描述
本发明涉及柠檬类黄酮混合物用于改善瘤胃发酵的用途。
缩写
VFA 挥发性脂肪酸
ΔCt 扩增循环的增加
ΔΔCt 相对于PCR中的对照样品的扩增循环的增加
DGGE 变性梯度凝胶电泳
M.elsdenii 埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)
ns 不显著
PCR 聚合酶链反应
S.bovis 牛链球菌(Streptococcus bovis)
哺乳动物不具有用于消化结构性碳水化合物，即纤维素的合适的 消化酶。因此，并且为了获取这样重要的营养素来源，草食动物已经 构筑了容纳能够消化或发酵这样的营养素的共生菌群的发酵隔室。这 些隔室位于宿主中的酶消化之前(反刍动物)或之后(胃后发酵物质， 即，马科动物、兔子)。瘤胃的微生物仅仅部分地使用这些碳水化合 物并释放挥发性脂肪酸(醋酸、丙酸和丁酸)，作为发酵产物，这些 是反刍动物最重要的能量来源。在瘤胃中增殖的微生物是能够适应区 室条件和利用所摄入食物的那些。将不同的食物级分，碳水化合物和 蛋白质发酵，并且通过瘤胃中产生的过剩的生物质(这又是十二指肠 中最终吸收的蛋白质的主要来源)补充VFA产生。
纤维素发酵细菌(分解纤维素的)在6.4-7的pH下最佳地生长， 并且产生的醋酸多于淀粉和糖发酵物质(分解淀粉的)。最佳pH为约 5.5，并且当这些水平下降时，存在乳酸相对产生的增加。
随着反刍动物生产系统的加强，基于饲料的饲养已经被给予用谷 物配制的浓缩定量食物配给替代，这提高了生长速率和降低了操作成 本。然而，浓缩定量配给食物或由快速发酵可溶性碳水化合物(淀粉) 替代结构性碳水化合物(纤维素)导致出现了一些消化功能障碍，如 酸中毒和timpanism。
瘤胃酸中毒可以被定义为通过消化大量富含可发酵碳水化合物的 食物产生的消化改变，并且这是肥育的小牛中最常见的功能障碍之一。 其可以通过使细菌群从革兰氏阴性变为革兰氏阳性、有利于如牛链球 菌或埃氏巨型球菌这些物种的发育和改变VFA的比例而导致死亡和发 作。醋酸和丙酸的比例降低，而丁酸和乳酸增加。乳酸的增加影响了 瘤胃运动性，由于不能消除所产生的气体产生了腹中积气。急性症状 是厌食、黄绿色水样粪便、瘤胃张力缺乏、跛行、腹部缩回和脱水。 亚急性形式包括频繁腹中积气、异常毛发和出现在屠宰后发现的肝脓 肿。
timpanism和腹中积气被定义为由发酵过量产生和累积气体(二 氧化碳和甲烷)所引起的消化性改变，引起蜂窝胃-瘤胃的异常膨胀。
通常，加入抗生素物质(离子载体，如莫能菌素)使上述瘤胃功 能障碍以潜在状态存在。然而，这类作为生长增强剂的物质逐渐取消 导致了这些病症的出现，引起高死亡率或发病率，这对于利润具有负 面影响。这种对农场生产力的影响非常重要，因此需要这些抗生素物 质的可替换物。
专利US4443471涉及M-139603的不同化学衍生物和M-139603反 刍动物生长增强剂，及其在降低由瘤胃发酵产生的甲烷量中的用途。
专利US5196432涉及α-2肾上腺素受体拮抗剂在治疗受乳酸酸中 毒影响的反刍动物中的用途。
专利US5709894描述了用于反刍动物的食品添加剂，其含有谷氨 酸和玉米发酵产物，以提高瘤胃的发酵。
专利申请US2003165487描述了基于米曲霉(Aspergillus oryzae)淀粉酶的方法和组合物，以提高瘤胃的发酵效率和防止瘤胃 乳酸浓度的有害增加，促进有益的瘤胃微生物的生长。
专利申请US2004009209涵盖了保持反刍动物的瘤胃健康的方法， 由低湿度糖蜜和缓冲剂的混合物组成。
PCT申请WO9119489描述了通过将琥珀酸和其他羧酸盐给予喂养 高能量配给的反刍动物来调控瘤胃pH水平的方法。
PCT申请WO9325616涉及包胶于源自可溶性异源蛋白和还原糖的 美拉德反应的基质中的淀粉产品，以改善反刍动物瘤胃中的微生物发 酵效率。
PCT申请WO2004009104涉及埃氏巨型球菌(M.elsdenii)的新 菌株及其用途，包括反刍动物的乳酸酸中毒的预防和治疗。
PCT申请WO2005000035涉及改善瘤胃发酵的方法，特别是降低甲 烷产生，其包括给予获自新鲜苜蓿的可溶性苜蓿提取物。
EP1323354描述了一种基于植物材料的天然饲料添加剂。
已知将作物和食品加工工业的副产物饲喂给家畜。例如，柑橘副 产物饲料可以用作反刍动物饲料系统的成分。它们含有各种用于瘤胃 微生物的能量物质(Bampidis等，Animal Feed Science and Technology(动物饲料科学技术)，Elsevier，vol.128，2006， 175-217)。JP-52 028922描述了其中含有苦味桔皮的药物。将该药 物饲喂给马、牛或家禽。
本申请的发明人已经发现了柠檬类黄酮(尤其是柚皮苷)、苦味 的柑桔提取物和海泡石的混合物能够调节得自给予浓缩定量配给的微 生物发酵过程、提高微生物发酵过程的效率和限制某些直接涉及瘤胃 酸中毒过程的物种，尤其是牛链球菌。
因此，本发明涉及包含柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的混 合物在改善反刍动物中瘤胃发酵的用途。
在本申请中，“反刍动物”包括牛、绵羊、山羊和骆驼(camelide) 物种。
该混合物相对于现有技术的状况呈现出一系列优势，使其在反刍 动物营养领域中具有高价值。该优势是混合物中的所有成分是天然来 源的产物，并且容易获得。另一方面，混合物易于操作并且可以根据 本领域专家已知的工业配制方法来制备。该混合物还具有限制涉及瘤 胃酸中毒出现的某些物种(尤其是牛链球菌)生长的附加优势。因此， 特别地，本发明涉及所述混合物用于改善反刍动物发酵的用途，该反 刍动物发酵受到瘤胃中天然细菌丛不平衡的损害。本发明还涉及所述 混合物用于防止瘤胃发酵损害的用途，这种瘤胃发酵损伤可能是由于 瘤胃中天然细菌丛不平衡所引起的。特别的目的是使用本发明的混合 物来限制引起瘤胃酸中毒的细菌的生长，如乳杆菌属(Lactobacillus spp)，例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，以及尤其 是牛链球菌。
将混合物以100至300ppm浓度(100至300g/吨)的固体形式加 入饲料中时是有活性的。这是基于体外研究，其中在100至300ppm 的剂量范围下分析了天然混合物的作用。
根据一个方面，本发明混合物中的柚皮苷含量为10％至25％重量， 优选15％至25％重量，更优选约20％重量。
根据第二个方面，本发明混合物中的苦味柑桔提取物含量为10％ 至65％重量，优选20％至60％重量，更优选约40％重量。注意到苦味的 柑桔提取物包括柚皮苷，因此本发明混合物中的柚皮苷总含量将高于 以上所示的含量。
根据第三个方面，柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的含量为 混合物重量的100％。
在第一个实施方案中，本发明涉及包含10％至25％重量柚皮苷、10％ 至65％重量苦味柑桔提取物和补足量至100％(混合物的补足)重量海 泡石的混合物在改善反刍动物中瘤胃发酵的用途。
在源自以上的实施方案中，混合物包含15％至25％重量柚皮苷、20％ 至60％重量的苦味柑桔提取物和补足量至100％的海泡石，更特别地为， 20％重量的柚皮苷、40％重量的苦味柑桔提取物和40％重量的海泡石。
以上所示的比例(％重量)是相对于混合物的总重。
在另一个实施方案中，使用以上混合物调节由给予浓缩食品定量 产生的微生物发酵过程。
在另一个实施方案中，使用以上混合物限制引起瘤胃酸中毒的细 菌(尤其是牛链球菌)的生长。因此，本发明还涉及以上的混合物用 于防止或治疗瘤胃酸中毒的用途，包括在此所述的急性和亚急性形式。
在另一个实施方案中，使用以上混合物优化反刍动物(尤其是牛) 集约肥育中的生产力。
在另一个实施方案中，以上混合物的使用包括将其以重量计的10 至2000ppm浓度的固体形式加入饲料中，尤其是50至1000ppm，更优 选100至300ppm。
类黄酮是一类水溶性的植物色素，对其的医学关注正在增长中。 柚皮苷是一种获自柑桔类水果(葡萄柚(Citrus paradisi)和苦橙 (Citrus aurantium)皮并在很大程度上引起其苦味的类黄酮，特别 是一种糖基化的黄烷酮。在果浆以及植物的叶、花和种子中也发现了 该物质。
一些研究表明和其他类黄酮相同，柚皮苷的生物合成受到环境和 遗传因素的影响，这些因素决定了这些化合物浓度水平的不同，估算 15至18g/kg新鲜葡萄柚皮为常见的浓度值。皮中的含量也是不同的， 未成熟的水果中高于成熟的水果。
柚皮苷用于香料中以及给糖果、饮料和焙烤制品增加风味，柚皮 苷还因为其抗氧化和抗诱变特性而得到使用，并且作为油稳定剂。
苦味的柑桔提取物可以通过本领域的常规操作(如提取、过滤、 浓缩、沉淀、澄清和最终的干燥)获自碾碎的柑桔类水果(尤其是苦 橙)。可以在二元的链烷醇/水系统中进行提取处理，其中链烷醇选自 甲醇、乙醇、丙醇等。优选使用甲醇。典型的苦味柑桔提取物将包含 31.5至71.5％重量的总类黄酮，例如45至55％重量(如果通过HPLC 测定)。特别地，类黄酮包括柚皮苷、新桔皮苷和枸桔苷。通常，总 类黄酮含量将包括(a)17.5至35.1％重量的柚皮苷，例如，25至27％ 重量，(b)7.7至16.9％重量的新桔皮苷，例如，11至13％重量和(c) 2.1至6.5％重量的枸桔苷，例如，3至5％重量。
随后，海泡石是天然的含水硅酸镁，其来源归功于海洋化石的石 灰质沉积。其是白色或淡黄色的粘土矿物。从远古时代开始就将其用 作粉末状牙膏。
将本发明的组合物应用于遭受瘤胃发酵下降或处于遭受瘤胃发酵 下降风险中的反刍动物。特别地，这些反刍动物包括：
1)饲喂高浓度(谷物)膳食的反刍动物，例如，用于改善饲料转 化率和避免酮症过程的出现，尤其是如果反刍动物为
a)在加强体系下肥育的动物；
b)当浓缩物供给达到最高比例时，处于泌乳高峰期的高泌 乳产量的雌性；或
c)带有超过一只小羊的沉重怀孕的母羊或山羊，其摄入能 力已经受到限制。
2)接受突然的膳食变化的反刍动物，尤其是该变化为
a)从牧场(高-粗粮)改变至高浓缩定量；或
b)从可消化性低的淀粉(高粱或玉米)改变至消耗性高的 (小麦或大麦)。
为了说明的目的，提供以下的实施例为更好地理解本发明。
实施例1：100和300ppm剂量的混合物在牛中的效果
基于Theodorou M K等，Animal Feed Science and Technology， 48(3)，p.185-197，1994年8月提出的实验方案，分析了发酵动力学。 所用的接种物是来自商业强化育肥操作的牛的瘤胃液体。将本发明的 混合物(20％重量柚皮苷、40％重量苦味柑桔提取物和40％重量海泡石) 接种接种物和以常用比例(80∶20浓缩物∶秸秆)补充谷物秸秆的商业 牛饲料(600mg)。在含有800ml接种物稀释物的密封瓶子中以两批(2 头牛)重复三份培养该混合物剂量。
测试持续48小时，在2、4、6、12、24、36和48h时记录瓶内的 压力。从压力值建立气体的产生。在培养10小时后，将一个瓶子分开， 并将其内含物取样，用于测定VFA和DNA分离，用于分子遗传测试。
通过DNA Stool Mini试剂盒(Qiagen Ltd，Carwley， West Sussex，UK)进行DNA提取。通过分光光度计测 定DNA浓度和纯度(总DNA)，在260和280nm处测量吸光度。
通过实时PCR使用ABI7000序列检测系统将细菌和牛链 球菌DNA定量，对总细菌(Maeda H等，FEMS Immunology andMedical Microbiology，39(1)，p.81-86，2003年10月)和牛链球菌(Tajima K等，Applied and Environmental Microbiology，67(6)，p.2766-2774， 2001年6月)使用了特定的引物。作为用于计算培养基中总细菌浓度 的参考，我们使用了通过瘤胃液体的差速离心(500g，10分钟，接着 20.000g，20分钟)获得的细菌样品的DNA浓缩物。使用Livak K J 等，Methods(圣地亚哥，加利福尼亚)，25(4)，p.402-408，2001 年12月所述的ΔΔCt表达，相对于总细菌的来表示牛链球菌的丰度。
通过DGGE使用特定的引物(Nübel U等，Journal of Bacteriology，178(19)，p.5636-5643，1996年10月)进行了细菌 生物多样性。电泳使用了8％丙烯酰胺凝胶，其具有50％-65％变性脲/ 甲酰胺梯度，在80V下持续16小时。使用Amersham Biosciences(瑞 典)试剂盒将凝胶染色，并且在扫描后，使用UPGMA(Unweighted Pair-Group Method Arithmetic averages)程序分析条带模式。
根据2×2(混合物×剂量)因子设计分析混合物对瘤胃发酵的效 果，考虑了将动物认为是实验模块。
结果
1.-气体产生
在之前所述的体外条件下，培养基中包含混合物对VFA产生或总 VFA产生的动力学没有效果。实验处理也没有影响最重要的VFA的摩 尔比例，其显示出60％醋酸、29％丙酸和9％丁酸的平均比例。
2.-通过PCR的实时细菌定量
表1显示了通过分光光度测定(260nm)获得的总DNA浓度，并且 我们可以看到培养基中的DNA浓度是怎样没有受到包含混合物改变 的。然而，通过更特异性的程序(实时PCR)的细菌DNA量的测定表 明混合物的包含使得细菌DNA明显增加，表明细菌生长增加。由于混 合物的存在引起的微生物生长的明显差异的存在(在气体(CO2+NH3) 产生或更高的VFA释放中没有发现所述差异)表明混合物对微生物合 成效率具有积极作用。
同一表格还显示了牛链球菌的特定DNA序列拷贝的浓度，已经鉴 定该细菌为乳酸的主要生产者之一，并因此涉及由瘤胃酸中毒引起的 状况。加入混合物使得培养基中该物种浓度得到非常明显的限制，所 述浓度表示为相对于细菌DNA拷贝总数的对应于牛链球菌(2(Δ Ct)*1000)的DNA拷贝的数量或相对于对照培养基的拷贝数量的百分 比减少(2(ΔΔCt))。
表1：通过实时PCR计算的培养基中的不同DNA类型的浓度；作
为细菌生物多样性指标的培养基中的DNA 16S拷贝数量
膳食 对照 混合物 显著性 剂量(ppm) 100 300 RSD 膳食 剂量 总DNA (μg/ml) 37.3 39.7 32.3 6.98 ns ns 细菌DNA (μg/ml) 8.19 24.3 21.5 2.75 0.0018 ns 牛链球菌 2(ΔCt)*1000 4.03 1.17 1.1 0.84 0.01 ns 牛链球菌 2(ΔΔCt) 0.31 0.29 0.14 ns DGGE N 15.50 15.0 15.9 1.44 ns ns
当我们分析混合物的剂量对以上参数的作用时，我们发现使用该 浓度的混合物没有显著的差异。因此，所获得的结果表明100和300ppm 的初始浓度超过了所述化合物对瘤胃发酵过程的活性极限。另一方面， 尽管研究混合物改变了牛链球菌的浓度，但其没有改变群体的生物多 样性。这证实了所述物质对某些微生物群的选择性作用。
3.-结论和优点
给研究混合物补充来自在商业强化育肥条件下给予的浓缩食物定 量的接种物使得瘤胃发酵过程产生了显著变化。
混合物的存在没有改变气体或VFA产生水平。然而，其对接种物 中的不同微生物群具有显著的作用。尽管促进了种群合成水平的显著 提高，但其显著抑制了牛链球菌生长。