技术领域
本发明涉及可用于延长生物学活性材料体内循环寿命的支化聚合 物。本发明还涉及使用该聚合物制成的结合体。
背景技术
将肽或多肽结合于聚(乙二醇)PEG和类似的水溶性聚(环氧烷)的 一些最初概念在美国专利4,179,337中公开，其公开被并入本文作为 参考。由这些聚合物改性的多肽与未改性形式相比表现出免疫原性/抗 原性降低并且在血流中的循环时间更长。
为了结合聚(环氧烷)，羟基端基之一被转化为活性官能团。这种 处理经常称为“活化”，并且产物称为“活化的聚(环氧烷)”。其它基本 上非抗原的聚合物类似地被“活化”或官能化。
活化的聚合物与具有作为连接位点的亲核官能团的治疗剂反应。 通常用作连接位点的一种亲核官能团为赖氨酸的ε-氨基。也可将游离 的羧基、适当活化的羰基、氧化的碳水化合物部分和巯基作为连接位 点。
胰岛素和血红素属于被结合的第一治疗剂。这些相对大的多肽包 含几个游离的ε-氨基连接位点。可为其连接充分数量的聚合物以降低 免疫原性并增加循环寿命，而不显著地损失生物活性。
然而，发现过度的聚合物结合和/或涉及其中与生物活性有关基 团的治疗剂部分活性部位的结合经常引起活性丧失并从而丧失治疗可 用性。对于具有很少与生物活性无关的连接位点的低分子量肽尤其是 这样。许多非肽治疗剂还缺乏充分数量的连接位点以得到聚合物改性 的益处。
克服上述问题的一个建议是使用更长的、具有更高分子量的聚合 物。然而，根据所需分子量，这些材料很难制备，并且使用费用大。 另外，它们与更容易得到的聚合物相比有时提供很少的改善。
另一个选择性建议为通过三嗪环为蛋白质的氨基连接两个聚合物 链段。参见例如Enzyme，26，49-53(1981)和Proc.Soc.Exper.Biol.Med.， 188，364-9(1988)。然而，三嗪为有毒物质，很难在结合之后使其毒性 降低到可接受的程度。另外，三嗪为平面基团，其只能被双链聚合物 取代。平面构造严格地锁定两个聚合物链在适当的位置。这限制了聚 合物结合的益处与通过增加聚合物链长度得到的益处几乎相同。因 此，非三嗪系活化的聚合物可能为本领域提供实质的益处。
然而，在上述提及的情况中，在聚合物和母体生物学活性部分之 间形成具有基本上耐水解的键(连接)的生物学活性聚合物结合体。 因此，制备的是永久性连接的耐久性结合体，而本质上不是前药(其中 母体分子在体内最终释放)。
共同转让的美国专利5,643,575、5,919,455和6,113,906公开了另外 的改进，其涉及共用通过脂肪族连接体与亲核体连接的节点的多链 PEG。与以前的三嗪系支化聚合物结合体不同，脂肪族连接体使技术 人员可避免三嗪的毒性，并且提供其它有用的优点。
另外，近几年来还提出了几种制备前药的方法。前药包括生物学 活性母体化合物的化学衍生物，其在给药时在体内最终释放活性母体 化合物。前药的使用使得技术人员可以改变生物学活性物质在体内起 作用的时间和/或作用持续时间。前药经常是母体化合物或活性化合物 的生物学惰性形式或基本上的无活性形式。活性药物的释放速率受几 个因素的影响，包括将母体生物学活性物质与前药载体连接的连接体 的水解速率。
已经报到了一些基于酯或磷酸酯连接的前药。在大多数情况中， 用于形成前药的特定类型的酯键在含水环境中提供高达数日的水解 t1/2。尽管可能预期已经形成了前药，但大部分结合体在体内实现充分 水解之前被消除。因此，优选提供具有在体内能更迅速水解聚合物-药 物键的连接的前药，以便更迅速地产生母体药物化合物。
还报到了基于酰胺或氨基甲酸酯连接的前药。通常，已知酰胺键 为高度耐水解的。然而，最近发现ε-氨基酸的C-末端酰胺当N-末端被 一个和两个羟乙基基团N-羟乙基化时在25℃和pH 7.4容易水解。这种 水解反应的关键为双N-2-羟乙基甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)类型的分 子。这种N-二(羟乙基)甘氨酸类型的基团最近被用于合成前药，参见 共同转让的美国专利申请10/218,167，其内容被并入本文作为参考。
在前药设计领域中仍有改进的空间。本发明提供这样一种改进。
发明内容
在本发明的一个方面中，提供下式(I)的化合物：
其中：
R1和R2独立地选自基本上非抗原的聚合物残基、H、C1-6烷基、 C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支链基团，条件是R1和R2不都 是H；
Z选自主动转运进入靶细胞的部分、疏水部分、双官能连接部分 及其组合；
Y1-3可相同或不同并选自O、S或NR11；
L1和L2可为相同或不同的双官能连接体；
R3-R11、R24和R25可相同或不同并选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、 C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的 烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷 基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷 氧基；
L3和L4可相同或不同并选自：
-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或
-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-
其中：
Y15选自O、S、NR34或CH2，和
R30-34可相同或不同并选自H、烷基、烯基、炔基、杂烷基或 芳基；
A选自离去基团、官能团、生物学活性部分和OH；
a、b、c、d、和e独立地为0或1，
m、n、o、和p独立地为正整数，
f和g为0或1，条件是
(f+a)或(g+c)中至少之一等于2。
本发明的另一个方面包括当(R1)和(R2)中至少一个为同时包括α和 ω末端连接基团的聚合物残基时形成的双官能化合物。在本发明这一 方面，技术人员能够对聚合物型(优选PEG)N-二(羟乙基)甘氨酸系统连 接两当量的生物活性剂药物、蛋白质、多肽、低聚核苷酸等。这种双 官能聚合物结合体的例子如下式(IIa)和(IIb)说明：
其中，
Z为
其中Y4为O、S或NR11，L5为双官能连接体，所有其它变量如上所 述。
还提供了本发明化合物的制备方法及使用该化合物的治疗方法。
对于本发明的目的，术语“残基”应该理解为其所指化合物的一部 分，其在经历其中已经连接聚合物前药载体部分的取代反应之后保留 的部分。
对于本发明的目的，术语“聚合物残基”或“PEG残基”各自应该理 解为在其经历与生物学活性物质的反应之后保留的聚合物或PEG的部 分。
对于本发明的目的，术语“烷基”应该理解为包括直链、支链、 被如卤代-、烷氧基-、硝基-取代的C1-12烷基、C3-8环烷基或取代的环 烷基等。
对于本发明的目的，术语“取代的”应该理解为包括用一个或多 个不同的原子加成或代替包含在官能团或化合物中的一个或多个原 子。
对于本发明的目的，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷 基氨基、羟基烷基和巯基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、 二烯基氨基、羟基烯基和巯基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基 炔基、二炔基氨基、羟基炔基和巯基炔基；取代的环烷基包括基团如 4-氯环己烷基；芳基包括基团如萘基；取代的芳基包括基团如3-溴-苯 基；芳烷基包括基团如甲苯基；杂烷基包括基团如乙基噻吩；取代的 杂烷基包括基团如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基团如甲氧基；和苯氧 基包括基团如3-硝基苯氧基。卤代-应该理解为包括氟、氯、碘和溴。
用于本发明目的的术语“充分量”是指可实现的治疗效果为本领域 技术人员理解的效果的量。
对于本发明的目的，“有效地非抗原的”和“基本上非抗原的”应该 理解为包括本领域中理解的在哺乳动物中基本上无毒的和不引起明显 免疫反应的所有聚合物材料。
对于本发明的目的，“正整数”应该理解为是正的整数，优选为约 1到6，更优选为1或2。
本发明的一个主要优点在于N-二(羟乙基)甘氨酸连接体能够控制 前药的水解速率，从而以不同速率在体内和体外释放本来的实体。例 如，多种双官能部分，包括氨基酸或短的肽残基，可作为L1-3中任一 个的一部分，以调节前药体内和体外水解和/或细胞摄取等的速率。
本发明的另一个优点在于经由聚合物转运系统递送的目标化合物 经常显示出体内的水溶性和循环寿命显著增加。
附图说明
图1-11示意性地说明形成在发明详述和实施例中描述的本发明的 化合物的方法。
发明详述
A.式(I)
在本发明的一个实施方案中，提供下式(I)的化合物：
其中：
R1和R2可相同或不同并选自基本上非抗原的聚合物残基、H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和末端支链基团，条件是R1和 R2不都是H；
Z选自主动转运进入靶细胞的部分、疏水部分、双官能连接部分 及其组合；
Y1-3可相同或不同并选自O、S或NR11；
L1和L2可为相同或不同的双官能连接体；
R3-R11、R24和R25可相同或不同并选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、 C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的 烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷 基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷 氧基；
L3和L4可相同或不同并选自：
-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)-或
-(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)-，
其中：
Y15选自O、S、NR34或CH2，并且
R30-34可相同或不同并选自H、烷基、烯基、炔基、杂烷基或 芳基；
A选自离去基团、官能团、生物学活性部分和OH；
a、b、c、d、和e独立地为0或1，
m、n、o、和p独立地为正整数，
f和g为0或1，条件是
(f+a)或(g+c)中至少之一等于2。
在本发明的某些优选方面中，一个或多个R1和R2包括基本上非抗 原的聚合物残基如聚乙二醇(PEG)基团。选择性地，R1-2包括本文中表 示为J的封端基团。优选用于聚合物封端的J基团包括基团如OH、NH2、 SH、CO2H、C1-6烷基部分如CH3、和下式(IIIa)和(IIIb)的化合物：
和
其中所有的变量如前定义。
本发明另一个实施方案为下式IV和V的化合物：
和
其中，a、b、c、d、f和g为正整数，所有的其它变量如上所述。
在本发明的另一个方面中，R1和R2与它们所连接的碳原子一起可 形成下式的桥连结构：
其中：
R70-80可相同或不同并选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、 C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂 烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
n′为正整数，优选为约1到约7，以及
所有的其它变量如前定义。
对于构成本发明的式子的其它变量，在本发明的某些方面中优选 以下：
在某些方面中，R1和R2为聚环氧烷残基，更优选为聚乙二醇残基；
在其它方面中，R1和R2为以下更详细描述的N-二(羟乙基)甘氨酸 系末端支链基团，以能够加载多个聚合物链；
R3-R10、和R24-25各自为氢；
a、b、c、d、f、m、n、o和p各自优选为1；
e优选为0或1；
Z为如上定义的
或者，选择性地，Z包括氨基酸残基、肽残基、主动转运进入靶 细胞、疏水性、或具有这些性质的组合的基团，使得在与生物学活性 的A基团结合时，形成从式(I)、(II)等的N-二(羟乙基)甘氨酸聚合物部 分释放的前药。还参见共同转让的USSN 09/758,993，其内容被并入本 文作为参考。
B.基本上非抗原的聚合物
如上所述，R1和R2更好地是各自为优选基本上的非抗原的水溶性 聚合物残基，如聚环氧烷(PAO)，更优选为聚乙二醇如mPEG。为了说 明和非限制性地，R1和R2的聚乙二醇(PEG)残基部分可选自：
J-O-(CH2CH2O)x-，
J-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，
J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，
J-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，
-OC(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-，
-NR12CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR12-，和
-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，
其中：
x为聚合度；
R12选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取 代的环烷基、芳基取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂 烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基，J为上述式II中所提及的 封端基团。
在一个特别优选的实施方案中，R1-2选自：
CH3-O-(CH2CH2O)x-、CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、 CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NH-和CH3-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-，
其中x为正整数，优选选择为使得重均分子量为约2,000到约 25,000Da。在本发明的选择性方面中，聚合物的分子量为几百到40,000 或更大，其取决于技术人员的需要。
PEG通常由以下结构表示：
并且优选R1和R2包括该式的残基。
聚合物的聚合度(x)可为约10到约2,300。其表示聚合物链中重复 单元的数目并且随着聚合物分子量的改变而改变。(J)部分为本文中定 义的封端基团，即，在聚合物末端上的基团，在某些方面中，其可选 自NH2、OH、SH、CO2H、C1-6烷基或其它PEG末端活化基团中的任一 个，这种基团可由本领域技术人员进行理解。
还可使用的是聚丙二醇、支链PEG衍生物如在共同转让的美国专 利5,643,575(′575专利)中描述的那些支链衍生物、“星状-PEG”和多臂 状PEG如在Shearwater Corporation′s 2001目录″Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application″中描述的那些。前述各个文献的 公开被并入本文作为参考。′575专利提供的支链使得可从N-二(羟乙基) 甘氨酸基团进行二代或三代支化，作为增加在生物学活性分子或酶的 单个连结点上的聚合物加载的方法。应该理解，如果需要的话，可以 对水溶性聚合物进行官能化用于连接双官能连接基团，而不涉及不适 当的实验。
虽然PAO和PEG在重均分子量范围内可以基本上不同，但是， 在本发明的大多数方面中优选R1和R2各自具有约2,000到约25,000Da 的重均分子量。
优选本文包括的聚合物在室温下为水溶性的。这种聚合物的非限 制性列表包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚乙二 醇化的多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的 水溶性。
在另外的实施方案中，作为PAO系聚合物的替代物质，R1和R2各 自选择性地选自一个或多个有效地非抗原的材料，如右旋糖酐、聚乙 烯醇、碳水化合物系聚合物、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧 烷、和/或其共聚物。还参见共同转让的美国专利6,153,655，其内容被 并入本文作为参考。本领域技术人员应该理解，对于PAO如PEG，采 用本文中所述相同类型的活化。本领域技术人员可能进一步认识到， 上述列表只是示例性的并且考虑了具有本文所述性质的所有聚合物材 料，并且还考虑了其它聚环氧烷衍生物如聚丙二醇等。
本发明的聚合物还可以与双官能物质如聚(烷撑二醇)二胺共聚以 形成适合用于渗透性隐形眼镜、创伤敷料、给药装置等的互穿聚合物 网络。可由本领域技术人员容易地认识到这种支化的空间限制和水溶 性。然而，优选地，多支化聚合物的分子量不应超过80,000道尔顿。
C.双功能连接基团L1、L2、L3和L4
在本发明的许多方面中，特别是式(I)中，L1、L2、L3和/或L4为促 进N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物与聚合物链如R1和/或R2连接的连接基 团。提供的该连接可以直接地或通过本领域技术人员已知的另外的结 合基团连接。在说明书中提及了其它Lx基团，应该理解，它们选自与 L1相同的基团。在本发明的这一方面，L1和L2可相同或不同并选自：
-NR19(CR14R15)tO-
-NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)qNR19-
-O(CR14R15)tNR19-
-O(CR14R15)tO-
-NRR19(CR14R15)tNR19-
-NR19(CR14R15)t(CR16CR17O)q-
-NR19(CR16CR17O)t-
-NR19(CR16CR17O)t(CR14R15)qNR19-
-NR19(CR16CR17O)t-
-O(CR14R15)t-NR19-
-O(CR14R15)tNR19-
-O(CR14R15)tO-
-O(CR16CR17O)tNR19-
其中：R14-R17和R19独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔 基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、 C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基； 和
R18选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取 代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基、NO2、卤代烷基和卤素； 和
t和q独立地选自正整数，优选约1到约4。
在本发明的其它方面中，L1和/或L2可包括氨基酸残基。氨基酸可 选自任何已知的天然存在的L-氨基酸类，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、 脯氨酸、和/或其组合，只是列举了一部分。当L1和/或L2包括肽时，肽 的大小为例如约2到约10个氨基酸残基。在一个优选实施方案中，肽 为Gly-Phe-Leu-Gly。
优选氨基酸残基为下式：
其中X′为O、S或NR26，Y5为O、S或NR27，并且R26、R27和R28独 立地选自与定义R3相同的基团，但优选各自为H或低级烷基(即C1-6烷 基)；f为约1到约10的正整数，优选为1。
天然存在的氨基酸的衍生物和类似物、以及多种本领域中已知的 非天然存在的氨基酸(D或L)，无论具有疏水性或非疏水性，都被考 虑在本发明的范围内。只是举例来说，氨基酸类似物和衍生物包括： 2-氨基-己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、 4-氨基丁酸、γ-氨基丁酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸、2-氨基-庚酸、 2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、锁链素、 2，2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天门东酰 胺、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、allo-异亮氨酸、N-甲 基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨 酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、及太多而不能赘述的其它，其在 63Fed.Reg.，29620，29622中有列举，所述文献被并入本文作为参考。
短链肽为例如具有2个到约10个、或更多个上述氨基酸残基的肽。
更优选地，L1和L2可相同或不同并选自：
-NH(CH2CH2)2O-
-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)NH-
-O(CH2CH2)NH-
-O(CH2CH2)O-
-NH(CH2CH2)NH-
-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)-
-NH(CH2CH2O)-
-NH(CH2CH2O)(CH2)NH-
-NH(CH2CH2O)2-
-O(CH2)3NH-
-O(CH2)3O-
-O(CH2CH2O)2NH-
在本发明的另一个实施方案中，L3和L4可相同或不同并选自：
-(O)CR30R31OCR32R33C(O)-；
-(O)CR30R31NR34CR32R33C(O)-；
-C(O)CR30R31SCR32R33C(O)-；或
-C(O)(CR30R31)nC(O)-；
其中：R30-34独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基或芳基，和
n为优选约2到约3的正整数。
优选地，L3和L4选自：
-C(O)CH2OCH2C(O)-；
-C(O)CH2NHCH2C(O)-；
-C(O)CH2SCH2C(O)-；
-C(O)CH2CH2CH2C(O)-；或
-C(O)CH2CH2C(O)-。
本发明的主要优点在于技术人员可以控制生物学活性部分或药物 从聚合物N-二(羟乙基)甘氨酸平台水解或释放的速率。取决于所选择 的特定连接体，本领域技术人员可以修饰化合物以控制水解速率。本 发明的这一优选方面使得技术人员能够控制生物学活性部分被递送到 预定目标的速率。在期望生物学活性部分或药物快速释放的情况中， L3和L4连接体的引入提供了增强的水解速率。相比之下，对于在共同 转让的美国专利申请10/218,167中公开的其中所述部分或药物从平台 的释放经常取决于各种条件如pH或酶存在的先前的N-二(羟乙基)甘氨 酸系聚合物平台，L3和L4连接体依靠邻位促进作用而能够不依赖pH条 件或有或没有酶存在的条件下显著增强生物学活性部分或药物从聚合 物平台释放的速率。然而，在酶的存在下，水解速率受到当使用邻位 促进时的邻位促进或酶促反应中更快的那一个控制。因此，水解速率 高度依赖于在N-二(羟乙基)甘氨酸部分本身和PEG部分之间使用的连 接体的类型。因此，本发明在N-二(羟乙基)甘氨酸部分的任一臂上能 够可互换地使用永久性的和可释放的连接体，只要至少一个臂结合有 可释放的连接体部分L1-L3或L2-L4。
D.Z部分及其功能
在本发明的一个方面中，Z为L5-C(＝Y4)，其中L5为选自用于定义 L1和L2的基团中的双官能连接体，Y4选自与用于定义Y1-3相同的基团。 在本发明的这一方面，Z基团起到作为A基团和N-二(羟乙基)甘氨酸转 运形式的其余部分之间的连接的作用。
在本发明的其它方面中，Z为被主动转运进入靶细胞的部分、疏 水部分、及其组合。虽然Z优选为单价的，Z可以选择性地为二价的或 多价的，使得能够对N-二(羟乙基)甘氨酸系聚合物连接超过一个的A 基团。为了实现主动转运，Z可以包括氨基酸、肽残基、或多胺残基， 如以上有关L1和L2描述的那些、糖残基、脂肪酸残基、C6-18烷基、取 代的芳基、杂芳基、-C(＝O)、C(＝S)或-C(＝NR29)，其中R29为H、低级 烷基等。
本发明的这一方面广泛地基于以下原理：适合于结合到N-二(羟 乙基)甘氨酸聚合物系前药结合体中的生物学活性的材料本身可为在从 N-二(羟乙基)甘氨酸连接的组合物水解释放之后没有活性的物质/化合 物，但其可在经历进一步的化学过程/反应之后变为活性的。对于这种 实施方案，通过N-二(羟乙基)甘氨酸系聚合物系统递送到血流中的治 疗剂或诊断剂、肽、多肽等可能在进入或被主动转运进入感兴趣的靶 细胞之前保持非活性的，而在通过细胞内化学作用如存在于该组织或 细胞中的酶或酶系统而活化。
制备本发明这一方面的前药，使得N-二(羟乙基)甘氨酸聚合物系 结合体的体内水解使结合体裂开，从而将活性生物材料(在本文中表示 为A)释放到细胞外液中，其仍然连接于Z部分。本发明的这一方面的 生物学活性材料优选，但不是唯一地，为小分子治疗剂和/或诊断剂。 例如，一种可能的Z-A组合为亮氨酸-阿霉素，另一个是氨基酸连接 的喜树碱或紫杉醇，并且要处理的组织为肿瘤组织。
不打算束缚于本发明如何操作的任何理论或假设，但是认为取决 于选择作为转运增强剂的另外的部分，生物学活性物质进入肿瘤细胞 中的转运速率取决于生物学活性物质以受保护形式和/或转运增强形式 递送进行细胞外组织如表现出EPR效果的组织中的速率。
在另一个选择中，转运增强剂(Z)选自用于细胞膜转运系统的已 知底物。只是举例来说，可容易地使用已知主动转运某些营养素和内 分泌因子等、和这种营养素、或其类似物的细胞，以增强生物学有效 材料进入靶细胞中的主动转运。这些营养素的例子包括氨基酸残基、 肽，如约2到约10个残基或更多残基的短链肽、单糖和脂肪酸、内分 泌因子等。
短链肽为例如上述具有2个到约10个或更多个氨基酸残基的肽。 在本发明的这一实施方案中，认为这种肽转运增强剂不必要是疏水 的，但是认为在其它方面起作用以增强吸收和/或保护连接的小分子剂 免于在全身血流中过早水解。例如，认为肽转运增强剂，诸如例如， 聚精氨酸、和具有类似分子量范围的其它转运增强剂在空间阻碍生物 活性剂被血浆系水解酶裂开，但是其然后在靶细胞内被多种肽和/或蛋 白酶如组织蛋白酶裂开。
在某些优选的方面，Z为疏水部分。不打算束缚于疏水性如何有 助于效力的任何理论或假设，认为疏水部分通过抑制细胞外组织间隙 如血浆中存在的水解酶等的攻击而抑制转运增强剂离开活性生物制剂 的细胞外裂开。因此，某些优选的转运增强剂包括例如疏水性氨基酸 如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、和色氨酸，以及以上提及的非天然存在的衍生物，如γ- 氨基酸、及其类似物。
在另一个选择中，转运增强剂为疏水性有机部分。只是举例来说， 有机部分为取代的或未被取代的C6-18烷基、或更大的烷基、芳基或杂 芳基。还考虑有机部分转运增强剂包括和包含有机官能团，有机官能 团包括例如-C(＝S)和/或-C(＝O)。
E.式(I)A基团
1.离去基团
在其中A为离去基团的那些方面中，适当的部分包括但不限于基 团如N-羟基苯并三唑基、卤素、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基、对硝基苯 氧基、咪唑基、N-羟基琥珀酰亚胺基、噻唑烷基硫酮(thiazolidinyl thione)、O-酰基脲或
或
其它适合的离去基团对于本领域技术人员来说是显而易见的。
对于本发明的目的，离去基团应理解为能够与所需目标上的亲核 体反应的那些基团，即生物学活性部分、双官能间隔体、中间物等。 因此，目标包含用于替代的基团，如蛋白质、肽、酶、天然存在或化 学合成的治疗剂分子如阿霉素、间隔体如单保护的二胺上的NH2基团。
如果希望的话，本发明的化合物还可以在N-二(羟乙基)甘氨酸基 团和离去基团或连接的目标(药物)之间包括间隔基团。间隔基团可为 含最多18个碳原子的杂烷基、烷氧基、烷基，乃至另外的聚合物链。 可使用标准的合成技术加入间隔基团。应该理解选择用于(A)的那些部 分还可以与除了生物学活性亲核体之外的其它部分反应。
2.官能团
A还可以为官能团。这种官能团的非限制性例子包括可以通过含 胺的间隔体与N-二(羟乙基)甘氨酸部分连接的马来酰亚胺基、乙烯基、 砜的残基、羟基、氨基、羧基、巯基、酰肼、肼基甲酸酯(carbazate) 等。一旦连接于N-二(羟乙基)甘氨酸部分，官能团(如马来酰亚胺)可 用于将N-二(羟乙基)甘氨酸聚合物与目标如多肽、氨基酸或肽间隔体 等的半胱氨酸残基连接。
3.生物学活性部分
在其中A为含胺或含羟基化合物的残基的式(I)的那些方面中，这 种适合的化合物的非限制性列表包括有机化合物、酶、蛋白质、多肽 等的残基。有机化合物包括但不限于如蒽环类部分、抗生素化合物， 包括柔毛霉素、阿霉素；对氨基苯胺芥子气、美法仑、Ara-C(阿糖胞 苷)和相关的抗代谢物化合物，如吉西他滨等。或者，该部分可为含胺 或含羟基的心血管药、抗肿瘤药如喜树碱和紫杉醇、抗感染药物、抗 真菌药如制霉菌素、氟康唑和两性霉素B、抗焦虑药、肠胃病药、中 枢神经系统活化剂、镇痛药、致育药、避孕剂、抗炎药、类固醇药的 残基等。
除了上述之外，生物学活性部分还可以为酶、蛋白质、多肽、低 聚核苷酸、单克隆抗体、单链抗原结合蛋白(SCA)如CC49的残基，还 考虑了其片段。适合的蛋白质包括但不限于具有至少一个可用于聚合 物连接的基团如ε-氨基、胱氨酸硫代(cystinylthio)、N-末端氨基的多 肽、酶、肽等，包括具有生理学或药理学活性的材料以及能够催化在 有机溶剂中反应的那些材料。
涉及的蛋白质、多肽和肽包括但不限于血红素、血清蛋白如包括 因子VII、VIII、和IX的血液因子；免疫球蛋白、细胞因子如白细胞介 素，即IL-1到IL-13等、α、β和γ干扰素、包括粒细胞集落刺激因子 的集落刺激因子、血小板衍生的生长因子和磷脂酶活化蛋白质 (PLAP)。一般生物学上或治疗学上感兴趣的其它蛋白质包括胰岛素、 植物蛋白如外源凝集素和蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关蛋白质、 生长因子如转化生长因于如TGFα或TGFβ和表皮生长因子、激素、生 长调节素、红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、 催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、组织纤溶 酶原激活物等。感兴趣的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、 及其片段。
某些蛋白质如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子还以非糖基化 的形式存在，通常为利用重组体技术产生的。非糖基化形式也处在本 发明的蛋白质之中。
感兴趣的酶包括碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。不限于特定的酶，感兴 趣的酶的例子包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨 酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、催化酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、 尿酸酶、二磷酸腺苷酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。感兴趣的碳水化 合物特异性酶包括葡萄糖氧化酶、glucodase、半乳糖苷酶、葡萄糖苷 脂酶、glucouronidase等。
本文还包括表现出体内生物活性的生物聚合物的任何部分。这包 括氨基酸序列、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、抗体片段、单链 结合蛋白(参见例如美国专利4,946,778，其公开被并入本文作为参考)、 结合分子，包括抗体或片段的融合、多克隆抗体、单克隆抗体和催化 性抗体。
可通过本领域技术人员已知的技术如组织培养、从动物来源提 取、或通过重组DNA方法制备或分离蛋白质或其部分。还考虑了蛋白 质、多肽、氨基酸序列等的转基因源。这种材料得自转基因动物，即 鼠、猪、牛等，其中蛋白质为奶、血液或组织的形式。还考虑了转基 因的昆虫和杆状病毒表达系统作为来源。此外，蛋白质的突变形式， 如突变干扰素也在本发明的范围内。
感兴趣的其它蛋白质为过敏原蛋白质如豚草属、抗原E、蜜蜂毒 液、螨过敏原等。上述只是适用于本发明的蛋白质的示例性说明。应 该理解，还考虑了没有特别提及但具有可用氨基的本文中定义的那些 蛋白质，并且处在本发明的范围内。
在本发明的优选方面中，含氨基或含羟基的化合物为适合用于处 理动物如哺乳动物包括人的药物或诊断应用的生物学活性物质，用于 希望这种处理的状况。上述列表对可以修饰的化合物只是说明性的而 不是限制性的。本领域技术人员应该能够认识到可以无需不适当的实 验而类似地修饰其它的这种化合物/组合物。应该理解，还考虑了没有 特别提及但具有适合的连接基团的那些生物学活性材料，并且其处在 本发明的范围内。
本文对适合于包含在本文中的含氨基或含羟基的分子的唯一限制 在于其具有至少一个(伯或仲)胺基或羟基，他们可以与聚合物结合体 反应并连接，并且在前药系统释放和再生母体化合物之后生物活性没 有显著丧失。
F.N-二(羟乙基)甘氨酸连接的聚合物的合成
在以下实施例中提出特定的N-二(羟乙基)甘氨酸系聚合物的合成 方法。现在参考图1以便说明，一个优选的方法包括：
1)使封端的双官能连接体与酐诸如例如二甘醇酸酐反应以形成延 长的封端的双官能间隔体，如：
2)将封端的双官能间隔体与被酸保护的N-二(羟乙基)甘氨酸分子 的各个羟基连接，
其中tBu为保护基，所有其它变量与前述式(I)中的相同，
3)将得到的中间体去掉封端并使其与活化的聚合物如PNP-PEG或 SC-PEG在碱性偶联条件下反应，
4)将N-二(羟乙基)甘氨酸脱保护并然后在偶联条件下将酸用适合 的活化基团如噻唑烷基硫酮活化。
可以理解，可使用本领域已知的其它保护基代替t-Bu。现在，活 化的PEG或聚合物N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物能够与药物、肽、间隔 体等反应并结合。
适合的偶联剂的非限制性列表包括1，3-二异丙基碳二亚胺 (DIPC)、任何适合的二烷基碳二亚胺、2-卤代-1-烷基吡啶鎓卤化物 (Mukaiyama试剂)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、丙烷 膦酸环酐(PPACA)和二氯磷酸苯酯等，其可得自商业源如Sigma- Aldrich Chemical，或使用已知的技术合成。
优选地，取代基在惰性溶剂如四氢呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、 二氯甲烷(DCM)、氯仿(CHCl3)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物酯反 应。适合的碱包括二甲氨基吡啶(DMAP)、二异丙基乙胺、吡啶、三 乙胺、KOH、叔丁醇钾和NaOH等。反应通常在约0℃到最高为约22℃ (室温)的温度下进行。
制备N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物的选择性方法包括：
1)使一当量的延长的封端的双官能连接体与一当量的酸保护的N- 二(羟乙基)甘氨酸部分反应，形成如下的中间体：
其中tBu为保护基，所有其它变量与前述式(I)中的相同，
2)将得到的中间体脱保护并使其与活化的聚合物如PNP-PEG或 SC-PEG在碱性偶联条件下反应，
3)将N-二(羟乙基)甘氨酸脱保护并然后将酸在偶联条件下用适合 的活化基团如噻唑烷基硫酮活化。
制备N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物的另一个方法为：
1)使第一延长的封端的双官能连接体与酸保护的N-二(羟乙基)甘 氨酸中间体反应，形成下式：
2)然后使第二封端的双官能连接体与步骤1的中间体反应以形 成：
3)然后将上述得到的中间体去掉封端并在碱性条件下与活化的聚 合物如PNP-PEG或SC-PEG反应，
4)最后将N-二(羟乙基)甘氨酸脱保护并然后在偶联条件下用适合 的活化基团如噻唑烷基硫酮活化。
无论选择的何种途径，由本文所述合成技术得到的一些优选的化 合物包括：
其中A1为离去基团如：
和
或其它离去基团(如在上述章节E1中描述的那些)。
N-二(羟乙基)甘氨酸活化的聚合物与适当的目标反应使活化的 聚合物转变为结合体，A1变形为A2，其中A2为生物学活性部分、间隔 体等的残基。
G.加载多聚合物
在本发明的另一个方面中，提供了N-二(羟乙基)甘氨酸系多支化 聚合物化合物。具体地，碱性N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物被进一步修 饰，以包括一个或多个末端支链基团。优选地，末端支链基团为下式：
其中：
Y5为O、S或NR46；
L6为选自与定义L1相同的双官能连接体；
L8为选自与定义L3相同的双官能连接体；
R40-R46可相同或不同并选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、 C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂 烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
j、j′、k和k′各自独立地为0或正整数；
q为0或1；
u、h、v和w独立地选自正整数；
R50选自基本上非抗原的聚合物残基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基、和
其中：
L7为选自与定义L1相同的双官能连接体；
L9为选自与定义L3相同的双官能连接体；
R60选自基本上非抗原的聚合物残基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基，并且所有其它变量如上定义。
得到的支链N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物具有下式结构：
和
其中所有变量如前述定义。
如以下和实施例中所示，包含封端的伯胺的N-二(羟乙基)甘氨酸 衍生物中间体与两当量活化的N-二(羟乙基)甘氨酸聚合物反应，以形 成包含连接于生物学活性分子、酶、目标等上的单个连结点上的高达 四个聚合物链的N-二(羟乙基)甘氨酸聚合物系统。可重复该过程通过 使两当量的上述四链聚合物N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物与一当量的封 端的伯胺N-二(羟乙基)甘氨酸衍生物反应形成八链衍生物。
H.体内诊断学
本发明的另一个方面提供选择性地制备具有连接于上述转运增强 剂的诊断标记物的本发明的结合体，其中选择标记物用于诊断目的或 成像目的。因此，通过将任何适当的部分如氨基酸残基连接于任何本 领域的标准放射性同位素、不透X射线的标记物、磁共振标记物、或 适合于核磁共振成像的其它非放射性同位素标记物、荧光型标记物、 在紫外或红外或电化学刺激下表现出可见颜色和/或能够发荧光的标记 物而制备适合的标记物，用于在手术过程中使肿瘤组织成像，等等。 选择性地，将诊断标记物结合到和/或连接于共轭的治疗部分，以能够 监控治疗生物学活性物质在动物或者或人患者中的分布。
在本发明的另一个方面，可通过本领域已知的方法使用任何适合 的标记物包括例如放射性同位素标记物容易地制备本发明的标记结合 体。只是举例来说，这些放射性同位素标记物包括碘131、碘125、锝99和/或铟111，用于生产在体内被选择性地摄取到肿瘤细胞内的放射性免 疫闪烁扫描剂。例如，本领域已知有许多将肽连接于Tc-99m的方法， 只是举例来说，由美国专利5,328,679、5,888,474、5,997,844、和5,997,845 所示的那些，所述文献被并入本文作为参考。
概括地，对于在患者中解剖学定位肿瘤组织，对怀疑患有肿瘤的 患者或动物给药共轭标记物。在使标记后的免疫球蛋白定位在肿瘤位 置的充分时间之后，检测标记物产生的信号，例如通过视觉检测、通 过X射线照相、计算机横断断层、MRI检测、通过发光标记物的仪器 检测、通过照相扫描装置如γ照相机检测、或通过适合于所选择标记 物性质的任何其它方法或装置检测。
然后将检测到的信号转化为图象或解剖学和/或生理学判定肿瘤 位置。成像使得可能在体内定位肿瘤和设计适当的治疗策略。在其中 标记物部分本身是治疗剂的那些实施方案中，检测到的信号在治疗过 程中提供解剖学定位证据，为随后的诊断和治疗介入提供基准。
I.治疗方法
本发明的另一个方面提供治疗哺乳动物中多种医疗状况的方法。 该方法包括对需要这种治疗的哺乳动物给予有效量的前药，如根据本 文所述制备的阿霉素-N-二(羟乙基)甘氨酸连接-PEG结合体。该组合 物可特别用于治疗肿瘤疾病，降低肿瘤负荷、防止肿瘤转移和防止癌/ 肿瘤在哺乳动物中生长的再发生。
前药的给药量可取决于其中包括的母体分子，如肽、多肽、蛋白 质、酶等的不同而不同。通常，用于该治疗方法的前药的量为在哺乳 动物中有效地实现所需治疗结果的量。自然地，各种前药化合物的剂 量多少取决于母体化合物、体内水解速率、聚合物的分子量等的不同 而不同。本领域技术人员能够根据临床经验和治疗适应症决定所选择 的前药的最佳剂量。实际的剂量对于技术人员来说显而易见，无需不 适当的实验。
本发明的组合物可包括在对哺乳动物给药的一种或多种适当的药 学组合物中。药学组合物可为根据本领域众所周知的方法制备的溶 液、悬浮液、片剂、胶囊等剂型。还考虑了这种组合物的给药可取决 于技术人员的要求经口服和/或非肠道途径进行。可使用组合物的溶液 和/或悬浮液作为例如用于通过本领域已知方法例如通过静脉内注射、 肌内注射、皮下注射等注射或渗透组合物的载体介质。
这种给药也可为通过输液进入身体空间或腔中，以及通过吸入和 /或经鼻途径。然而，在本发明优选的方面中，对有需要的哺乳动物经 非肠道途径给药所述前药。
实施例
以下实施例用于提供对本发明的进一步说明，但是其不以任何方 式限制本发明的有效范围。实施例中叙述的带下划线和粗体数字相当 于图1到11中表示的那些。
总的方法
所有反应都在干燥的氮气或氩气环境下进行。市售的试剂不经进 一步纯化而使用。所有的PEG化合物都经过真空干燥并在使用前从甲 苯中进行共沸蒸馏。除非另外说明，使用Varian Mercury300NMR spectrometer和氘代氯仿作为溶剂获得NMR图谱数据。化学位移(δ) 报告为从四甲基硅(TMS)开始到低磁场位移的百万分之一(ppm)。
HPLC方法
通过Beckman Coulter System GoldHPLC装置监控反应混合物 以及监控中间体和最终产品的纯度，使用ZOBAX300SB C-8反相 柱(150×4.6mm)或Phenomenex Jupiter300A C18反相柱(150×4.6 mm)、多波长UV检测器，使用0.5％三氟乙酸(TFA)中的30-90％乙 腈梯度洗脱，流速为1mL/min。
实施例1
化合物(1)的合成
在1小时的时间内向在冰浴中冷却到5℃的二碳酸二叔丁酯(15g， 86mmol)的1，4-二氧杂环己烷(150mL)溶液中滴加2，2′-(亚乙二氧基)双 (乙胺)(25.85g，174.4mmol)的1，4-二氧杂环己烷(100mL)溶液。使反应 混合物升温到室温并再搅拌两小时。减压除去溶剂并将残余物溶解于 二氯甲烷(DCM，150mL)中，用水(3×150mL)洗，干燥(MgSO4)，过 滤并减压蒸发溶剂，得到1(13.84g，68.8mmol，80％)。13C NMR(75.5 MHz，CDCl3)δ115.76，79.03，73.45，70.12，40.31，28.39。
实施例2
化合物(3)的合成
在室温下搅拌1(3.0g，12.1mmol)、二甘醇酸酐(2，1.26g，10.9 mmol)、和DMAP(1.4g，11.5mmol)在无水DCM(30mL)中的溶液18小 时。混合物用0.1N HCl(30mL)洗，并将有机层干燥(无水硫酸钠)， 过滤，并减压除去溶剂，得到3(1.5g，4.14mmol，38％)。13C NMR(75.5 MHz，CDCl3)δ173.37，171.27，169.94，169.59，157.81，155.96，81.15， 79.30，71.78-68.76(m)，41.59，40.13，38.94，38.73，28.27。
实施例3
化合物(6)的合成
在室温下搅拌4(24.0g，0.228mol)和5(12.0g，0.061mol)在无水二 氯甲烷(DCM，400mL)中的溶液18小时。反应混合物用水(4×150mL)洗 并用无水硫酸钠干燥有机层，随后过滤并在真空中除去溶剂，得到6(6.1 g，0.0279mol，46％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ172.1，81.4，59.5， 57.0，56.3，27.8。
实施例4
化合物(7)的合成
向冷却到0℃的3(0.5g，1.37mmol)、6(0.090g，0.41mmol)、 DMAP(0.46g，3.8mmol)、和三氟甲磺酸钪(0.04g，0.023mmol)在无水 DCM(10mL)中的溶液中加入EDC(0.35g，1.8mmol)。将混合物置于冰 浴中自然升温到室温过夜。混合物用水洗，然后用0.1N HCl洗。将有 机层干燥(无水硫酸钠)，过滤并减压除去溶剂，得到7(0.37g，0.41 mmol，～100％)。13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.15，169.38，168.64， 155.73，81.23，79.05，70.95，69.86，69.58，68.33，67.55，63.18，53.09， 52.85，40.31，38.59，28.37，28.14。
实施例5
化合物(8)的合成
向7(0.38g，0.42mmol)的DCM(8mL)溶液中加入三氟乙酸(TFA，2 mL)并在室温下搅拌溶液15分钟，随后减压除去溶剂，得到8(0.38g，0.42 mmol，～100％)。8的结构由13C NMR证实。
实施例6
化合物(10)的合成
制备8(0.38g，0.42mmol)和DMAP(0.16g，1.3mmol)在无水 DCM(30mL)中的溶液并首先将其22mL加入到9(8.0g，0.66mmol)的 DCM(30mL)溶液中。在室温下搅拌得到的混合物6小时，随后加入 剩余的8的溶液并再搅拌12小时。减压下部分除去溶剂并用乙醚沉 淀产物，过滤，并将残余物从异丙醇(IPA，160mL)结晶，得到10(7.8g， 0.63mmol，95％)。13C NMR(75.5MHz，CDC13)δ169.82，169.10，168.32， 155.87，80.85，71.51-67.28(PEG)，63.48，62.88，58.61，55.80，52.55，40.44， 38.26，27.88。
实施例7
化合物(11)的合成
在室温下搅拌10(6.7g，0.27mmol)的DCM(68mL)和TFA(34mL) 中的溶液15小时，随后减压下部分除去溶剂。用乙醚沉淀产物，过滤 器并用乙醚洗，得到化合物11(6.7g，0.27mmol，-100％)。13C NMR(75.5 MHz，CDCl3)δ169.04，168.67，168.37，155.94，71.51-68.04(PEG)，63.48， 62.71，58.59，55.07，52.84，40.43，38.23。
实施例8
化合物(12)的合成
将11(6.9g，0.27mmol)、2-巯基噻唑啉(0.10g，0.84mmol)、和 DMAP(0.136g，1.12mmol)在DCM(70mL)中的溶液冷却到0℃，随后 加入EDC(0.16g，0.84mmol)。使混合物升温到室温并搅拌12小时。 减压下部分除去溶剂并用乙醚沉淀产物，过滤并从IPA(140mL)结晶， 得到12(6.0g，0.23mmol，87％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ201.05， 172.52，169.10，168.31，155.85，71.51-67.11(PEG)，63.46，63.08，60.47， 58.58，55.33，52.55，40.44，38.28，28.71。
实施例9
化合物(13)的合成
向12(2.0g，0.089mmol)和阿霉素盐酸盐(0.103g，0.179mmol)在 DCM/DMF(20mL/20mL)的混合物中的溶液中加入DMAP(0.043g，0.35 mmol)。在氮气下搅拌混合物18小时，随后在减压下部分除去溶剂用 乙醚沉淀PEG衍生物，通过过滤收集，并从DMF/IPA(8mL/32mL)结 晶两次，得到13(1.6g，0.065mmol，73％)。13C NMR(67.8MHz，CDCl3)δ 313.32，186.56，186.18，169.50，168.93，168.55，160.58，155.99，155.85， 155.23，135.38，135.05，133.46，133.28，120.47，119.39，118.17，111.14， 110.93，100.54，72.0-69.0(PEG)，68.01，65.17，63.67，62.65，58.68，56.41， 54.07，40.54，38.40，35.51，33.56，29.73，16.69。
实施例10
化合物(15)的合成
在室温下搅拌14(3.0g，12.1mmol)、2(1.26g，10.9mmol)、和 DMAP(1.4g，11.5mmol)在无水DCM(30mL)中的溶液18小时。混合物 用0.1N HCl(30mL)洗并干燥(无水硫酸钠)有机层，过滤并在减压下除 去溶剂，得到15。15的结构通过13C NMR证实。
实施例11
化合物(16)的合成
向冷却到0℃的15(0.5g，1.37mmol)、6(0.090g，0.41mmol)、 DMAP(0.46g，3.8mmol)、和三氟甲磺酸钪(0.04g，0.023mmol)在无水 DCM(10mL)中的溶液中加入EDC(0.35g，1.8mmol)。使混合物置于冰 浴中在过夜期间自然升温到室温。混合物用水洗，然后用0.1N HCl洗。有机层干燥(无水硫酸钠)，过滤并减压除去溶剂，得到16。16的 结构通过13C NMR证实。
实施例12
化合物(17)的合成
向16(0.38g，0.42mmol)的DCM(8mL)溶液中加入三氟乙酸(TFA， 2mL)并在室温下搅拌溶液15分钟，随后减压下除去溶剂，得到17。17 的结构通过13C NMR证实。
实施例13
化合物(18)的合成
制备17(0.38g，0.42mmol)和DMAP(0.16g，1.3mmol)在无水 DCM(30mL)中的溶液并首先将其22mL加入到9a(8.0g，0.66mmol)的 DCM(30mL)溶液中。在室温下搅拌得到的混合物6小时，随后加入剩 余的18的溶液并再搅拌12小时。减压下部分除去溶剂并用乙醚沉淀产 物，过滤并将残余物从异丙醇(IPA，160mL)结晶，得到18。18的结 构通过13C NMR证实。
实施例14
化合物(19)的合成
在室温下搅拌18(6.7g，0.27mmol)在DCM(68mL)和TFA(34mL) 中的溶液15小时，随后减压除去溶剂。用乙醚沉淀产物，过滤并用乙 醚洗，得到化合物19。19的结构通过13C NMR证实。
实施例15
化合物(20)的合成
将19(6.9g，0.27mmol)、2-巯基噻唑啉(0.10g，0.84mmol)、和 DMAP(0.136g，1.12mmol)的DCM(70mL)溶液冷却到0℃，随后加入 EDC(0.16g，0.84mmol)。使反应混合物升温到室温并搅拌12小时。减 压下部分除去溶剂并用乙醚沉淀产物，过滤并从IPA(140mL)结晶，得 到20。20的结构通过13C NMR证实。
实施例16
化合物(21)的合成
向20(2.0g，0.089mmol)和阿霉素盐酸盐(0.103g，0.179mmol)在 DCM/DMF(20mL/20mL)的混合物中的溶液中加入DMAP(0.043g，0.35 mmol)。在氮气下搅拌混合物18小时，随后减压下部分除去溶剂。用 乙醚沉淀PEG衍生物，通过过滤收集并从DMF/IPA(8mL/32mL)结晶 两次，得21。21的结构通过13C NMR证实。
实施例17
化合物(26)的合成
在与制备化合物18相似的条件下制备化合物26。
实施例18
化合物(29)的合成
在与制备化合物21相似的条件下制备化合物29。
实施例19
化合物35的合成
除了只是将一当量的化合物3与一当量化合物6反应之外，在与 制备化合物13相似的条件下制备化合物35。
实施例20
化合物43的合成
在与制备化合物13相似的条件下制备化合物35，除了只是将一 当量的化合物3与一当量化合物6反应以得到化合物36、一当量的化 合物36与一当量的化合物37反应以得到38之外，其余的反应条件 相同，得到化合物43。
实施例21
蛋白质结合
材料和方法
鸡蛋白溶菌酶(EC 3.2.1.17)、溶菌酶底物细菌(Micrococcus lysodeikticus)、和PBS缓冲液(10mM磷酸盐，pH 7.4，138mM NaCl， 和2.7mM KCl)购自Sigma Inc.(St.Louis，MO)。预制的Tris-glycine SDS 电泳凝胶和凝胶运行缓冲液得自Invitrogen(Carlsbad，CA)。用于测量 结合体体内水解的大鼠血浆在EDTA中处理并冷冻储存。IL-2购自 PeproTech(Princeton，NJ)，GFP得自Clontech(Palo Alto，CA)。所有的 体内测量进行一式三份，体外测量有±5％的标准偏差。
单PEG-溶菌酶结合体的制备
得自鸡蛋的溶菌酶的分子量为14,500并具有6个赖氨酸残基。 在快速搅拌下，将反应摩尔比为1∶1(PEG∶溶菌酶)的经过活化的PEG 粉末加入到5mg/mL溶菌酶在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.3)的溶液中。 在25℃搅拌45分钟之后，用0.2M磷酸钠(pH 5.1)处理反应到最终的 pH6.5。使用6,000-8,000MW截止膜将反应混合物相对于4℃的20mM 磷酸钠(pH 5.1)透析。透析之后样品的导电率应小于2mS。使用具 有NaCl梯度的20mM磷酸钠(pH5.1)在阳离子交换柱(Pores，HS)上 进行单PEG-溶菌酶的分离。收集单PEG-溶菌酶的峰并使用具有10k NMWL膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)的ultrafree离心过滤装置浓 缩。纯化的单PEG-溶菌酶的收率为约20-30％。
多PEG-溶菌酶结合体的制备
在快速搅拌下，将反应摩尔比为30∶1(PEG∶溶菌酶)的经过活化的 PEG连接体加入到5mg/mL溶菌酶在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.3)的溶 液中。在室温下搅拌45分钟之后，用0.2M磷酸钠(pH 5.1)处理反应到 最终的pH6.5。使用H2O稀释反应混合物并在Hiload Superdex 200柱上 以1mL/min分离。柱缓冲液包含20mM磷酸钠(pH 6.8)和140mM NaCl。收集峰的级分并使用具有30k NMWL膜(Millipore Corp.，Bedford， MA)的ultrafree离心过滤装置浓缩。纯化的多PEG-溶菌酶的收率为约 85％，并且通过荧光分析发现每溶菌酶分子的PEG数为约5-6。
浓度测定
在280nm下在0.1M磷酸钠(pH 7.3)中以2.39mL/mg.cm的消 光系数测定PEG-溶菌酶结合体的浓度。
溶菌酶的酶活性分析
在如上所述的反应条件下在只与单一PEG结合之后溶菌酶活性 消失。在多种释放条件下通过溶菌酶活性的再生并在SDS电泳凝胶上 确认表明溶菌酶的释放。在典型的溶菌酶活性分析中，在96孔滴定 板上将0.2mL的0.02％(w/v)Mlysodeikticus(底物)加入到50μL的包 含0.01％BSA的66mM磷酸钾(pH 6.2)中的0.12-0.25μg溶菌酶 中。跟踪在450nm下的吸光率5分钟。将吸光率的减少率作为酶活 性的度量。在25℃时，一个单元的酶活性在450nm下生产0.001吸光 率单位/分钟的变化。
溶菌酶在大鼠血浆和化学缓冲液中的释放
使磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的PEG-溶菌酶结合体经历与PBS(pH 7.4)的缓冲液交换，以监控在大鼠血浆中的释放。测量37℃时PBS的 稳定性。结合体还经历与H2O的缓冲液交换用于在三羟甲基氨基甲烷 缓冲液(pH8.5)中释放。对单PEG-溶菌酶结合体使用CentriCon 10K 离心管(Millipore Corp.，Bedford，MA)，而对多PEG-溶菌酶结合体使用 CentriCon 30K。溶菌酶从单PEG-溶菌酶结合体或多PEG-溶菌酶结合 体的释放在氮气下在0.15mg/mL条件下进行。在所指时间，抽取小 份试样，用0.2M磷酸盐(pH 5.1)中和到pH 6.5，并在进一步分析之前 保存在-20℃下。
结果
表1.PEG-N-二(羟乙基)甘氨酸-阿霉素的性质 化合物 t1/2(rp)小时 mw 活性％ IC50(nM) 13 3.2 25233 1.80 455
表2.PEG化的溶菌酶在大鼠血浆和缓冲液中的释放速率* 化合物 血浆 PBS，25℃ PBS，37℃ pH 8.5，37℃ 13a 5 36 12 1.3 13b 6 48 15 2
*数据表示为以小时计的t1/2。在血浆中释放监控为3天，在pH 8.5 缓冲液中释放监控为5天，在PBS中释放监控为7天。PBS包含138mM NaCl、2.7mM KCl、和10mM磷酸盐，pH 7.4。溶菌酶的释放通过 溶菌酶活性的再生检测，并通过凝胶电泳加以证实。