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1、(10)申请公布号 CN 102552273 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102552273 A *CN102552273A* (21)申请号 201010602501.9 (22)申请日 2010.12.23 A61K 31/519(2006.01) A61K 31/353(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 余龙 刘祖龙 张明君 朱恒锐 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名。
2、称 含有表没食子儿茶素没食子酸酯与甲氨蝶呤 的组合物 (57) 摘要 本发明属于医药和基因工程领域， 提供了 一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制 肿瘤细胞增殖的组合物， 包括活性成分表没食 子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤以及药剂学上 必要的辅料， 所述的表没食子儿茶素没食子酸 酯和甲氨蝶呤的摩尔比为 800 ： 3-1.5 ： 1。本发 明实验证实， 所述的表没食子儿茶素没食子酸 酯与 Methotrexate 制 成 的 组 合 物， 或 在 给 予 Methotrexate 时联合使用表没食子儿茶素没食 子酸酯可显著提高 Methotrexate 抑制肿瘤细胞 增殖的治疗效果。对裸鼠肝。
3、脏和肾脏基本没有毒 性， 且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯 资源丰富， 价格低廉， 在提高肿瘤的抑制率的同 时， 降低了肿瘤患者的治疗成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物， 包括活性成分和药剂学上必要的辅料， 其特征在 于， 所述的活性成分是以下物质 ： 1） 表没食子儿茶素没食子酸酯， 2） 甲氨蝶呤 ； 所述的表没 食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为 800 ： 3 1.5 ： 1。 2. 如权利要求 。
4、1 所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物， 其特征在于， 表没食子儿茶素没 食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为 160:1 2:1。 3. 如权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤 的摩尔比为 80:1 8:1。 4. 如权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于， 表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤 的摩尔比为 80:3 20:1。 5. 权利要求 1 所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 6. 如权利要求 5 所述的应用， 其特征是， 所述的肿瘤是肝癌。 7. 一种抑制肿瘤细胞增长的方法， 其特征在于， 在肿瘤细胞中加入权利要求 1 所述组 合物。 8. 如权利。
5、要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述的肿瘤细胞是 SK-Hep-1 或者 HepG2 细 胞。 权 利 要 求 书 CN 102552273 A 2 1/5 页 3 含有表没食子儿茶素没食子酸酯与甲氨蝶呤的组合物 技术领域 0001 本发明属于医药及基因工程领域， 涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物， 尤其涉及由 表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 与 Methotrexate（甲氨蝶呤， 或者氨甲蝶呤） 制成的抑 制肿瘤细胞增殖的组合物。 背景技术 0002 甲氨蝶呤 ( 氨甲蝶呤， 氨甲叶酸 )， 英文 / 拉丁名称 ： Methotrexate， 别名 ： 氨甲叶 酸， 威力氨甲蝶呤。
6、， 氨克生 （Trexan） ， Amethopterin， MTX， Emthexate， FarmachemiceB.V， Farmothrex（Farmos） 。甲氨蝶呤片剂为橙黄色结晶性粉末。本品在水、 乙醇、 氯仿或乙醚 中几乎不溶 ； 在稀碱溶液中易溶， 在稀盐酸中溶解。 0003 甲氨蝶呤的适应症有 ： （1） 全身用药治疗绒毛膜上皮癌、 恶性葡萄胎、 各类急性 白血并乳腺癌、 肺癌、 头颈部癌、 消化道癌、 宫颈癌及恶性淋巴瘤等。 （2） 动脉插管灌注对头 颈部癌和肝癌有较好疗效。 （3） 大剂量甲氨蝶呤辅以甲酰四氢叶酸钙救援 （HDMTX-CFR 疗 法） ， 作为骨肉瘤、 。
7、软组织肉瘤、 恶性淋巴瘤、 急性淋巴细胞性白血并乳腺癌、 卵巢癌。小细胞 肺癌等术后辅助化疗或晚期病变全身治疗有一定疗效。 0004 副作用表现 ： 1 胃肠道反应主要为口腔炎、 口唇溃疡、 咽炎、 恶心、 呕吐、 胃炎及 腹泻。2 骨髓抑制主要表现为白细胞下降， 对血小板亦有一定影响， 严重时可出现全血下 降、 皮肤或内脏出血。3 大量 1 次应用可致血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 升高， 或药物性肝 炎， 小量持久应用可致肝硬变。4 肾脏损害常见于高剂量时， 出现血尿、 蛋白尿、 尿少、 氮质 血症、 尿毒症等。 5 还有脱发、 皮炎、 色素沉着及药物性肺炎等， 鞘内或头颈部动脉注射剂量。
8、 过大时， 可出现头痛、 背痛、 呕吐、 发热及抽搐等症状。6 妊娠早期使用可致畸胎， 少数病人 有月经延迟及生殖功能减退。 0005 茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。 全世界每年生产 大约 250 万吨， 其中 20% 为绿茶、 78% 为红茶、 2% 为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多， 但以绿茶 为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应， 如防 癌抗癌、 抗血管生成、 抗突变、 抗氧化、 抗衰老、 抗菌、 抗炎、 降血脂、 抗血小板聚集等等， 其中 与癌症的关系是研究最为广泛、 也是最复杂的有意义的重要课题。 0。
9、006 绿茶中的主要成分为茶多酚， 占茶叶干重的 30% 左右， 茶多酚中大部分为儿茶素， 表没食子儿茶素没食子酸酯 ( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 含量最高， 占 儿茶素的 80% 左右。EGCG 分子式为 C22H18O11， 分子量为 458.4。它是一种高效广谱无毒副作 用的生物抗氧化剂， 俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病 和衰老的体内自由基和过氧化物， 提高人体免疫力， 延缓衰老， 具有优异的抗病毒、 降血脂、 保鲜、 美容等效能， 在医药、 保健、 食品、 日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不 是细胞。
10、毒类药物， 在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显。绿茶提取物及其主要成分不 会也不能取代现有的抗肿瘤药物， 其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂， 有望增 强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性， 降低抗肿瘤药物的毒性。 说 明 书 CN 102552273 A 3 2/5 页 4 0007 到目前为止， 尚未见有关 EGCG 与 Methotrexate 联合使用的报道。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物， 尤其涉及由表没食子儿茶 素没食子酸酯 （EGCG） 与 Methotrexate（甲氨蝶呤） 制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。 0009 本发明实验证实， 表。
11、没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 与 Methotrexate （甲氨蝶呤） 制成的组合物， 或在给予 Methotrexate（甲氨蝶呤） 时联合使用表没食子儿茶素没食子酸 酯可显著提高 Methotrexate 抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。 0010 本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物， 包括活性成分和药剂学上必要 的辅料， 其特征在于， 所述的活性成分是以下物质 ： 1）表没食子儿茶素没食子酸酯， 2） Methotrexate ； 所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和 Methotrexate 的摩尔比为 800 ： 3-1.5 ： 1。 0011 本发明中， 所述的表没食子儿茶素没。
12、食子酸酯其分子式为 C22H18O11， 分子量为 458.4， 可以通过市场销售途径获得。例如， 本发明的 EGCG 购自 Sigma 公司， 货号 50299， 英 文全称 ： ()-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7 -triol 3-gallate, ( )-cis-3,3 ,4 ,5,5 ,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG ； CAS 号 ： 989-51-5。MDL 号 ： MFCD00075940。 0012 本 发 明 中， 所 述 的 Me。
13、thotrexate 通 用 名 ： 甲 氨 蝶 呤 ； Methotrexate 是 DNA、 RNA 合 成 抑 制 剂， 源 于 Sigma 公 司， 货 号 M9299 ， 又 称 为 : 4-Amino-10-methylfolic acid hydrate, L-4-Amino-N10-methylpteroylglutamic acid hydrate, L-Amethopterin hydrate, Antifolan hydrate, MTX hydrate, Methotrexate hydrate, Methylaminopterin hydrate。相关信息和结构式如下。
14、 ： CAS Number: 133073-73-1 Empirical Formula (Hill Notation): C20H22N8O5 xH2O Molecular Weight: 454.44 (anhydrous basis) MDL number: MFCD00150847 。 0013 本发明中， 将制成的含有 EGCG 和 Methotrexate 的组合物用于肿瘤细胞 （例如， 肝 癌细胞株 SK-Hep1） ， 结果显示， 与仅使用 Methotrexate 相比， 抑制肿瘤细胞增殖的效果明 显增强。 所述组合物的使用能明显降低Methotrexate的单独使用量， 其。
15、降低效果随着EGCG 用量的增加而更加明显。 0014 本发明中， 将 EGCG 和 Methotrexate 的组合物用于裸鼠移植瘤模型， 结果显示， 与 仅使用 Methotrexate 相比， 本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强， 并且 效果优于雷帕霉素与 Methotrexate 组合物。同时， 检测以体重变化为指标的给药后药物的 毒性效应显示， EGCG 和 Methotrexate 联合使用时对裸鼠体重没有明显影响， 并且所述的组 合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性， 而雷帕霉素和 Methotrexate 联合使用则对裸鼠 说 明 书 CN 102552273 A 。
16、4 3/5 页 5 的肝脏和肾脏有较高毒性。 0015 本发明中， 采用所述的组合物与单独使用 EGCG 或者 Methotrexate 进行了比较试 验， 结果显示， 所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用， 而且增效作用 具有EGCG和Methotrexate浓度梯度效应。 本发明的实施例中列举了EGCG和Methotrexate 含量摩尔比分别为 80:3， 8:1， 60:1， 20 ： 1， 160 ： 1， 800 ： 3， 80 ： 1， 1.5 ： 1， 等等， 实验表明， 在 两者含量为 200 ： 1-8:1 的范围都是有效果的。 0016 本发明中还提供了一。
17、种杀伤肿瘤细胞的方法， 其包括步骤 ： 在肿瘤细胞中加入 EGCG 和 Methotrexate 组合物， EGCG 和 Methotrexate 的摩尔比为 800 ： 3-1.5:1。 0017 所述的肿瘤细胞可以是 SK-Hep1 或者 HepG2 细胞。 0018 本发明所使用的细胞均购自 ATCC。 0019 本发明的组合物， 当在治疗上进行施用 （给药） 时， 可提供不同的效果。通常， 可将 这些物质配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH 通常约为 7-8， 尽管 pH 值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物 可以通过常规途。
18、径进行给药， 其中包括 （但并不限于 ) ： 肌内、 腹膜内、 皮下、 皮内、 或局部给 药。 0020 以本发明的 EGCG 与 Methotrexate 的组合物为例， 可以将其与合适的药学上可接 受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形 剂。这类载体包括 （但并不限于） ： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。药物制 剂应与给药方式相匹配。本发明的 EGCG 和 Methotrexate 可以被制成针剂形式， 例如用生 理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和胶囊之类的 药物组合物， 可通过常规方法。
19、进行制备。药物组合物如针剂、 溶液、 片剂和胶囊宜在无菌条 件下制造。此外， 本发明的 EGCG 与 Methotrexate 的组合物还可与其他治疗剂一起使用。 0021 本发明中， EGCG 与 Methotrexate 的组合物可以是针剂或者片剂。 0022 当本发明的 EGCG 与 Methotrexate 的组合物被用作药物时， 可将治疗有效剂量的 该药物施用于哺乳动物， 其中该治疗有效剂量中通常至少约 50 毫克 EGCG/ 千克体重。 0023 甲氨蝶呤的常规用药剂量如下 ： 1 治疗白血病 通常成人口服 2.5mg 10mg/ 日， 总量约 50mg 150mg。儿童 1.5m。
20、g 5mg/ 日。 0024 2 治疗绒毛膜上皮癌等 10mg 20mg/ 日， 肌注或口服， 亦可作静滴， 连用 5 10 日， 疗程量为 80mg 100mg。 0025 3 治疗头颈部癌或妇科癌 10mg 20mg/ 次， 动脉插管给药， 每日或隔日 1 次， 7 10 次为 1 疗程。 0026 4 治疗一般实体瘤 肝、 肾功能正常者， 30mg50mg/次， 静注， 510日1次， 5 10 次为 1 疗程 ； 也可每次 0.4mg/kg， 静注， 每周 2 次。 0027 5 解救疗法 先静注长春新碱1mg2mg/次， 半小时后， 用甲氨蝶呤1g5g/m 2， 静滴 6 小时。4 。
21、6 小时后开始肌注甲酰四氢叶酸钙， 6mg 12mg( 15mg)/ 次， 以后每 6 小时肌注 1 次， 用到 72 小时。依情况可每月用药 1 次。 0028 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能 范围之内的。 说 明 书 CN 102552273 A 5 4/5 页 6 0029 本发明的优越性是 ： 提供了一种新的含 EGCG 和 Methotrexate 的组合物。该组 合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强 Methotrexate 的抗肿瘤效果， 同时相对减少了 Methotrexate的用量及药物成本。 由于本发明组合物中的EGCG是天然。
22、的茶叶提取物， 而茶 叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。 不仅资源丰富， 价格低廉， 经过了千年以上 的饮用， 几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时， 降低了肿瘤患者的治疗成本。 具体实施方式 0030 实施例 1 EGCG 与 Methotrexate 的协同效果 在 SK-hep-1 细胞中， EGCG 与 Methotrexate 的协同效果比较显著。本实施例进一步验 证了EGCG与Methotrexate的联用效果， 结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1， 两种 药物有协同作用。结果表明 EGCG 与 Methotrexate 联合使用可以提高 Methotrexat。
23、e 的抗 肿瘤效果。 0031 表 1 实施例 2 EGCG 与 Methotrexate 有协同效应 在十种肿瘤细胞系中固定 EGCG 的浓度， 与 Methotrexate 联合用药。采用下述金氏公 式 Q 值来评价联用效果 ： Q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb) 其中， Ea+b 为合并用药抑制率， Ea 和 Eb 分别为 A 药和 B 药的抑制率 ； 分子代表实际测量的两药合并抑制率， 分母是期待合并抑制率。 0032 Q=0.85-1.15 范围表示单纯相加， Q=1.15-2 范围表示有增强， Q2 表示明显增强， Q0.55-0.85 表示有拮抗效应， Q0.55 表示明显拮。
24、抗。 0033 结果表明， EGCG 与 Methotrexate 在特定的细胞株中均有一定的协同效果， 说明 EGCG 在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。 0034 表 2 EGCG 与 Methotrexate 的联合用药效果 Q 值 Methotrexate SMMC7721 0.965077 HepG21.172513 QGY1.22044 SK-Hep11.243271 YY11.107715 Huh70.906952 Hep3B1.054881 L020.6813 Focus1.007199 PLC1.086984 为了验证以上实验结果， 进一步使用等比联用的方法。
25、， 用 CI（combination index） 值 说 明 书 CN 102552273 A 6 5/5 页 7 来评价联用效果。CI=D1/DX1+D2/DX2+D1D2/DX1DX2， 其中 D1、 D2为两药合用时产生 X 效应时两 药各自所需浓度， DX1、 DX2为两药单独使用时产生 X 效应时两药各自浓度。= 0 为两种相 互排斥性药物， = 1 为两种相互非排斥性药物。CI 1 为拮抗作用。在 SK-Hep1 细胞中， Methotrexate 与 EGCG 等比联用， 结果显示， 在一 定的浓度范围内 CI 值均小于 1。说明 Q 值和 CI 值评价效果一致， 在 SK-H。
26、ep1 细胞中 EGCG 与 Methotrexate 联用时均具有协同效应。 0035 实施例 3 EGCG 能够增效 Methotrexate， 降低 Methotrexate 的用量 在SK-Hep1细胞中将0.25、 0.5、 0.75 M的Methotrexate分别与10、 20、 30、 40、 50 M 的EGCG联用， 0.25、 0.5、 0.75 M的Methotrexate与不同浓度的EGCG联用后可以达到甚 至超过 1 M Methotrexate 单独使用的效果。根据软件统计分析， 与 EGCG 联合使用达到 半数抑制效果时所需要的 Methotrexate 量随着。
27、 EGCG 量的增加而减少， 并且具有浓度梯度 效应。以上实验结果说明 EGCG 与 Methotrexate 联合使用， 可以有效的增强 Methotrexate 的抗肿瘤效果并且降低其用量。 0036 实施例 4 EGCG 对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用 BALB/C-nu/nu 裸鼠在无特定病原体 （SPF） 条件下饲养 4 周 -6 周。将 SK-Hep1 细胞取 3106注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后， 对照组每天腹腔注射生理盐水 ； 羧甲基纤维 素钠组每天口服含 0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水 ； 索拉非尼组剂量为 60 mg/kg 体重 / 天， 口服 ； EGCG。
28、 组剂量为 25 mg/kg 体重 / 天或 50 mg/kg 体重 / 天， 腹腔注射。SK-Hep1 细 胞裸鼠模型共给药 13 天 ； QGY-7701 细胞裸鼠模型共给药 15 天。 0037 1， EGCG 对裸鼠体重的影响 裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测 SK-Hep1 细胞的异种移植瘤模型中 裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示， 25 mg/kg EGCG 和 50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响， 说明毒副作用较低 ； 阳性对照索拉非尼对裸鼠体重 也基本无影响。 0038 2， EGCG 对裸鼠肝脏、 肾脏和心脏的毒性 通过检测谷丙转氨酶 （ALT） 和谷草转氨酶 （AST） 含量， 尿素氮 （BUN） 肌酐 （CREA） 和胆 固醇 （CHO1） 含量， 观测肝脏损伤， 肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示， 在 SK-Hep1 移 植瘤模型中， 索拉非尼对裸鼠肝脏、 肾脏和心脏的损伤较大 ； 而 25 mg/kg EGCG 和 50 mg/kg EGCG 对裸鼠肝脏、 肾脏和心脏则基本没有毒性。 0039 表 3 EGCG 对裸鼠肝脏、 肾脏和心脏毒性的影响 说 明 书 CN 102552273 A 7 。