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1、(10)授权公告号 CN 101912617 B (45)授权公告日 2012.09.26 CN 101912617 B *CN101912617B* (21)申请号 201010240983.8 (22)申请日 2010.07.29 A61K 48/00(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 5/50(2006.01) A61P 9/12(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号 (72)发明人 肖。
2、瑞平 曹春梅 张岩 宋瑞生 (74)专利代理机构 北京三高永信知识产权代理 有限责任公司 11138 代理人 关文魁 (54) 发明名称 MG53基因在治疗胰岛素抵抗和型糖尿病及 其相关病症中的应用 (57) 摘要 本发明涉及 MG53 基因在治疗胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症中的应用。本发明确定 了 MG53 基因的表达与胰岛素抵抗特征之间的相 互关系 ： 在胰岛素抵抗的情况下， 其 MG53 的表达 明显上调 ； MG53 的过表达会导致胰岛素抵抗的发 生 ； MG53 缺陷显著抑制了高脂饮食诱导的各种病 症、 促进葡萄糖代谢并且增强胰岛素敏感性。因 此， MG53 基因可作为药。
3、物靶点， 用于筛选预防、 缓 解和/或治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病及其相关 病症的药物 ； MG53 基因也可作为基因治疗中的靶 基因， 用于设计和制备预防、 缓解和 / 或治疗胰岛 素抵抗和II型糖尿病及其相关病症中的药物和/ 或生物学试剂， 为胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其 相关病症的治疗提供了一条有效的新途径。 (51)Int.Cl. 审查员 王婷 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 9 页 1/1 页 2 1.MG53基因在制备预防、 缓解和/或治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病。
4、的相关病症的药物 中的应用 ； 所述的 II 型糖尿病的相关病症为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗、 高胰岛素血症、 高胆固醇血症以及高血压症。 2.MG53基因在筛选预防、 缓解和/或治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病的相关病症的药物 中的应用 ； 所述的 II 型糖尿病的相关病症为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗、 高胰岛素血症、 高胆固醇血症以及高血压症。 权 利 要 求 书 CN 101912617 B 2 1/9 页 3 MG53 基因在治疗胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症 中的应用 技术领域 0001 本发明涉及 MG53 基因在治疗胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症中的应用， 具体是在制。
5、备和 / 或筛选预防、 缓解和 / 或治疗胰岛素抵抗和 I I 型糖尿病及其相关病症 的药物中的应用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 由于近年来我国人民生活水平的提高， 饮食结构的调整和生活方式的改变， 糖尿 病患病率不断上升， 中国已经成为继印度之后的第二糖尿病大国(1)。 在糖尿病的患病群体 中， II 型糖尿病占据大多数 (95 )， 与全身肥胖和 / 或体脂分布异常 ( 腹型肥胖 ) 关系密 切。 0003 随着科学技术的发展， 人们已经认识到胰岛素抵抗是 II 型糖尿病的主要特征和 中心环节， 胰岛素抵抗是指机体不能利用胰岛素有效地激活胰岛素受体信号通路(2， 3)。 正 。
6、常情况下， 一旦胰岛素与胰岛素受体结合， 会催化受体的两聚体化和自身磷酸化， 使之充分 激活， 然后招募并磷酸化胰岛素受体底物 (IRSs)(4)， 进而导致细胞内广泛的下游信号通路 被激活 (5)。其中主要包括 PI3K-Akt 通路、 Ras-MAPK 通路和 Cbl/CAP-TC10 通路 (5)。这 些信号通路以协同的方式共同调控着细胞囊泡转运、 蛋白质合成、 酶的激活与失活以及基 因表达等生物过程， 从而最终对糖、 脂肪和蛋白质这三大营养物质的代谢进行控制 (5)。 0004 在 II 型糖尿病中， 由于胰岛素作用缺陷， 导致糖、 脂肪和蛋白质代谢异常， 随病程 延长， 可致眼、 肾。
7、、 神经、 心脏和血管等多系统进行性损害， 引起功能衰竭， 使患者的生活质 量降低， 寿命缩短， 病死率增高。在我国， II 型糖尿病的发病日趋低龄化， 给社会和经济发 展带来沉重的负担， 严重危害人民的生命健康。为此， 一定要对其积极防治， 而防治的关键 就在于改善胰岛素抵抗。 0005 由于对糖尿病的病因和发病机制尚未充分明了， 缺乏针对病因的治疗。目前强调 早期治疗、 长期治疗、 综合治疗和治疗个体化的原则。国际糖尿病联盟 (IDF) 提出了糖尿病 现代治疗的五个要点， 分别是 ： 饮食控制， 运动疗法、 血糖监测、 药物治疗和糖尿病教育。长 期以来医学界重视控制高血糖， 1993 年以。
8、来， 以循证医学为原则的 DCCT( 糖尿病控制与并 发症研究， 由美国和加拿大联合进行 ) 和 UKPDS( 英国前瞻性糖尿病研究 ) 分别对大样本的 I型和II型糖尿病患者进行为期平均达10年的长期随访， 结果表明应用强化治疗使血糖接 近正常可预防糖尿病微血管并发症的发生 ； 不仅控制空腹血糖， 还应注意餐后血糖达标。 0006 由于 II 型糖尿病患者很少自发性发生酮症酸中毒等急性并发症， 多数患者不需 要胰岛素治疗维持生命， ( 除非在某些阶段， 可能需要胰岛素控制代谢紊乱 )， 所以口服降 糖药在 II 型糖尿病的药物治疗中占有相当大的比例。口服药物治疗方面目前应用比较多 的降糖药物。
9、主要有四类 ： 促胰岛素分泌剂(磺脲类和格列奈类)、 双胍类、 -糖苷酶抑制剂 类和胰岛素增敏剂类。这些药物以及胰岛素作用于全身各个代谢器官 (- 糖苷酶抑制剂 除外 )， 所以在纠正血糖的同时也会产生很多的副作用 (6)， 比如增加体重 ( 双胍类除外 )， 说 明 书 CN 101912617 B 3 2/9 页 4 其他副作用具体见下 ： 0007 1) 促进胰岛素分泌剂的不良反应主要是低血糖， 吃药后会出现心慌、 出汗、 有饥饿 感症状， 严重者甚至会出现意识障碍， 有时也会出现皮疹等过敏反应以及肝肾功能损害。 0008 2) 双胍类主要是胃肠道反应 ( 患者服药后会有恶心、 食欲不振。
10、的现象 ) 以及乳酸 酸中毒 ( 服用降糖灵后， 患者会出现乏力、 意识障碍甚至昏迷的症状 )， 还有一部分病人会 有肝肾功能损害和过敏性反应以及大细胞性贫血反应。 0009 3)- 糖苷酶抑制剂是通过延缓葡萄糖的吸收从而达到降低血糖的目的， 由于自 身不吸收， 对全身的副作用就相对小一些， 其最主要的副作用是胃肠道反应， 患者服药后会 有腹胀、 腹痛、 腹泻和肠排气过多等现象。 0010 4) 胰岛素增敏剂是通过激活 PPAR- 而起作用的， 其最大的副作用是肝损害以及增 加血容量， 从而加重心脏负担。 0011 由于糖尿病人需要终身服药， 很多患者对长期服药的副作用比较担心， 而这些副 作。
11、用的控制也往往成为降糖治疗成败的关键因素之一。 0012 MG53 是已知的人体的基因， 又称三结构域蛋白 72(TRIM72)， 其 DNA 序列如美国专 利申请 ( 申请号 ： U.S.Patent Application Serial No.12/307,303) 中所述。最近又发现 MG53 蛋白在心肌和骨骼肌中特异性表达， 其氨基酸序列如专利申请 “MG53 蛋白预防和 / 或 治疗心脏缺血/再灌损伤的用途(申请号 ： 200910241451.3)” 中MG53蛋白氨基酸序列表中 的 SEQ ID NO.1 所示。已有的研究结果表明， 在骨骼肌中 MG53 能够作为一种结构蛋白促进。
12、 细胞膜损伤的修复， 同时也能够调节细胞内小泡的运转和骨骼肌细胞再生。 目前， 有关MG53 的研究都是在骨骼肌内进行的。已知 MG53 基因表达的 MG53 蛋白仅在心脏和骨骼肌 ( 全身 最大的胰岛素靶器官 ) 中表达 (7)( 图 1)， 推测 MG53 基因的表达很可能与胰岛素的功能有 关。 发明内容 0013 鉴于上述现有降糖治疗技术中存在的问题， 本发明的目的是确定 MG53 基因的表 达与胰岛素抵抗特征之间的相互关系， 提供一个用于治疗胰岛素抵抗且骨骼肌特异性的的 靶基因 -MG53 的新用途， 进而用 MG53 作为靶点， 把拮抗 MG53 应用于糖尿病及其相关病症的 治疗。 。
13、0014 本发明的目的通过下述的技术方案来实现 ： 0015 本发明首先通过大量的试验， 深入研究， 确定 MG53 表达与胰岛素抵抗之间的关 系 ： 0016 1、 在出现胰岛素抵抗的情况下， 其 MG53 的表达明显上调 0017 本发明选用 db/db 和 SHR( 自发性高血压大鼠 ) 这两种不同类型的胰岛素抵 抗的动物模型 (8， 9)， 动物经喂养并将其处死以后， 对心脏和骨骼肌利用 RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay， 放射免疫沉淀分析)用裂解液结合超声的方法裂解后得到蛋 白， 利用免疫印迹的方法 (Western blot)结合特异性识别M。
14、G53蛋白的抗体进行检测， 测定 其 MG53 的表达， 结果表明， 这两种不同类型的胰岛素抵抗动物模型中， 其 MG53 的表达明显 上调 ( 图 2、 图 3)。 0018 2、 MG53 的过表达可产生胰岛素抵抗的基本特征 说 明 书 CN 101912617 B 4 3/9 页 5 0019 本发明通过用 GFP-MG53 腺病毒载体 (Ad-GFP-MG53) 转染体外培养的成年鼠心肌 细胞和骨骼肌细胞， 使 MG53 在细胞中过表达， 提取蛋白质进行 SDS-PAGE- 免疫印迹试验 (Western blot)检测MG53蛋白质含量(图5A)。 通过在荧光显微镜下观察到感染腺病毒。
15、的 细胞呈现荧光 ( 图 4)， 以及通过 MG53 蛋白质含量的检测所确定的 MG53 过表达的效率 ( 图 5B)， 表明在 Ad-GFP-MG53 感染的大鼠心肌细胞中， MG53 已过表达 (* ： p 0.001 vs GFP 组 )。确定在 Ad-GFP-MG53 感染的大鼠心肌细胞中， MG53 已过表达后， 用掺入作为示踪剂的 3H 标记的 2- 脱氧葡萄糖的台氏液处理细胞， 细胞内 2- 脱氧葡萄糖的含量通过液闪仪进行 计数， 结果发现 MG53 过表达的体外细胞可以模拟下述的胰岛素抵抗的基本特征 ： 过表达的 MG53 抑制胰岛素介导的葡萄糖摄取 ( 图 6， * ： p 。
16、0.001 vs GFP 组 0 分钟 ) ； 同时过表达 MG53 还能够抑制胰岛素引起的细胞内信号分子的改变。 0020 3、 MG53 的过表达抑制胰岛素受体信号转导 0021 胰岛素受体信号转导是实现胰岛素生物学功能的生物化学基础， 也是本领域研 究的热点之一。本发明中检测了 Akt、 ERK 和 IRS-1 三个基本节点。在成年大鼠心肌细胞 中过表达 MG53 后， 用胰岛素刺激细胞， 然后提取细胞蛋白质进行 SDS-PAGE- 免疫印迹试 验 (Western blot)， 结果显示过表达 MG53 完全抑制了胰岛素介导的下游信号 Akt 和 ERK 的激活 ( 图 7)。进一步，。
17、 在分化的 C2C12 肌管细胞中过表达 MG53， 用胰岛素刺激后， 进行 Western blot， 结果显示过表达的 MG53 完全抑制胰岛素介导的 IR、 IRS-1、 Akt、 GSK3 和 ERK 的激活， 而且会抑制 IR 和 IRS-1 的蛋白表达水平 ( 图 8)。进一步表明， MG53 是通过抑制 IR(Insulinreceptor) 和 IRS-1 的激活导致胰岛素抵抗的 ( 图 6-8)。 0022 4、 MG53 缺陷显著抑制了高脂饮食诱导的高胰岛素血症、 高血压症、 高胆固醇血症 ； MG53 缺陷还可抑制高脂饮食诱导的肥胖、 促进葡萄糖代谢并且增强胰岛素敏感性。。
18、 0023 本发明选用野生型和 MG53 敲除型的 C57 小鼠进行试验， 将 C57 野生型和 MG53 敲 除型小鼠各分成正常组和高脂组两组， 每组20只小鼠。 C57小鼠野生型和MG53敲除型的正 常组给予正常生长繁殖饲料 ； 高脂组给予脂肪占 60能量百分比的高脂饲料， 然后通过对 正常组和高脂组小鼠进行糖耐量试验、 清醒状态下的血压测定、 血清胆固醇含量的测定、 小 鼠体重的逐周测量， 绘制小鼠生长曲线图、 空腹血糖和自由进食状态时的血糖的检测， 研究 MG53 缺陷对高脂饮食诱导的高胰岛素血症、 高血压症、 高胆固醇血症、 肥胖、 葡萄糖代谢、 胰 岛素敏感性的影响。 结果表明， 。
19、敲除MG53基因所致的MG53缺陷可以降低空腹血糖和餐后血 糖 ； MG53 缺陷还可以显著抑制高脂饮食诱导的高胰岛素血症、 高胆固醇血症和高血压症， 对于所诱导的肥胖有部分抑制作用。( 图 9-16) 0024 由以上结果可知 ： MG53 基因的过表达会导致胰岛素抵抗的发生， 而 MG53 是通过抑 制IR(Insulin receptor)和IRS-1的激活导致胰岛素抵抗的 ； MG53缺陷显著抑制了高脂饮 食诱导的高胰岛素血症、 高血压症、 高胆固醇血症 ； MG53 缺陷还可抑制高脂饮食诱导的肥 胖、 促进葡萄糖代谢并且增强胰岛素敏感性。 因此， MG53基因可作为药物靶点， 构建M。
20、G53基 因过表达的体外细胞模型或动物模型， 用于筛选预防、 缓解和 / 或治疗胰岛素抵抗和 II 型 糖尿病及其相关病症的药物 ； MG53 基因也可作为基因治疗中的靶基因， 设计并制备预防、 缓解和 / 或治疗胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症的药物和 / 或生物学试剂， 通过基 因工程技术达到预防、 缓解和 / 或治疗胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症的目的。例 如以MG53为靶基因， 设计可干扰MG53表达的双链siRNA， 通过化学方法合成以后， 注射入人 说 明 书 CN 101912617 B 5 4/9 页 6 体通过 RNA 干扰的方法使 MG53 基因沉默来治疗。
21、 II 型糖尿病及其相关病症 ； 还可以设计并 构建 MG53 的突变体， 注射后进入细胞， 竞争 MG53 原形的作用底物， 从而抑制 MG53 的功能， 起到治疗目的 ； 此外， 还可以以 MG53 为靶点设计小分子化合物抑制剂， 利用 MG53 基因过表 达的体外细胞模型或动物模型， 通过筛选， 发现其中能够特异性抑制 MG53 的分子， 从而为 胰岛素抵抗和 II 型糖尿病的治疗提供新的治疗性分子。 0025 本发明提供了 MG53 基因的表达与胰岛素抵抗之间的相互关系， 因此， MG53 可作为 药物靶点或基因治疗中的靶基因应用于胰岛素抵抗和 II 型糖尿病及其相关病症的预防、 缓解。
22、和 / 或治疗， 能够为胰岛素抵抗和 II 型糖尿病的治疗提供新的治疗方向 ； 同时， 由于 MG53 仅在骨骼肌和心脏中表达， 从理论上考虑， 控制此基因的表达并不会影响身体其他系 统的功能， 这将极大地降低其在实际应用中的不良反应， 提高治疗效果， 从而提供了一条有 效治疗 II 型糖尿病及其相关病症的新途径。此外， 由于目前对糖尿病的病因和发病机制尚 未充分明了， 缺乏针对病因的治疗， MG53 基因的表达与胰岛素抵抗之间的相互关系的确定， 无疑为进一步研究糖尿病的病因和发病机制以及治疗方法打下了基础。 0026 本说明书中所用的术语的缩写定义如下 ： 0027 db/db ： 瘦素受体。
23、突变的小鼠， 由 C57BL/KsJ 近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而 来， 属胰岛素抵抗的动物模型 ； 0028 db/+ ： 瘦素受体正常的小鼠， 用作 db/db 小鼠的对照 ； 0029 SHR ： 自发性高血压大鼠， 属胰岛素抵抗的动物模型 ； 0030 Akt、 ERK ： 细胞内两种激酶， 是胰岛素受体向细胞内传导其信号的重要介导分子， 其中 Akt 为蛋白激酶 B(Protain Kinase B)、 ERK 为胞外信号调节激酶 (Extracellular signal-regulated kinase) ； 0031 GSK3 ： 糖原合成酶激酶 3(Glycogen sy。
24、nthetase kinase)， 是 Akt 的重要的下游 分子， 受 Akt 调节 ； 0032 IR ： 胰岛素受体 (Insulin receptor)， 能够和胰岛素结合激活后催化细胞内的胰 岛素相关的反应 ； 0033 IRS ： 胰岛素受体底物(Insulin receptor substrate)， 能够被激活的胰岛素受体 酪氨酸激酶作用的底物， 其上具有十几个酪氨酸残基可被磷酸化， 磷酸化的 IRS 能够结合 并激活下游效应物 ； 0034 Ad-GFP ： 含 GFP( 绿色荧光蛋白 ) 的腺病毒， 在本发明中用作对照腺病毒 ； Ad-MG53(Ad-GFP-MG53) ：。
25、 含GFP-MG53(绿色荧光蛋白-MG53融合蛋白)的腺病毒， 在本发明 中用作 MG53 过表达的腺病毒。 附图说明 0035 图 1 是小鼠组织中 MG53 的 Northern blot 结果， 说明 MG53 仅在小鼠心脏和骨骼 肌中表达。 0036 图 2 是 MG53 在 db/db 型的胰岛素抵抗动物模型的心脏和骨骼肌中的表达图 (Western blot)， 显示 MG53 在 25 周龄 db/db 小鼠中表达上调， 其中的 GAPDH(Glyceraldeh yde-3-phosphate dehydrogenase) 为甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 用作内参。 0037。
26、 图 3 是 MG53 在 6 月龄自发性高血压大鼠 (SHR) 和正常大鼠 (WKY， 作为 SHR 的对 说 明 书 CN 101912617 B 6 5/9 页 7 照 ) 心脏中的表达图 (Western blot)， 显示 MG53 在 SHR 中的表达上调， 其中的 GAPDH(Glyc eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 为甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶， 用作内参。 0038 图 4 是 Ad-GFP 和 Ad-MG53(Ad-GFP-MG53) 感染成年大鼠心肌细胞 48 小时后， 在荧 光显微镜下的观察照片。 0039 图 5 中， A 。
27、图是 Ad-GFP 和 Ad-MG53(Ad-GFP-MG53) 感染成年大鼠心肌细胞 48 小时 后， 提取蛋白质进行 SDS-PAGE- 免疫印迹试验 (Western blot) 的结果， 用于检测 MG53 蛋 白质的含量， 其中 1、 2， 3、 4 和 5、 6 泳道分别代表三组平行试验， 1、 3、 5 和 2、 4、 6 分别表示用 Ad-GFP 和 Ad-MG53 转染，“+” 表示有腺病毒感染，“-” 表示无腺病毒感染 ； B 图显示 MG53 过 表达的效率 (* ： p 0.001vs GFP 组 )。 0040 图 6 是 Ad-GFP 或 Ad-MG53(Ad-GF。
28、P-MG53) 感染的成年大鼠心肌细胞的 3H- 葡萄 糖摄取检测图， 表明过表达 MG53 能够完全抑制胰岛素介导的成年大鼠心肌细胞葡萄糖摄 取 (* ： p 0.001 vs GFP 组 0 分钟 )。 0041 图 7 是 Ad-GFP 或 Ad-MG53(Ad-GFP-MG53) 感染的成年大鼠心肌细胞用胰岛素诱导 0 分钟、 5 分钟和 10 分钟后的胰岛素受体下游信号 Western blot 检测图， 显示过表达 MG53 完全抑制了胰岛素介导的下游信号 Akt 和 ERK 的激活 ； 其中 “p-” 代表磷酸化的激酶 (Akt 和 ERK) ；“t-” 代表总的 ( 包括磷酸化。
29、和未磷酸化的 ) 激酶 (Akt 和 ERK) ； Akt S473 和 Akt T308代表不同的Akt的磷酸化位点 ；“+” 表示有腺病毒感染，“-” 表示无腺病毒感染， Ad-GFP 和 Ad-MG53 都为 “-” 的为对照。 0042 图 8 是小鼠分化的 C2C12 肌管细胞用胰岛素诱导 10 分钟后的胰岛素受体底物 1(IRS-1) 信号 Western blot 检测图， 显示过表达 MG53 完全抑制胰岛素介导的 IR(Insulin receptor)、 IRS-1、 Akt、 GSK3 和 ERK 的激活， 而且会抑制 IR 和 IRS-1 的蛋白质表达 ； 其中 “p-。
30、”代表磷酸化的激酶 (Akt， ERK 和 GSK3) 或胰岛素受体及其底物 (IR 和 IRS) ； p-IRS1(y895) 代表在 895 位酪氨酸上磷酸化的 IRS1( 一种重要的 IRS 亚型 ) ；“t-” 或者没 有标记代表总的 ( 包括磷酸化和未磷酸化的 ) 激酶或受体及其底物 ；“+” 表示有腺病毒感 染，“-” 表示无腺病毒感染， Ad-GFP 和 Ad-MG53 都为 “-” 的为对照 ； 左边的三条泳道代表在 没有胰岛素刺激的条件下， 没有转染腺病毒、 或者转染对照腺病毒， 以及过表达 MG53 的腺 病毒对骨骼肌细胞中各种激酶， 受体以及受体底物的功能状态(磷酸化)的。
31、影响， 作为右边 的三条有胰岛素刺激的条件下， 代表同样含义的泳道的对照 ； - 微管蛋白 (-tubulin) 和 - 肌动蛋白 (-actin) 用作内参。 0043 图 9 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 7 周时的血糖检 测图， 显示 MG53 的缺陷可降低高脂饮食诱导的空腹和有餐的血糖升高， 甚至也可抑制正常 饮食情况下的有餐血糖升高 (* ： p 0.05vs 野生型正常组 )。 0044 图10是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养条件下的生长曲 线图， 显示 MG53 缺陷可部分抑制高脂饮食诱导的肥胖 (p 0.05 野生型高脂组和 。
32、MG53 敲 除型高脂组 vs 野生型正常组 ； p 0.05 野生型高脂组 vs MG53 敲除型高脂组 )。 0045 图 11 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 7 周、 13 周和 30 周时的糖耐量试验检测图， 显示MG53缺陷能增强葡萄糖的代谢(* ： p0.05vs野生型正常 组， * ： p 0.001vs 野生型正常组 )。 0046 图 12 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 7 周、 13 周和 30 说 明 书 CN 101912617 B 7 6/9 页 8 周时的胰岛素耐受试验检测图， 显示 MG53 缺陷能增强高。
33、脂食诱导情况下的胰岛素敏感性 (* ： p 0.001vs 野生型正常组 )。 0047 图 13 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 33 周时的血清 胰岛素含量在糖耐量试验过程中的检测图， 显示 MG53 缺陷明显抑制了高脂饮食诱导的高 胰岛素血症 (* ： p 0.001vs 野生型正常组 )。 0048 图 14 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 33 周时的血清 胰岛素含量在糖耐量试验过程中的升高百分比换算图， 显示 MG53 缺陷抑制了高脂饮食诱 导的胰岛素释放第一时相的高峰缺失 (* ： p 0.05vs 野生型正常组 )。 00。
34、49 图 15 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 36 周时的血压 图 (* ： p 0.05vs 野生型正常组 )。 0050 图 16 是野生型小鼠和 MG53 敲除小鼠在正常饮食或高脂饮食喂养 33 周时的血胆 固醇图 (* ： p 0.001vs 野生型正常组， ： p 0.001vs 野生型高脂组 )。 具体实施方式 0051 实施例 1MG53 在胰岛素抵抗模型动物的心脏和骨骼肌中的表达 0052 (1) 试验动物 0053 选用db/db小鼠和自发性高血压大鼠(SHR)两种胰岛素抵抗的动物模型作为试验 组 ； 选用瘦素受体正常的 db/+ 小鼠作为对照组。
35、。其中 db/db 小鼠购自 Jackson Lab 公司， 这种小鼠是通过基因改造， 使其 “瘦素” 受体的基因突变， 随着年龄的增长会自发出现肥胖、 糖尿病和胰岛素抵抗等症状， 从而成为胰岛素抵抗的动物模型。 对于自发性高血压大鼠， 是 从正常大鼠中筛选血压高者， 而后利用血压高的大鼠进行交配， 在子代中继续筛选血压高 的大鼠， 经过数代筛选后得到随着年龄增加自发性出现高血压和胰岛素抵抗症状的大鼠。 每组动物至少为 6-8 只。 0054 (2) 试验方法 0055 采用 24 周龄的 db/+ 小鼠， 利用普通小鼠饲料喂养， 得到对照小鼠 ； 采用相同周龄 的 db/db 小鼠和自发性高。
36、血压大鼠， 用普通的小鼠饲料进行喂养， 喂养的时间与对照小鼠 相同。所有的动物都能够自由采食。 0056 (3) 检测方法及结果 0057 每组的动物处死以后， 对心脏和骨骼肌利用 RIPA(RadioImmunoprecipitation Assay， 放射免疫沉淀分析 ) 用裂解液结合超声的方法裂解后得到蛋白， 利用免疫印迹的方 法 (Westernblot) 结合特异性识别 MG53 蛋白的抗体进行检测， 每组至少检测 6-8 只动物。 检测结果如图 2 和图 3 所示。由图 2 可见， 与正常小鼠相比， MG53 在 25 周龄的胰岛素抵抗 db/db小鼠的心脏和骨骼肌中表达明显上调 。
37、； 如图3所示， MG53在6月龄的另一种胰岛素抵 抗的自发性高血压大鼠 (SHR) 的心脏中表达也上调。 0058 实施例 2 在成年大鼠心肌细胞中过表达的 MG53 抑制胰岛素介导的葡萄糖摄取 0059 (1) 在成年大鼠心肌细胞中过表达 MG53 0060 取 8 周龄的雄性 SD 大鼠心脏， 酶法灌流分离细胞， 细胞种于培养皿中 (10)， 以 GFP 或 GFP-MG53 腺病毒 (Ad-GFP 或 Ad-GFP-MG53)200moi 感染 48 小时， 在荧光显微镜下观 察转染效率， 感染腺病毒的细胞可以在荧光显微镜下呈现荧光 ( 图 4)。提取蛋白质进行 说 明 书 CN 10。
38、1912617 B 8 7/9 页 9 SDS-PAGE- 免疫印迹试验 (Western blot) 检测 MG53 蛋白质含量 ( 图 5A)， 确定 MG53 过表 达的效率 ( 图 5B)。图 4 和图 5 表明在 Ad-GFP-MG53 感染的大鼠心肌细胞中， MG53 已过表 达 (* ： p 0.001vsGFP 组， 每组至少 6-8 次实验的结果 )。 0061 (2) 检测被过表达 MG53 的成年大鼠心肌细胞摄取的 2- 脱氧葡萄糖含量 0062 以 GFP 或 GFP-MG53 腺病毒 (Ad-GFP 或 Ad-GFP-MG53)200moi 感染成年大鼠心肌细 胞 (。
39、105细胞 / 孔 )48 小时后， 用台氏液 (1MCa2+) 室温孵育 2 小时， 然后换为含 0 或 10-7M 胰岛素 (Sigma， USA) 的台氏液室温处理 30 分钟， 最后 5 分钟时掺入作为示踪剂的 3H 标记 的 2- 脱氧葡萄糖 (PerkinElmer 公司， USA)1Ci/ml， 30 分钟时弃除台氏液， 用 0.5M NaOH 终止反应， 细胞内 2- 脱氧葡萄糖的含量通过液闪仪进行计数。所得数据在减去非特异性的 计数 预先用 20M 松弛素 B(cytochalasin B) 在加胰岛素之前进行处理， 得到的计数， 这个 数值也可以作为内参 即为细胞实际摄取的。
40、 3H 标记的 2- 脱氧葡萄糖。结果如图 6 所示， 因为促进细胞对葡萄糖的摄取是胰岛素最基本的生物学特性， 图6中过表达MG53完全抑制 了胰岛素介导的 3H 标记的 2- 脱氧葡萄糖摄取， 表明了细胞中 MG53 的过表达导致了胰岛素 抵抗 (* ： p 0.001vsGFP 组 0 分钟， 每组至少 6-8 次实验的结果 )。 0063 实施例 3 在成年大鼠心肌细胞中过表达的 MG53 抑制胰岛素受体信号转导 0064 (1) 在成年大鼠心肌细胞中过表达 MG53 的方法同实施例 2 中的 (1) 所述。 0065 (2) 检测过表达 MG53 的成年大鼠心肌细胞中 MG53 的过表。
41、达对胰岛素受体信号转 导的抑制。 0066 以 GFP 腺病毒 ( 对照病毒 ) 或 GFP-MG53 腺病毒 (Ad-GFP 或 Ad-GFP-MG53)200moi 感染成年大鼠心肌细胞 (105细胞 / 孔 )48 小时后， 用 10-7M 的胰岛素刺激 0 分钟、 5 分钟和 10 分钟， 然后提取细胞蛋白质进行 SDS-PAGE- 免疫印迹试验 (Western blot)， 结果显示过 表达 MG53 完全抑制了胰岛素介导的下游信号 Akt 和 ERK 的激活 ( 图 7)。进一步， 在分化的 C2C12 肌管细胞 2马血清 (Hyclone， USA) 诱导 6 天 中过表达 M。
42、G53， 用 10-7M 的胰岛素 刺激10分钟后， 进行Westernblot， 结果显示完全抑制胰岛素介导的IR、 IRS-1、 Akt、 GSK3 和 ERK 的激活， 而且会抑制 IR 和 IRS-1 的蛋白表达水平 ( 图 8)。由图 8 可见， 在正常情况 下， IR 和 IRS 的磷酸化水平很低， 检测不到， 而在胰岛素刺激以后， 它们的磷酸化可以增加 很多， 但是在 MG53 过表达以后胰岛素刺激的磷酸化增加遭到削弱 ； 对于总蛋白 IR 和 IRS， 在图 8 中可以看到， 无论是正常情况下， 还是胰岛素刺激的条件下， MG53 过表达后的条带其 强度都要比对照和对照病毒的要。
43、低， 这都表明了 MG53 过表达引起 IR 和 IRS1 的蛋白水平下 降。胰岛素受体信号转导是实现胰岛素生物学功能的生物化学基础。本实施例中检测了 Akt、 ERK 和 IRS-1 三个基本节点， 结果表明细胞中过表达的 MG53 抑制了胰岛素受体信号转 导， 从而导致胰岛素抵抗 ( 每组至少 6-8 次实验的结果 ) 0067 实施例 4MG53 缺陷抑制高脂饮食诱导的肥胖 0068 将 C57 小鼠野生型和 MG53 敲除型 (MG53 敲除型小鼠的制备方法见 NatureCell Biology ， Cai et.al.2009 ； 11(1) ： 56-64) 各分成正常饮食组和高。
44、脂饮食组两组， 每组 20 只小鼠。C57 小鼠野生型和 MG53 敲除型的正常组从 3 周龄起给予正常生长繁殖饲料 ( 饲 料购自军事医学科学院 ) ； 高脂组从 3 周龄起给予脂肪占 60能量百分比的高脂饲料 ( 饲 料购自 Research Diets， USA)， 然后逐周测量小鼠体重， 绘制小鼠生长曲线图 ( 图 10)。结 果显示， 对于野生型小鼠， 高脂饮食饲喂后， 体重出现明显增加 ( 从 35g 左右增加到 55g 左 说 明 书 CN 101912617 B 9 8/9 页 10 右 )， 而 MG53 缺陷在正常饮食情况下对于小鼠体重生长没有明显影响， 但是高脂饮食诱导 。
45、的肥胖可以受到明显抑制(p0.05野生型高脂组和MG53敲除型高脂组vs野生型正常组 ； p 0.05 野生型高脂组 vs MG53 敲除型高脂组 )。 0069 实施例 5MG53 缺陷促进葡萄糖代谢并且增强胰岛素敏感性 0070 将 C57 野生型和 MG53 敲除型小鼠 ( 制备方法同实施例 4) 各分成正常饮食组和高 脂饮食组两组， 每组 20 只小鼠， 喂养方法同实施例 4。在 C57 小鼠 10 周龄时， 对其空腹血糖 和自由进食状态时的血糖进行检测 ( 血糖仪及试纸购自 Roche 公司， USA)， 结果显示 MG53 的缺陷可降低高脂饮食诱导的空腹和有餐的血糖升高， 并可抑制。
46、正常饮食情况下的有餐血 糖升高 ( 图 9， * ： p 0.05vs 野生型正常组 )。 0071 喂养7周、 13周、 30周后分别进行糖耐量试验(禁食18小时， 腹腔注射葡萄糖2g/ kg体重， 监测给糖前和给糖后15分钟、 30分钟、 60分钟、 90分钟和120分钟的血糖值)， 结果 显示 ： 喂养高脂饮食的野生型小鼠， 腹腔注射葡萄糖以后， 引起血糖一过性上升， 其持续时 间和幅度分别比同样进行高脂饮食饲养 MG53 敲除小鼠要长和高得多， 显示 MG53 缺陷能增 强葡萄糖的代谢 ( 图 11， * ： p 0.05vs 野生型正常组， * ： p 0.001vs 野生型正常组 。
47、)。 0072 喂养 7 周、 13 周、 30 周后分别进行胰岛素耐受试验 ( 自由进食状态时， 腹腔注射胰 岛素0.75U/kg体重， 监测给胰岛素前和给胰岛素后15分钟、 30分钟、 60分钟、 90分钟和120 分钟的血糖值 )， 结果换算成给胰岛素前血糖值的百分数， 结果显示 ： 喂养高脂饮食的野生 型小鼠， 腹腔注射胰岛素以后， 引起血糖一过性下降， 其持续时间和幅度分别比同样进行高 脂饮食饲养 MG53 敲除小鼠要短和低得多， 显示 MG53 缺陷能增强高脂食诱导情况下的胰岛 素敏感性 ( 图 12， * ： p 0.001vs 野生型正常组 )。两个结果都提示， MG53 敲除。
48、小鼠进 行高脂饮食饲养以后对于胰岛素的敏感性要高于同样处理的野生型小鼠。 0073 实施例 6MG53 缺陷抑制高脂饮食诱导的高胰岛素血症 0074 高胰岛素血症是胰岛素抵抗的重要标志之一， 而血浆胰岛素的测量特别是胰岛素 释放第一时相的情况对于评价胰岛素细胞功能有重要意义。 0075 同实施例 5 将 C57 野生型和 MG53 敲除型小鼠 ( 制备方法同实施例 4) 各分成正常 饮食组和高脂饮食组两组， 每组 20 只小鼠。对正常组和高脂组的小鼠分别给予正常生长繁 殖饲料 ( 同实施例 4) 和高脂饮食 ( 同实施例 4) 的喂养， 喂养至 33 周时， 对正常组和高脂 组小鼠行糖耐量试验。
49、 ： 在给糖前和给糖后 15 分钟及 30 分钟， 自鼠尾取血， 3,000g 15 分钟 分离血清， 用酶联免疫法测定血清胰岛素含量 (Linco 公司， USA)。结果显示高脂饮食喂养 的野生型小鼠出现严重的高胰岛素血症， 而且葡萄糖诱导的胰岛素释放第一时相的高峰也 缺失了 ； 而高脂饮食喂养的MG53敲除小鼠其高脂饮食诱导的高胰岛素血症被明显抑制(图 13， * ： p 0.001vs 野生型正常组 )， 并且出现了葡萄糖诱导的胰岛素释放第一时相的高 峰 ( 图 14， * ： p 0.05vs 野生型正常组 )。 0076 实施例 7MG53 缺陷抑制高脂饮食诱导的高血压症 0077 高血压症是急性心脑血管事件的重要危险因素， 也是形成胰岛素抵抗的重要病理 生理基础之一。同实施例 5 将 C57 小。