技术领域
本发明属于糖皮质激素性骨质疏松症的防治技术领域，涉及川芎嗪防治糖皮质激素性骨质疏松症的应用。
背景技术
糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是最常见的继发性骨质疏松症。糖皮质激素在临床上被广泛应用于包括免疫性及炎性等各种专科疾病，然而其导致的副作用不容忽视。长期应用糖皮质激素使患者骨量丢失、骨组织结构改变和生物力学性能减退，引起糖皮质激素性骨质疏松，极易发生骨折，严重威胁中老年人的身心健康。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)在维持骨组织动态平衡中有关键作用，在骨质疏松症的发病过程中扮演重要角色。高浓度糖皮质激素可以抑制BMSCs成骨分化，造成BMSCs和成骨细胞凋亡，延长破骨细胞生存时间，导致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微结构改变和骨密度下降。
近年来，研究发现自噬(autophagy)是真核细胞中广泛存在的一种降解性代谢生理过程。自噬利用溶酶体选择性地清除、降解自身受损、衰老或过剩的生物大分子和细胞器，释放出游离小分子供细胞回收利用，对于细胞在恶劣的微环境下维持自我稳态和生存必不可少，在许多疾病的病理过程中起重要作用。
川芎是一种具有高度生物活性的药用植物，广泛应用于传统中药中。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是其主要活性成分，川芎的大部分功效是通过川芎嗪发挥的。川芎嗪具有多项生理功能：扩血管、抗氧化、改善微循环和抗凋亡等。
发明内容
本发明的目的在于提供川芎嗪防治糖皮质激素性骨质疏松症的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
川芎嗪在制备用于防治糖皮质激素性骨质疏松症的药物中的应用。
含川芎嗪的植物提取物在制备用于防治糖皮质激素性骨质疏松症的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于抗骨髓间充质干细胞凋亡的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于调控骨髓间充质干细胞自噬的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于抗骨髓间充质干细胞分化抑制的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于提高骨髓间充质干细胞中ALP活性的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于提高骨髓间充质干细胞中促成骨分化基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx表达水平的药物中的应用。
川芎嗪在制备用于提高糖皮质激素性骨质疏松症患者骨量的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
川芎嗪对骨髓间充质干细胞(BMSCs)无毒性作用；对糖皮质激素引起的BMSCs凋亡具有保护作用；可以增强糖皮质激素作用下BMSCs自噬活性；对BMSCs成骨分化抑制具有保护作用。在糖皮质激素性骨质疏松大鼠模型中，川芎嗪可以减少体内BMSCs的凋亡并增强自噬活性，改善股骨远端和腰椎的松质骨骨微结构，提高股骨远端的骨形成率。
BMSCs是成骨细胞的来源，鉴于川芎嗪对BMSCs存活以及凋亡的作用，其对成骨细胞形成具有保护作用，促进骨形成，最终起到防治糖皮质激素性骨质疏松症的作用。糖皮质激素腹腔注射大鼠模型为常用的糖皮质激素性骨质疏松模型，通过连续腹腔注射给与不同剂量川芎嗪，明显减少了体内BMSCs的凋亡并增强了自噬，对松质骨骨微结构有保护作用，表明其能够发挥预防及治疗糖皮质激素性骨质疏松的作用。
川芎嗪为纯天然物质，用药较安全，毒副作用小。
因此，川芎嗪可应用于糖皮质激素性骨质疏松症的防治，尤其是应用在防治糖皮质激素性骨质疏松症药物的制备中。
附图说明
图1-1为不同浓度川芎嗪对细胞增殖(Cell viability)作用的影响。
图1-2为川芎嗪对糖皮质激素造成的细胞凋亡(Apoptosis)的保护作用。
图2为川芎嗪增强糖皮质激素作用下细胞自噬水平的检测结果；第二行图(左下角比例尺为0.5μm)为第一行图(左下角比例尺为2μm)中局部(矩形框部分)放大。
图3-1为川芎嗪在糖皮质激素作用后，对细胞碱性磷酸酶活性(ALP activity)的作用。
图3-2为川芎嗪在糖皮质激素作用后，对细胞基质钙盐沉积的作用；a.成骨诱导液对照组，b.高浓度地塞米松组，c.川芎嗪处理组(50μM)，d.川芎嗪处理组(100μM)，e.川芎嗪处理组(200μM)。
图3-3为川芎嗪对4种细胞成骨分化基因表达水平的影响。
图4-1为川芎嗪减少GIOP大鼠体内BMSCs凋亡的作用。
图4-2为川芎嗪增强GIOP大鼠体内BMSCs自噬的作用。
图5-1为川芎嗪改善GIOP大鼠股骨远端松质骨骨微结构的Micro-CT结果；第一行为冠状面，第二行为横截面。
图5-2为川芎嗪提高GIOP大鼠股骨远端的骨形成率(Bone formation rate)的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
原代骨髓间充质干细胞(BMSCs)可以向成骨细胞进行分化，是研究成骨作用和骨量平衡较常用的细胞模型。10-6M地塞米松(dexamethasone,Dex)处理可以较好地模拟体外高浓度糖皮质激素损伤模型。出于观察川芎嗪对成骨作用的影响，及其抗糖皮质激素损伤的作用，所以选择BMSCs作为细胞模型，地塞米松处理为体外糖皮质激素模型。泼尼松龙腹腔注射大鼠模型作为动物模型，是常用的模拟糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)模型。
1、川芎嗪对糖皮质激素导致BMSCs凋亡的保护作用
1.1川芎嗪对细胞的毒性作用
将BMSCs以每孔2×103个接种到96孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基(培养基成分为：α-MEM培养液+10％胎牛血清+1％青链霉素)，加含浓度0μM(空白对照组，Control)、10μM、100μM或1mM川芎嗪的无血清培养基至孔板中，分别培养24h和72h，观察川芎嗪对细胞增殖作用的影响。在观察点，利用CCK-8试剂对细胞活性进行检测。
结果如图1-1所示，横坐标为不同浓度的川芎嗪作用时间，纵坐标为细胞活力值，以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值进行比较的百分数来表述。由图可见，不同浓度的川芎嗪在观察时间内，对细胞的增殖并无明显影响。
1.2川芎嗪对糖皮质激素导致BMSCs凋亡的保护作用
分组情况：空白对照组(不加地塞米松和川芎嗪，Control)；单纯地塞米松处理组(Dex组)；50μM川芎嗪+10-6M地塞米松(Dex+TMP 50μM组)；100μM川芎嗪+10-6M地塞米松(Dex+TMP 100μM组)；200μM川芎嗪+10-6M地塞米松(Dex+TMP 200μM组)。
将BMSCs以每孔2.5×105个接种到6孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基，加入10-6M地塞米松，培养24h，再加入含浓度0、50、100、200μM川芎嗪的无血清培养基至孔板中，培养48h，收集后以流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。
结果如图1-2所示，第一、四象限(B2、B4)为Annexin阳性细胞，可视为凋亡细胞。由图可见，单纯地塞米松作用后，细胞凋亡增加，经不同浓度川芎嗪作用后细胞凋亡减少，同单纯地塞米松处理组相比，具有统计学差异。统计图中的*号表示：同空白对照组相比，**为P＜0.01；图中的#号表示：同单纯地塞米松处理组相比，#为P<0.05，##为P<0.01。这表明用川芎嗪处理后能够保护高浓度糖皮质激素导致BMSCs的凋亡。
综上所述，高浓度糖皮质激素处理BMSCs后，用不同浓度川芎嗪对BMSCs细胞进行干预，通过CCK-8细胞活性检测，结果表明单纯糖皮质激素作用可造成细胞凋亡。而50、100、200μM川芎嗪处理对糖皮质激素这种损伤具有保护作用。因此，川芎嗪对糖皮质激素导致的细胞凋亡具有保护作用。
2、川芎嗪增强糖皮质激素作用下细胞自噬水平
分组情况：空白对照组(不加地塞米松和川芎嗪，Control)；单纯10-6M地塞米松处理组(Dex组)；50μM川芎嗪+10-6M地塞米松处理组(Dex+TMP 50μM组)。
将BMSCs以每孔2.5×105个接种到6孔板上，待细胞长满后，弃掉培养基，加入10-6M地塞米松，培养24h，再加入含浓度0、50μM川芎嗪的无血清培养基至孔板中，培养48h，刮下细胞收集。固定液固定后脱水，包埋，超薄切片机超薄切片，在透射电镜下观察自噬小体。
结果如图2所示，黑色箭头所指为自噬小体，即自噬发生的形态学标志物。单纯10-6M地塞米松处理使细胞中产生自噬小体，而加入川芎嗪处理后，自噬小体的数量、体积均显著增加。此结果表明川芎嗪能够让受到糖皮质激素应激产生的自噬水平明显增加，从而增强BMSCs抵御外界刺激及生存能力。因此，川芎嗪具有调控糖皮质激素作用下BMSCs自噬水平的作用。
3、川芎嗪对高浓度糖皮质激素造成BMSCs成骨分化抑制的保护作用
分组情况：单纯成骨诱导液对照组；10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组(高浓度地塞米松组)；50μM川芎嗪+10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组；100μM川芎嗪+10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组；200μM川芎嗪+10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组。
将BMSCs以每孔2.5×105个接种到6孔板上，长满后加入成骨诱导液培养。诱导后第14天，加入10-6M地塞米松处理24h，再分别给予0、50、100、200μM川芎嗪处理48h。
3.1根据碱性磷酸酶定量试剂盒进行碱性磷酸酶(ALP)定量，充分裂解细胞后，提取蛋白。测定蛋白浓度，然后按照试剂盒使用说明，进行ALP定量检测。
结果如图3-1所示，横坐标为分组情况，纵坐标为ALP定量值，以各组的吸光度OD值同单纯成骨诱导液对照组的OD值进行比较的百分数来表述。高浓度地塞米松作用后，细胞ALP活性表达同单纯诱导液对照组相比显著下降，而各浓度川芎嗪作用后，ALP活性表达升高，同高浓度地塞米松处理组相比具有统计学差异。图中的*号表示：同单纯成骨诱导液对照组相比，**为P＜0.01；图中的#号表示：同10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组相比，#为P<0.05，##为P<0.01。ALP为成骨细胞分化中期的关键表达蛋白，为检测成骨细胞分化的特异性指标，高浓度糖皮质激素导致ALP活性降低，对成骨分化有抑制作用，但经川芎嗪作用后，ALP表达增加，改善了高浓度糖皮质激素对BMSCs成骨分化的抑制作用。
3.2钙化结节染色：用PBS缓冲液冲洗培养细胞，多聚甲醛固定后，1％茜素红染色30min，用水冲洗5次，倒置显微镜下观察钙结节沉积，分析并拍照。
结果如图3-2所示，高浓度地塞米松作用后钙化结节形成较少，但是川芎嗪干预处理后，结节面积明显增加。钙结节形成为成骨分化的矿化阶段，高浓度糖皮质激素可以抑制成骨细胞分化，而川芎嗪可以改善糖皮质激素对BMSCs分化造成的抑制。
3.3成骨基因的RT-PCR检测：用Trizol裂解细胞，提取细胞内的mRNA，根据实时定量RT-PCR的程序，对目的基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx进行定量检测。
结果如图3-3所示，横坐标为分组处理情况，纵坐标为mRNA的相对表达水平(Relative fold expression)，以各组相对于单纯诱导液对照组的百分率来表述。由图可见，高浓度地塞米松作用后，细胞成骨分化基因Alp、Col1a1、Ocn及Osx表达水平下降，而各浓度川芎嗪处理后，成骨基因表达显著增加。图中的*号表示：同单纯成骨诱导液对照组相比，*为P＜0.05，**为P＜0.01；图中的#号表示：同10-6M地塞米松+成骨诱导液处理组相比，#为P<0.05，##为P<0.01。Alp、Col1a1、Ocn及Osx基因分别为成骨细胞分化中期和后期的关键基因，决定着细胞的分化水平。高浓度糖皮质激素抑制成骨分化基因的表达，而川芎嗪作用后，成骨分化基因表达上调，说明川芎嗪可以改善糖皮质激素导致的BMSCs成骨分化抑制。
综合以上表明：川芎嗪(TMP)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)无毒性作用，不影响细胞增殖；对高浓度糖皮质激素造成的BMSCs的凋亡具有保护作用；对糖皮质激素作用下BMSCs自噬水平有增强作用；对高浓度糖皮质激素造成的BMSCs成骨分化抑制具有保护作用。川芎嗪在体外对高浓度糖皮质激素造成的BMSCs的一系列损伤能够发挥保护作用，从而达到预防及治疗糖皮质激素性骨质疏松症的效果。
4、川芎嗪对糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)动物模型中BMSCs凋亡与自噬的影响
GIOP大鼠模型的建立：
40只4月大Sprague-Dawley雌性大鼠，体重为223±18.5g。本实验中四组大鼠的初始体重无统计学差异。将大鼠置于实验室条件下1周(即通气良好的20℃恒温环境中，每12小时光照与黑暗交替，水粮足量，自由取用)。适应1周后，每天腹腔注射等体积的蒸馏水(无处理对照组，Control，n＝10)或5mg/kg泼尼松龙(模型组，n＝30)。首次注射后一周开始，将30只模型组大鼠随机分成3个实验组，每天分别增加注射等体积的芝麻油(安慰剂对照，即GIOP处理组，n＝10)，5mg/kg(n＝10)或20mg/kg(n＝10)的川芎嗪溶液。共注射12周。
分组情况：无处理对照组；GIOP处理组(GIOP组)；GIOP+5mg/kg川芎嗪处理组(GIOP+TMP(5)组)；GIOP+20mg/kg川芎嗪处理组(GIOP+TMP(20)组)。
4.1注射给药完成后，分别从各组大鼠中取原代BMSCs培养，取第一代细胞，收集后以流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。
结果如图4-1所示，第一、四象限为Annexin阳性细胞，可视为凋亡细胞。由图可见，GIOP处理组中BMSCs凋亡增加，而两种浓度的川芎嗪给药组均使细胞凋亡明显减少，与GIOP处理组相比具有统计学差异。统计图中的*号表示：与无处理对照组相比，**为P＜0.01；图中的#号表示：与GIOP处理组相比，#为P<0.05，##为P<0.01。这表明川芎嗪能够减少GIOP大鼠体内BMSCs的凋亡。
4.2注射给药完成后，分别从各组大鼠中取原代BMSCs培养，取第一代细胞，收集后固定液固定，脱水，包埋，超薄切片机超薄切片，在透射电镜下观察自噬小体。
结果如图4-2所示，GIOP处理组中BMSCs自噬小体相比无处理对照组有所增加，而两种浓度的川芎嗪给药组相比GIOP处理组自噬小体显著增多。这表明川芎嗪增强了GIOP大鼠体内BMSCs的自噬水平。
综上所述，川芎嗪能够作用于GIOP大鼠体内的BMSCs，减少了GIOP状态下BMSCs的凋亡，能够上调自噬水平从而保护细胞。此结果印证了以上体外实验的结论。
5、川芎嗪对糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)动物模型骨量的影响
分组情况参照部分4：无处理对照组；GIOP处理组；GIOP+5mg/kg川芎嗪处理组；GIOP+20mg/kg川芎嗪处理组。
5.1动物模型给药完成后，提取每只大鼠的左侧股骨，清除粘连的肌肉组织，妥善固定。显微CT检测骨微结构：股骨远端的骨微结构通过探索轨迹SP预临床标本显微CT进行检测。分辨率为8mm，管电压为50kV，管电流为0.1mA。通过一个桌面显微CT处理软件进行重建和3D定量分析。所有标本的扫描环境和分析方法相同。股骨扫描区域限定为远端干垢端，并且向近端的初级松质近末端区域延伸2.0mm。在这些待扫描的区域中，松质骨与皮质骨的分界为内皮质骨面。选定的感兴趣区的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。进行扫描分析的操作者对标本的处理过程单盲。
结果如图5-1所示，相对于无处理对照组，泼尼松龙注射导致了大鼠松质骨骨微结构的损害，表现为骨矿物质密度、连接密度、骨小梁数量、骨小梁厚度及相对骨体积分数的下降；同时，股骨结构模型指数和骨小梁分离度明显提高。结果具有统计学差异。然而，两种剂量的川芎嗪给药明显逆转了糖皮质激素引起的骨微结构参数的变化趋势，起到保持股骨远端小梁骨骨量的作用。因此，川芎嗪能够对糖皮质激素性骨质疏松症发挥预防及治疗作用。
5.2钙黄绿素双标记法检测骨形成率(bone formation rate)：动物模型给药完成后，在大鼠处死前的第12天和第2天腹腔注射5mg/kg钙黄绿素进行荧光素标记。处死大鼠后取左侧股骨，依次进行固定、脱水、包埋和切片。在荧光显微镜下测定两次钙黄绿素标线间的距离。应用骨形态学测量系统软件计算得到骨形成率。
结果如图5-2所示，新生骨被标记上了钙黄绿素荧光。相对于无处理对照组，GIOP处理组的骨形成率明显降低。而两种剂量川芎嗪干预后，骨形成率明显升高。结果具有统计学差异。统计图中的*号表示：与无处理对照组相比，**为P＜0.01；图中的#号表示：与GIOP处理组相比，##为P<0.01。因此，川芎嗪能够通过提高骨形成率而起到保护GIOP大鼠松质骨骨微结构的作用。
总之，川芎嗪可应用于糖皮质激素性骨质疏松症的防治，尤其是在防治糖皮质激素性骨质疏松症药物的制备中应用。而川芎嗪是川芎中主要活性成分之一，那么含有川芎嗪的川芎提取物也具有相应的应用。