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1、(10)申请公布号 CN 102552876 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102552876 A *CN102552876A* (21)申请号 201210036819.4 (22)申请日 2012.02.17 A61K 38/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院军 事兽医研究所 地址 130122 吉林省长春市净月经济开发区 柳莺西路 666 号 (72)发明人 刘文森 许娜 侯峰 徐静 钱军 万家余 刘林娜 孙玉成 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利。
2、代理有 限责任公司 22100 代理人 魏征骥 (54) 发明名称 蓖麻毒素 B 链蛋白的免疫调节新用途 (57) 摘要 本发明涉及蓖麻毒素 B 链蛋白在免疫调节方 面的新用途， 属于医药领域范围。 蓖麻毒素B链蛋 白在制备免疫调节剂中的应用， 蓖麻毒素 B 链蛋 白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。蓖麻毒素 B 链蛋白可以活化小鼠腹腔巨噬细胞， 促进小鼠脾 T、 B淋巴细胞增殖， 增强NK细胞活性， 具有免疫调 节作用， 可作为免疫调节剂， 并可用于肿瘤的辅助 治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。
3、申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。 2. 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102552876 A 2 1/3 页 3 蓖麻毒素 B 链蛋白的免疫调节新用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 具体涉及蓖麻毒素 B 链蛋白在免疫调节方面的新用途。 背景技术 0002 蓖麻毒素(ricin toxin, RT)源自蓖麻籽的糖蛋白， 分子量64kDa。 蓖麻毒素 的全毒素由 A、 B 两条多肽链通过一个二硫键连接在一起。RTA 是一种核糖体灭活蛋白， 在 哺乳。
4、动物细胞内可抑制蛋白质合成 ； RTB 链无毒， 具有凝集素活性， 可与细胞表面的半乳糖 或甘露糖的受体结合， 协助A链进入细胞内发挥生物学功能。 RTB是一个两叶形或哑铃形结 构的分子， 由不同的两个球形区域构成相同的折叠拓扑结构， 每一个区域又包括三个亚区 (， ， )， 只有 1 和 2 有明显的半乳糖结合活性。当两个球形区域都突变时， RTB 将 失去凝集素活性。目前普遍认为 RTB 链没有免疫活性。RTB 基因与病毒基因连接后融合表 达， 得到的融合蛋白质具有病毒的抗原性， RTB 蛋白能与细胞上含半乳糖的糖蛋白或糖脂 结合， 具有良好的免疫效果， 因此 RTB 常用作蛋白质表达载体。
5、。蓖麻毒素 B 链蛋白通过基因 克隆方法获得， 见 蓖麻毒素 B 链的克隆表达与鉴定 ， 食品与生物技术学报， 2009， 28（1） ， 作者刘文森等。 发明内容 0003 本发明提供一种蓖麻毒素 B 链蛋白的免疫调节新用途。 0004 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。 0005 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。 0006 本发明研究发现蓖麻毒素 B 链蛋白可以促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌 NO， 活化巨噬 细胞杀伤肿瘤细胞， 体内体外实验证实其单独作用可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖， 还可 协同 ConA 和 LPS 促进小鼠脾 T、 B 淋巴细胞的增殖， 增强 。
6、NK 细胞活性， 具有免疫调节作用。 附图说明 0007 图 1 是蓖麻毒素 B 链蛋白对腹腔巨噬细胞 NO 分泌的影响图 ； 图 2 是蓖麻毒素 B 链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响图 ； 图 3 是蓖麻毒素 B 链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图 ； 图 4 是蓖麻毒素 B 链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图 ； 图 5 是蓖麻毒素 B 链蛋白体内对小鼠 NK 细胞活性的影响图。 具体实施方式 0008 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。 0009 蓖麻毒素 B 链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。 0010 蓖麻毒素 B 链蛋白以下称 RTB 链蛋白。 001。
7、1 实施例 1 ： RTB 链蛋白对腹腔巨噬细胞 NO 分泌的影响 说 明 书 CN 102552876 A 3 2/3 页 4 试剂与药品 ： RTB 链蛋白， 自制， 溶于生理盐水中， 稀释成不同浓度 （下同） ， NO 检测试 剂盒购自碧云天生物技术研究所。 0012 动物 ： Balb/c 小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。 0013 方法 ： 采用 NO 检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞 NO 的分泌。处死小鼠， 腹腔注 射5PBS， 轻揉小鼠腹部， 剪开腹部， 重复冲洗腹腔2或3次 ； 取制备好的巨噬细胞， 调整细 胞数为 1107个 /ml ； 将巨噬细胞接种到 96 孔培养。
8、板， 加入不同浓度 RTB 链蛋白 100l/ 孔， 24h 后收取上清， 采用 NO 检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞 NO 分泌。 0014 结果 ： 如图 1 所示， RTB 链蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞 NO 分泌具有时间和剂量依赖 性， 10g/ml 和 100g/ml 剂量浓度均可刺激 NO 分泌。LPS 为阳性对照。100g/ml 与阳 性对照组比较差异显著 (P0.05)。 0015 实施例 2 ： RTB 链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响 试剂与药品 ： RTB 链蛋白， 自制， RPMI-1640 培养基购自 GIBCO 公司。 0016 动物 ： Balb/c 小鼠购自卫生部长。
9、春生物制品所实验动物室。 0017 方法 ： MTT 法检测小鼠腹腔巨噬细胞毒作用。处死小鼠， 腹腔注射 5 l PBS， 轻 揉小鼠腹部， 剪开腹部， 重复冲洗腹腔2或3次 ； 取制备好的巨噬细胞， 调整细胞数为1107 个 /m ； 每孔 0.1ml 将巨噬细胞接种 96 孔培养板， 分别加入不同浓度 RTB 链蛋白置 37， 5 CO2 培养箱中培养 48h， 加入 B16 靶细胞 （效靶比为 10 ： 1） 作用 48h ； 终止培养前， 每孔加入 10l MTT， 继续孵育4h， 每孔加入100l DMSO， 振摇10min， 于570nm波长处测定吸光度值 (A 值 )。 0018。
10、 结果 ： 如图 2 所示， 三个剂量浓度均可增强巨噬细胞肿瘤杀伤活性。 0019 实施例 3 ： RTB 链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 试剂与药品 ： 脂多糖及 ConA 购自 Sigma 公司， MTT 购自 Sigma 公司。 0020 动物 ： Balb/c 小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。 0021 方法 ： 3.1 MTT 法检测 RTB 链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴 细胞悬液， 调整细胞浓度为 1107个 /ml， 加入 96 孔细胞板每孔 100l， 再加入不同浓度 RTB链蛋白各100l， 培养44h， 收取上清备用， 每孔加入。
11、10l MTT， 继续孵育4h， 每孔加入 100l DMSO， 振摇 10min， 于 540nm 波长处测定吸光度值 (A 值 )。计算增值指数 SI， (SI= 样品孔吸光值 / 阴性对照孔吸光值 )。 0022 3.2 MTT 法检测 RTB 链蛋白对 LPS 和 ConA 活化 T、 B 淋巴细胞细胞增殖影响。无菌 制备小鼠脾淋巴细胞悬液， 调整细胞浓度为1107个/ml， 加入96孔细胞板每孔100l， 再 加入不同浓度RTB链蛋白及Con A 100l， 使Con A终浓度为2.5g/ml， 培养44h， 收取上 清备用， 每孔加入 10l MTT， 继续孵育 4h， 每孔加入 。
12、100l DMSO， 振摇 10min， 于 540nm 波 长处测定吸光度值 (A 值 )。计算增值指数 SI (SI= 样品孔吸光值 / 阴性对照孔吸光值 )。 0023 结果 ： 如图 3 所示， RTB 链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显 作用， 与 ConA 和 LPS 协同作用时， RTB 链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激 T、 B 淋巴细胞 的增殖， 并且随着剂量的增加， 其刺激增殖的能力也明显增加， 与阳性对照组相比差异显著 (P0.01)。 0024 实施例 4 ： RTB 链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 说 明 书 CN 102552876 A 4 。
13、3/3 页 5 试剂与药品 ： 脂多糖及 ConA 购自 Sigma 公司， MTT 购自 Sigma 公司 ； 动物 ： Balb/c 小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。 0025 方法 ： 4.1 RTB 链蛋白免疫 Balb/c 小鼠。将 Balb/c 小鼠随机分成 5 组， 分为生理盐水组， 实 验组 （40mg/kg、 20mg/kg、 10mg/kg） ， 弗氏佐剂阳性对照组。分别于 0、 7 天免疫 2 次， 第二次 免疫后 3 天处死小鼠。 0026 4.2 MTT 法检测 RTB 链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾 淋巴细胞悬液， 调整细胞浓度为110。
14、7个/ml， 加入96孔细胞板每孔100l， 再加入不同浓 度RTB链蛋白各100l， 培养44h， 收取上清备用， 每孔加入10l MTT， 继续孵育4h， 每孔加 入 100l DMSO， 振摇 10min， 于 540nm 波长处测定吸光度值 (A 值 )。计算增值指数 SI(SI= 样品孔吸光值 / 阴性对照孔吸光值 ) 4.3 MTT 法检测 RTB 链蛋白对 LPS 和 ConA 活化 T、 B 淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠 脾淋巴细胞悬液， 调整细胞浓度为1107个/ml， 加入96孔细胞板每孔100l， 再加入不同 浓度 RTB 链蛋白及 Con A 100l， 使 Con 。
15、A 终浓度为 2.5g/ml， 培养 44h， 收取上清备用， 每孔加入 10l MTT， 继续孵育 4h， 每孔加入 100l DMSO， 振摇 10min， 于 540nm 波长处测 定吸光度值 (A 值 )。计算增值指数 SI (SI= 样品孔吸光值 / 阴性对照孔吸光值 )。 0027 结果 ： 如图 4 所示， RTB 链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显 作用， 与 ConA 和 LPS 协同作用时， RTB 链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激 T、 B 淋巴细胞 的增殖， 并且随着剂量的增加， 其刺激增殖的能力也明显增加， 与阳性对照组相比差异显著 (P0.01)。 0。
16、028 实施例 5 ： RTB 链蛋白体内对小鼠 NK 细胞活性的影响 试剂与药品 ： MTT 购自 Sigma 公司 ； 动物 ： Balb/c 小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。 0029 方法 ： 5.1 RTB 链蛋白免疫 Balb/c 小鼠。将 Balb/c 小鼠随机分成 4 组， 分为生理盐水组， 实 验组 （40mg/kg、 20mg/kg、 10mg/kg） 。分别于 0、 7 天免疫 2 次， 第二次免疫后 3 天处死小鼠。 0030 5.2 MTT 法检测 RTB 链蛋白对 NK 细胞活性影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液， 调整细胞浓度为 1107个 /ml， 加入 。
17、96 孔细胞板每孔 100l， 加入 YAK-1 靶细胞， 设 10:1 效靶比， 培养18h， 每孔加入10l MTT， 继续孵育4h， 每孔加入100l DMSO， 振摇10min， 于 540nm 波长处测定吸光度值 (A 值 )。 0031 结果 ： 如图 5 所示， 10mg/kg 和 20mg/kg 剂量浓度均可提高 NK 细胞活性， 与阴性对 照组相比差异显著 (P0.05) 说 明 书 CN 102552876 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102552876 A 6 2/2 页 7 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102552876 A 7 。