技术领域
本发明涉及一种应用佐剂制备新城疫灭活疫苗的方法，还涉及所述方法制备得到的新城疫灭活疫苗，属于新城疫灭活疫苗的制备领域。
背景技术
佐剂(adjuvant)，又称免疫佐剂，其功能是与抗原混合后注射于动物体内，能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用。凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均可称为佐剂。佐剂的种类非常多，常规佐剂包括铝盐类、油乳剂、蜂胶佐剂。最常见的佐剂为油类佐剂，例如弗氏佐剂、白油佐剂、MF-59、SAF等，这类佐剂通常具有良好的免疫增强作用。
目前，新城疫灭活疫苗免疫效果不理想，亟待开发一种可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫的新城疫灭活疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种应用佐剂制备新城疫灭活疫苗的方法，该方法制备的新城疫灭活疫苗可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，延长免疫保护期。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明公开了一种制备新城疫灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)增殖新城疫病毒，收获病毒液，灭活；(2)向灭活后的病毒液中加入左旋咪唑母液，混匀，得到水相溶液；(3)向水相溶液中加入表面活性剂，混匀；(4)加入白油，乳化，即得。
其中，步骤(1)采用SPF鸡胚增殖新城疫病毒；优选的，所述新城疫病毒为新城疫病毒La Sota株；
步骤(2)所述左旋咪唑母液是左旋咪唑含量为50mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑注射液；优选的，所述左旋咪唑母液用0.22μm滤器过滤除菌；
步骤(2)每毫升水相溶液中含有左旋咪唑2mg、5mg或10mg；优选为10mg；并调整水相溶液的pH值达中性。
例如，步骤(2)取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml与96ml灭活病毒液混合均匀，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为2mg的水相溶液；取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml与90ml灭活病毒液混合均匀，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为5mg的水相溶液；取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml与80ml灭活病毒液混合均匀，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为10mg的水相溶液。
步骤(3)所述表面活性剂的加入量为灭活后的病毒液体积的5％；优选的，所述表面活性剂为吐温-80。
步骤(4)按体积比计，经步骤(3)处理的水相溶液与白油的比例为l：1.5。
本发明对制备新城疫灭活疫苗的佐剂进行了筛选实验，分别以左旋咪唑与弗氏佐剂、左旋咪唑与皂苷、左旋咪唑与白油、白油与卡波姆(树脂)、白油与黄芪多糖为佐剂制备新城疫灭活疫苗。结果表明，佐剂为左旋咪唑与白油制备的新城疫灭活疫苗的免疫效果最好，HI抗体水平最高，免疫后28天HI抗体平均水平达8.9log2。因此，本发明选择白油与左旋咪唑为制备灭活疫苗的佐剂，并进一步对左旋咪唑用量进行优化。结果表明，含2-10mg左旋咪唑的疫苗免疫组HI抗体平均水平高于添加其他量左旋咪唑的疫苗免疫组；而含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组HI抗体平均水平显著高于其他组。
本发明还公开了所述方法制备得到的新城疫灭活疫苗。动物免疫试验结果表明，制备得到的新城疫灭活疫苗免疫鸡只后无局部或全身反应，安全性好；免疫后可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫；含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组免疫后10周脾淋巴细胞中IFN-γ含量为8076.92pg/mL，具有更好的保护作用，延长疫苗免疫保护期。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明制备的新城疫灭活疫苗，免疫鸡只后无局部或全身反应，安全性好；
(2)本发明制备的新城疫灭活疫苗免疫鸡只后，可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有更好的保护作用，延长疫苗免疫保护期。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。
术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料和动物
新城疫病毒La Sota株，购自中国兽药监察所，HA效价为28，-20℃保存备用；盐酸左旋咪唑注射液，白油佐剂购自美国索诺邦公司；30日龄SPF鸡，整个饲养过程均在公司生产的隔离器中进行，饲料经高压灭菌，水为酸化水。采血用鸡为成年SPF公鸡。
实施例1水相溶液配制
1、左旋咪唑母液的制备
用市售的左旋咪唑含量为50mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑注射液作为左旋咪唑母液；将其用0.22μm滤器(购自赛多利斯)过滤除菌后备用。
2、配制水相溶液
取50mg/ml的左旋咪唑母液4ml与96ml鸡新城疫灭活病毒液混合均匀，并调整pH值达中性，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为2mg的水相溶液。
实施例2水相溶液配制
1、左旋咪唑母液的制备
用市售的左旋咪唑含量为50mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑注射液作为左旋咪唑母液；将其用0.22μm滤器(购自赛多利斯)过滤除菌后备用。
2、配制水相溶液
取50mg/ml的左旋咪唑母液10ml与90ml鸡新城疫灭活病毒液混合均匀，并调整pH值达中性，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为5mg的水相溶液。
实施例3水相溶液配制
1、左旋咪唑母液的制备
用市售的左旋咪唑含量为50mg/ml的兽用盐酸左旋咪唑注射液作为左旋咪唑母液；将其用0.22μm滤器(购自赛多利斯)过滤除菌后备用。
2、配制水相溶液
取50mg/ml的左旋咪唑母液20ml与80ml鸡新城疫灭活病毒液混合均匀，并调整pH值达中性，即为每毫升溶液中含有左旋咪唑为10mg的水相溶液。
实施例4新城疫灭活疫苗的制备
将新城疫病毒La Sota株用灭菌生理盐水作10-5倍稀释，各接种9～10日龄SPF胚10枚，0.1mL/枚，接种后密封针孔，置于37℃继续孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。将在48h前死亡的鸡胚弃去，48h后，每4～8h照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。
将冷却4～24h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术去除拟定部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛屑囊膜及羊膜，收集48～120h死亡和120h后的活胚的尿囊液。
将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内，向灭活病毒液中加入左旋咪唑母液制备水相溶液，并调整pH值达中性，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑2mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
实施例5新城疫灭活疫苗的制备
按照实施例4的方法增殖新城疫病毒，收获病毒液，灭活；
将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内，向灭活病毒液中加入左旋咪唑母液制备水相溶液，并调整pH值达中性，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑5mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
实施例6新城疫灭活疫苗的制备
按照实施例4的方法增殖新城疫病毒，收获病毒液，灭活；
将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内，向灭活病毒液中加入左旋咪唑母液制备水相溶液，并调整pH值达中性，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
实验例1新城疫灭活疫苗免疫佐剂的筛选实验
根据所查文献，本发明初步筛选以下几种佐剂进行评价研究：
弗氏佐剂(Freund adjuvant)是目前最常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或吐温80)制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆菌(如死卡苗)则称为完全弗氏佐剂。
卡波姆(carbopol)是一种聚丙烯酸交联聚合物，在低剂量下就能产生很高的豁度，这个特性使卡波姆可以用作增稠剂以及缓释溶剂。作为疫苗佐剂卡波姆可以通过储库作用增强疫苗免疫能力，目前已有多种商品化疫苗采用卡波姆作为佐剂或佐剂成分之一使用。卡波姆常用的型号包括934，941，974，971等。
黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是一种中药多糖，能显著增强细菌类疫苗的保护效力，通过促进淋巴细胞的增殖发育，从而调节细胞免疫功能。此外，黄芪多糖还具有活化补体，诱导细胞因子分泌等作用；高剂量的黄芪多糖对体液免疫和细胞免疫反应的促进作用尤为显著。
皂甙QuilA及其单体成分是南美奎拉雅属皂树皮提取物。研究发现其能够与细胞膜上的胆固醇形成复合物，是抗原强有力的佐剂。机理包括:诱导产生特异性MHCI抗原限制性CTL；诱导产生多种细胞因子，如IL-10、IL-4、IFN、IL-2、IL-8；提高动物机体对抗原的特异性抗体的水平，刺激产生IgG1、IgG2b和IgG2a抗体亚类。皂甙发挥佐剂活性的特点是诱导一个平衡的Th1/Th2反应T细胞依赖性和缺乏全身性作用。目前已在实验室应用于多种疫苗的研究，具有广阔的前景。
左旋咪唑(levamisole)是一种高效驱线虫药，1971年，Renoux等发现其具有明显的增强免疫应答的能力。现在左旋咪唑作为疫苗佐剂和免疫增强剂已被广泛应用于各类疫苗的临床使用中。左旋咪唑具有拟胆碱能活性和拟胸腺激素作用，能够诱导T细胞发育，促进细胞免疫应答。
1、实验方法
分别配制含不同佐剂的疫苗：
A组佐剂为左旋咪唑与弗氏佐剂：
新城疫灭活疫苗的制备：经SPF鸡胚扩增新城疫病毒La Sota株，收集48～120h死亡和120h后的活胚的尿囊液，将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内。向灭活病毒液中加入左旋咪唑，制备水相溶液，并调整pH值达中性，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入弗氏佐剂，充分乳化后，取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第l滴外，不扩散，判为合格。充分摇匀后，定量分装，完成后置4℃备用。
B组佐剂为左旋咪唑与皂苷：
新城疫灭活疫苗的制备方法同上：向灭活病毒液中加入左旋咪唑，制备水相溶液，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入皂苷，即得。
C组佐剂为左旋咪唑与白油：
新城疫灭活疫苗的制备方法同上：向灭活病毒液中加入左旋咪唑制备水相溶液，每毫升水相溶液中含有左旋咪唑10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
D组佐剂为白油与卡波姆(树脂)：
新城疫灭活疫苗的制备方法同上：向灭活病毒液中加入卡波姆，制备水相溶液，每毫升水相溶液中含有卡波姆10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
E组佐剂为白油与黄芪多糖：
新城疫灭活疫苗的制备方法同上：向灭活病毒液中加入黄芪多糖，制备水相溶液，每毫升水相溶液中含有黄芪多糖10mg。再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，充分乳化，即得。
将以上制备的新城疫灭活疫苗分别免疫SPF鸡，各组免疫相同的剂量0.02ml/只，免疫方式为颈部皮下注射，每组10只SPF鸡，同时留5只不免疫作为对照组，观察免疫及保护效果。免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。分别在免疫后第7d、14d、21d、28d翅下静脉采血，分离血清，用HI方法测定血清抗体效价。
2、实验结果
用不同佐剂制备的新城疫灭活疫苗接种后动物的临床反应见表1，结果表明，B、C、D组佐剂和普通白油制备的疫苗在SPF鸡均未出现因注射疫苗引起死亡或明显的局部或全身反应。
表1不同佐剂接种后动物的临床反应
免疫后HI效价检测结果见表2，结果表明，C组(即佐剂为左旋咪唑与白油)制备的新城疫灭活疫苗的免疫效果最好，HI抗体水平最高。因此，本发明新城疫灭活疫苗免疫佐剂选择左旋咪唑与白油。
表2免疫后HI效价检测结果
实验例2新城疫灭活疫苗免疫佐剂的用量优化实验
通过实验例1，本发明优选白油与左旋咪唑为制备灭活疫苗免疫佐剂，并对左旋咪唑用量进行优化。
1、实验方法
经SPF鸡胚扩增新城疫病毒La Sota株，向灭活病毒液中添加不同浓度左旋咪唑制备水相溶液(水相溶液的制备方法同实施例1-3)，再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀；再按l：1.5体积比，向加入吐温-80的水相溶液中加入白油，混合，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量0.02ml/只，免疫方式为颈部皮下注射，观察免疫效果。
实验动物分组：
A：表示每毫升水相溶液中含0.5mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
B：表示每毫升水相溶液中含1mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
C：表示每毫升水相溶液中含2mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
D：表示每毫升水相溶液中含3mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
E：表示每毫升水相溶液中含5mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
F：表示每毫升水相溶液中含7mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
G：表示每毫升水相溶液中含9mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
H：表示每毫升水相溶液中含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
I：表示每毫升水相溶液中含11mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
J：表示每毫升水相溶液中含13mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
K：表示每毫升水相溶液中含15mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
L：表示每毫升水相溶液中含20mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
M：表示不含左旋咪唑的胚毒与白油制备疫苗免疫组；
NC：空白对照组。
每组25只SPF鸡，同时留25只不免疫作为空白对照组。免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。分别在免疫后第7d、14d和21d翅下静脉采血，分离血清，用HI方法测定血清抗体效价。
2.试验结果
疫苗免疫后，鸡群外观、食欲均正常，无不良反应，接种部位无红肿现象，吸收效果良好，说明含左旋咪唑的鸡新城疫灭活疫苗对鸡只安全。
分别于免疫后第7d、14d、21d翅下静脉采血，分离血清，测定血清抗体效价，结果(表3)表明，添加不同浓度左旋咪唑的疫苗免疫组的HI抗体平均水平均明显高于不含左旋咪唑的白油制备疫苗免疫组和空白对照组。由表3可以看出，含2-10mg左旋咪唑的疫苗免疫组HI抗体平均水平高于添加其他量左旋咪唑的疫苗免疫组，而含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组HI抗体平均水平显著高于其他各组。
表3不同实验组HI抗体平均水平
实验例3动物免疫试验
1、实验方法
1.1新城疫灭活疫苗的制备
1.1.1新城疫病毒在鸡胚上增殖
将新城疫病毒La Sota株用灭菌生理盐水分别作10-5倍稀释，各接种9～10日龄SPF胚10枚，0.1mL/枚，接种后密封针孔，置于37℃继续孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。将在48h前死亡的鸡胚弃去，48h后，每4～8h照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。
将冷却4～24h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术去除拟定部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛屑囊膜及羊膜，收集48～120h死亡和120h后的活胚的尿囊液，单胚单收，并分别测定每胚的HA效价及混合后原液的EID50。
1.1.2新城疫灭活疫苗的制备
将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内，先加入不同浓度的左旋咪唑制备水相溶液，再加入灭活病毒液体积5％的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l：1.5体积比向加入吐温-80的水相溶液中加入白油佐剂，充分乳化后，取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第l滴外，不扩散，判为合格。充分摇匀后，定量分装，置4℃备用。
1.1.4新城疫灭活疫苗安全性试验
用10-14日龄SPF鸡10只，颈部皮下接种新城疫灭活疫苗1.0ml，观察14天，应不出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。
1.1.5免疫
为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，将经SPF鸡胚扩增的病毒液添加不同浓度左旋咪唑并与白油佐剂进行乳化，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量0.02ml/只，免疫方式为颈部皮下注射，观察免疫及保护效果。
实验动物分组：
A—表示每毫升水相溶液中含1mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
B—表示每毫升水相溶液中含5mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
C—表示每毫升水相溶液中含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
D：表示每毫升水相溶液中含11mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
E：表示每毫升水相溶液中含13mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
F：表示每毫升水相溶液中含15mg左旋咪唑的疫苗免疫组；
G—表示不含左旋咪唑的胚毒与白油制备疫苗免疫组；
NC—空白对照组。
每组25只SPF鸡，同时留25只不免疫作为空白对照组。免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。分别在免疫后第7d、14d、21d至90d翅下静脉采血，分离血清，用HI方法测定血清抗体效价。
1.1.6免疫鸡淋巴细胞增殖试验
实验期间每周每组随机剖杀2只鸡，取脾做淋巴细胞增殖试验，以特异性全病毒蛋白刺激脾淋巴细胞，观察淋巴细胞增殖情况。淋巴细胞增殖试验参照淋巴细胞增殖试验CCK-8试剂盒说明书进行。
鸡脾淋巴细胞的制备：取SPF鸡静脉注射空气处死后，放入70％酒精中浸泡5min；之后无菌手术开腹，取出脾脏，放于加有不完全RPMI-1640培养基的平皿中；将脾脏剪碎放在铜网上，用注射器针芯挤压研磨脾脏；取出铜网，反复吹吸几次后，将脾细胞悬液转移到50mL离心管中，加不完全培养液至30mL，混匀，1500r/min、4℃离心6min，弃上清；然后向细胞沉淀中加入10mL红细胞裂解液，重悬，37℃裂解5min后，1500r/min、4℃离心6min，弃上清；细胞沉淀用10mL含3％血清的Hank’s液洗涤2次；用RPMI-1640完全培养液将制备好的脾淋巴细胞悬液调整至2×106个/mL后，加至96孔细胞培养板中，每孔200μL。每只鸡脾淋巴细胞分别设9孔，其中3孔加入20μL纯化的新城疫病毒作为特异性刺激抗原作为实验孔，终浓度为5μg/mL；3孔不加入任何刺激抗原作为细胞增殖的本底对照、3孔加入终浓度为20μg/mL的刀豆球蛋白A(ConA)作为阳性对照；37℃5％CO2培养箱内培养60h；加入10μl的CCK-8试剂后继续培养4h，于450nm波长测量各孔的吸光度，计算刺激指数。
刺激指数(Stimulation Index，SI)＝实验组OD均值/相应本底OD均值。
1.1.7鸡γ干扰素(IFN-γ)检测
取制备好的脾淋巴细胞悬液加至6孔细胞培养板中，每孔3mL。37℃、5％CO2培养箱内培养5d后移取细胞悬液，3000r/min离心10min，收集上清液，4℃暂存备用。
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IFN-γ，具体操作按鸡γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒使用说明书进行。向预先包被γ干扰素(IFN-γ)抗体的包被微孔中依次加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后用底物TMB显色。颜色的深浅和样品中的γ干扰素(IFN-γ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。
IFN-γ检测操作步骤：
(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；
(2)设置标准品孔、样本孔、空白孔。标准品孔各加浓度为0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(样品最终稀释度为5倍)；空白孔不加；
(3)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封板后置37℃恒温箱温育60min；
(4)小心揭掉封板膜，弃去液体，吸水纸上甩干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上甩干，如此重复洗板5次；
(5)每孔先加入底物A 50μL，再加入底物B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15min；
(6)每孔加终止液50μL，终止反应，15min内在450nm波长下测量各孔的吸光度；
(7)在Excel工作表中，以标准品的浓度为横坐标，对应OD450nm值为纵坐标，绘出标准品线性回归曲线，计算出标准曲线的直线回归方程式；
(8)将样品的OD450nm值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以总稀释倍数(×n×5)，即为样品的实际浓度。
2、实验结果
2.1新城疫病毒的效价测定
经测定，新城疫病毒EID50＞108.0/0.1ml，符合制苗要求。
表4新城疫病毒的效价测定
2.2免疫效果检测
疫苗免疫后，鸡群外观、食欲均正常，无不良反应，接种部位无红肿现象，吸收效果良好，说明含左旋咪唑的新城疫灭活疫苗对鸡只安全。
分别于免疫后第7d、14d、21d至90d翅下静脉采血，分离血清，测定血清抗体效价，结果(表5)表明，添加不同浓度左旋咪唑的疫苗免疫组的HI抗体平均水平均明显高于不含左旋咪唑的白油制备疫苗免疫组和空白对照组；其中，含5-10mg左旋咪唑的疫苗免疫组HI抗体平均水平高于含11、13、15mg左旋咪唑的疫苗免疫组；而含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组(C组)HI抗体平均水平显著高于其他各组。
表5不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平
2.3免疫鸡淋巴细胞增殖试验
淋巴细胞增殖试验结果见表6。结果表明，添加不同浓度左旋咪唑的疫苗免疫组的刺激指数均高于不含左旋咪唑的白油制备疫苗免疫组和空白对照组；其中，含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组(C组)的刺激指数显著高于其它组。结果显示，左旋咪唑能够显著增强淋巴活性细胞增殖；疫苗免疫后可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有较好的保护作用。
表6鸡免疫后脾淋巴细胞增殖反应
注：数据均以表示，同一列数据中右上角无相同小写字母(a，b，c)者表明组间差异显著(p＜0.05)。
2.4干扰素(IFN-γ)检测
IFN-γ标准曲线的直线回归方程式为：y＝0.0156x，R2＝0.9885。换算出不同ND疫苗免疫后各组脾淋巴细胞中IFN-γ含量，结果见表7。结果表明，免疫后1-10周，含10mg左旋咪唑的疫苗免疫组的脾淋巴细胞中IFN-γ含量显著高于其它免疫组，免疫后10周脾淋巴细胞中IFN-γ含量为8076.92pg/mL，说明添加左旋咪唑可增强新城疫灭活疫苗的免疫功能，延长疫苗免疫保护期。
表7免疫后各组脾淋巴细胞中IFN-γ含量(单位：pg/mL)