；
压制成型制成ZCHH片剂。
图2示出了本发明提供的ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法的 流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
如图2所示，本发明实施例的另一目的在于提供一种ZCHH与抗生素合用 逆转MRSA耐药性的方法，该ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法 采用ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用逆转MRSA耐药性，步骤如下：
临床分离MRSA菌株；
单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体外抗菌；
单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体内抗菌；
观察ZCHH单用、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用后MRSA菌体的细胞壁、 细胞膜结构层次；
统计分析ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用体内外抗菌结果。
作为本发明实施例的一优化方案，临床分离MRSA菌株的具体方法为：
K-B纸片扩散法及mecA基因检测法鉴定分离MRSA。
作为本发明实施例的一优化方案，单用ZCHH体外抗菌观察记录ZCHH对 MRSA的MIC；ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体外抗菌观察记录ZCHH 的最佳协同抗菌浓度，联合应用的抗生素选用青霉素、苯唑西林、泰能、头孢 唑林和头孢西丁。
作为本发明实施例的一优化方案，ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体 内抗菌观察记录ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用对MRSA腹腔感染小鼠的 ED50。
作为本发明实施例的一优化方案，统计分析ZCHH与β-内酰胺类抗生素合 用体内外抗菌结果的方法为：
单用ZCHH组、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用组、空白未用药组比较， 分析单用ZCHH组、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用组、空白未用药组对β-内 酰胺酶的抑制作用。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明的实施例提供的ZCHH片剂的制备方法包括以下步骤：
S101：取药物ZCHH与乳糖混匀，ZCHH与乳糖的重量比为40：9；
S102：用10％淀粉浆制湿颗粒，过16目筛，湿颗粒于60～70℃干燥；
S103：整粒，加入颗粒总重量1％的硬脂酸镁；
S104：压制成型制成ZCHH片剂。
本发明提供的ZCHH片剂的制备方法的具体实施例如下：
取药物200g，与乳糖45g混匀后，用10％淀粉浆制湿颗粒，过16目筛， 湿颗粒于60～70℃干燥，整粒，加入颗粒总重量1％的硬脂酸镁，压成1000 片。
本发明实施例提供的ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法采用 ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用逆转MRSA耐药性，步骤如下：
S201：临床分离MRSA菌株；
S202：单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体外抗菌；
S203：单用ZCHH、ZCHH与β-内酰胺类抗生素联合应用体内抗菌；
S204：观察ZCHH单用、ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用后MRSA菌体的 细胞壁、细胞膜结构层次；
S205：统计分析ZCHH与β-内酰胺类抗生素合用体内外抗菌结果。
本发明提供的ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法的具体实施例 及实施结果如下：
一、临床分离菌鉴定：
经K-B纸片扩散法及mecA基因检测法鉴定，15株临床分离菌中有4株菌 株为符合要求的MRSA。
二、体外抗菌结果：
单用ZCHH对MRSA的MIC为125μg／mL。联合用药显示6种β-内酰胺类 抗生素与ZCHH联合应用的抗菌作用是协同或相加效应。31.25μg／mL浓度的 ZCHH具有最佳协同抗菌作用，分别使青霉素对MRSA的MIC从960μg／mL降 至60μg／mL；苯唑西林的MIC从400μg／mL降至100μg／mL；泰能的MIC从 100μg／mL降至6.25μg／mL；头孢唑林的MIC从320μg／mL降至40μg／mL；头 孢西丁的MIC从400μg／mL降至50μg／mL；头孢吡肟的MIC从400μg／mL降 至200μg／mL。除头孢吡肟／ZCHH的FICI为0.75，表现为相加作用外，其余 FICI均≤0.5，提示ZCHH与青霉素、苯唑西林、泰能、头孢唑林和头孢西丁等 5种抗生素具有协同抗菌作用，
三、体内抗菌结果：
ZCHH与泰能联合应用对MRSA腹腔感染小鼠的保护作用最强(ED50为 3.03mg／kg)，比单用泰能的ED50(38.18mg／kg)下降12倍，表现出较强的协同 作用；ZCHH与头孢西丁合用后虽然对感染小鼠的保护率与单用ZCHH相当 (ED50为13.79mg／kg)，但比单用头孢西丁的ED50(217.13mg／kg)下降将近16.7 倍。对MRSA肺部感染小鼠，ZCHH与泰能、头孢西丁合用后，其肺部活菌计 数明显减少，肺部组织切片经H.E染色，单用万古霉素后各级支气管见轻度炎 症，肺泡管、肺泡囊扩张，肺间质轻度胶原增生，肺泡壁血管轻度充血、水肿， 肺泡间隔较正常增厚。ZCHH、泰能、头孢西丁单用时，各级支气管轻中度炎 症，肺泡壁血管中度充血、水肿，肺泡囊、肺泡管中度扩张，肺泡上皮退行性 改变，支气管周围、小叶间和肺泡间隔结缔组织血管周围可见中度炎症细胞浸 润。ZCHH与泰能合用、ZCHH与头孢西丁合用，其病理损伤程度都较单用时 轻，尤其是ZCHH与泰能合用，各级支气管轻度炎症，肺泡壁充血、水肿较轻， 少量炎性细胞浸润，肺泡壁轻度增厚，表明ZCHH与泰能合用能明显减轻由 MRSA引起的细菌性肺炎的炎症状况。
四、形态学结果：
经ZCHH单用或与β-内酰胺类抗生素合用后，MRSA菌体的细胞壁、细胞 膜结构层次不清晰，胞壁出现溶解破损现象，细胞膜皱缩变形或破裂，菌体细 胞明显膨大，可见内容物溢出等现象。
五、机制研究：
1、ZCHH无论单用或与泰能、头孢西丁合用对β-内酰胺酶的抑制作用都较 弱，与空白未用药组比较，无显著性差异。
2、单用ZCHH和泰能能显著减少PBP2a含量，单用头孢西丁对MRSA PBP2a的表达无显著作用。而ZCHH分别与两药联合应用时，对MRSA的PBP2a 表达具有明显抑制作用。
3、ZCHH与泰能、头孢西丁合用后，能明显减少mecA、femA、femB基 因的mRNA的表达；而不论ZCHH单用或与泰能、头孢西丁联合用药后对blaZ 的mRNA的表达无明显影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。