技术领域
本发明涉及基于来源于西瓜苗的物质的加工食品和医药组合物。
背景技术
近年，豆芽、萝卜苗、苜蓿、西兰花芽、豆苗、红蓼(日文：紅タデ)等各种苗的功能性研究正大量进行。例如，报告了在苗中，发芽后维生素C的产生有助于增强抗氧化能力。
此外，在专利文献1中，公开了含有萝卜的种子或苗、基于其水、有机溶剂或有机溶剂和水的混合物的提取物、或者该提取物中含有的化合物或其衍生物作为有效成分的用于癌的预防的健康食品，含有生的萝卜苗汁、其浓缩还原汁或者萝卜的苗或种子的基于水、有机溶剂或有机溶剂和水的混合物的提取物作为有效成分的用于预防癌的健康饮料，以及含有萝卜的种子或苗、基于其水、有机溶剂或有机溶剂和水的混合物的提取物、或者该提取物中含有的化合物或其衍生物作为有效成分的用于癌的预防的医药组合物。
此外，专利文献2中公开了牛蒡苗中所含有的牛蒡子苷元抑制癌干细胞的产生。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2005-206495号公报
专利文献2：日本专利特开2014-224085号公报
发明的概要
发明所要解决的技术问题
如专利文献所示，已知苗在迄今已知的抗氧化作用以外，还显示出抗癌作用。在癌的治疗中，在外科治疗以外，还进行化学治疗。现在，正在开发被称为分子靶向剂的作用于细胞中的信号转导途径的药剂。但是，其副作用对患者而言不能说负担轻。因此，依然希望将副作用少、癌细胞的增殖抑制效果大的物质制成健康食品或医药组合物。
从苗这样的天然物中提取的物质虽然大多作用机理不明，但从至今为止的食用经验出发可期待其是副作用少的物质。但是，专利文献的来源于苗的物质没有报告对癌细胞的特异性的抑制作用。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明的发明人，在考察来源于苗的物质的效果时，发现来源于西瓜苗的物质可特异性抑制癌细胞的增殖，从而完成了加工食品以及医药组合物的发明。
更具体而言，本发明的医药组合物是将叶绿醇或叶黄素的至少一方作为主要成分的癌细胞增殖抑制剂。
此外，本发明的加工食品作为主要成分含有叶绿醇或叶黄素的至少一方。
发明的效果
用非极性溶剂对西瓜苗进行提取而得的物质特异性抑制癌细胞(特别是人白血病细胞)的增殖，对正常细胞几乎没有影响。此外，可知西瓜苗的非极性溶剂提取组分中，叶绿醇以及叶黄素也显示出特别大的贡献。因此，将叶绿醇或叶黄素的至少一方作为主要成分的加工食品或医药组合物(癌细胞增殖抑制剂)对癌的预防、或作为治疗药物是有效的。
附图说明
图1是表示西瓜苗的提取流程的图。
图2是表示进一步分离己烷组分的提取流程的图。
图3是表示西瓜苗乙醇溶出物对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响的图。
图4是表示西瓜苗乙醇溶出物的使用各种溶剂的细分离部分对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响的图。
图5是表示己烷溶出物对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响的图。
图6是表示西瓜苗-己烷溶出物处理对Jurkat细胞的细胞周期的影响的图。
图7是表示西瓜苗乙醇溶出物的使用各种溶剂的分离物质对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响的图。
图8是表示西瓜苗-己烷溶出物处理对正常淋巴细胞的增殖的影响的图。
图9是用蛋白质印迹法检出从用叶绿醇处理的Jurkat细胞的S期的细胞中提取的作为蛋白质的细胞周期蛋白A(CyclinA)的结果。
具体实施方式
以下示出本发明的实施例进行说明。另外，以下的说明例示了本发明的一实施方式以及一实施例，本发明不受以下的说明所限。以下的说明可在不脱离本发明的技术思想的范围内改变。
本发明的加工食品以及医药组合物中，作为主要成分，将叶绿醇或叶黄素的至少一方作为主要成分使用。此外，也可将西瓜苗的非极性溶剂提取组分作为主要成分。如后述的实施例所示，西瓜苗的非极性溶剂提取组分具有特异性抑制癌细胞的增殖的效果，这是由于在非极性溶剂提取组分中，叶绿醇和叶黄素也对该效果有很大影响。
另外，本说明书中，在西瓜苗的非极性溶剂提取组分、和叶绿醇、叶黄素以及它们衍生物汇总表示时，称为“本发明的效果成分”。此外，将本发明的效果成分具有的“特异性抑制癌细胞的增殖的效果”称为“本发明的效果成分所具有的效果”。
本说明书中，在加工食品或医药组合物中，“主要成分”含有可以确认本发明的效果成分所具有的效果的程度的量即可。即，也可含有具有本发明的效果成分所具有的效果以外的效果的成分。
<西瓜苗的非极性溶剂提取组分>
本发明中，西瓜是指学名Citrullus lanatus的、葫芦科的蔓生一年生草本植物。也可以是野生种。此外，也可以是品种改良后的。尤其，可合适地利用称为“祭ばやし777”(品种名)或“春のだんらん”(品种名)的品种。
西瓜苗是指使西瓜的种子发芽后的新芽。特别合适的是接种后10～20天的苗。在该发芽时，不照射日光，发芽后照射日光，进行培育。为了发芽，不使用水以外的养分，但发芽后施用含有氮、磷酸、钾等养分的液肥。发芽温度适合25℃～30℃。另外，也可使用作为苗收获、冷冻干燥后的产物。
采集的苗可使用根、茎、叶和全部的部分。尤其在叶的部分中，被认为是本发明的加工食品或医药组合物的有效成分的叶绿醇以及叶黄素多。
作为提取方法，可通过用非极性溶剂提取经过乙醇提取、水提取后的材料而得。作为可使用的非极性溶剂，可合适地利用丙酮、甲乙酮这样的酮类，乙醚等醚类，己烷、戊烷这样的脂肪族烃等。其中，可适合地使用己烷。
提取方法可经过清洗材料、进行破碎的前处理工序，和将破碎的材料浸渍在非极性提取溶剂中得到提取液的工序，和过滤提取液的工序而得。也可加入进一步干燥过滤液的工序。
如后述的实施例所示，在西瓜苗的非极性溶剂提取组分中，具有癌细胞的增殖抑制效果的是叶绿醇和叶黄素。这些物质在是这些物质本身、或衍生物的状态下都可发挥本发明的效果成分所具有的效果。
例如，植烷酸(C20H40O2；CAS登录号：14721-66-5)也可称为叶绿醇的衍生物。此外，认为将叶绿醇或叶黄素的羟基甲基化或甲氧基化而得的化合物也可发挥本发明的效果成分所具有的效果。
因此，也可在从西瓜苗提取本发明的效果成分的方法中，加入针对过滤后状态的化合物或来自干燥后的状态的提取物整体、得到衍生物的工序。
<叶绿醇和叶黄素>
叶绿醇(C20H40O；CAS登录号：7541-49-3)和叶黄素(C40H56O2；CAS登录号127-40-2)分别示于(1)式、(2)式。
[化1]
[化2]
如后述的实施例所示，在西瓜苗的非极性溶剂提取组分中，具有特异性抑制癌细胞的增殖的效果的是这2个物质，叶绿醇所发挥的效果尤其高。此外，认为它们的衍生物也显示出同样的效果，包括在本发明的效果成分中。
<加工食品>
本发明的加工食品作为主要成分含有本发明的效果成分。作为制成加工食品的形态，不仅有糖、饼干、曲奇、脆饼、面包、面条、鱼肉·畜肉泥产品、茶、清凉饮料、乳饮料、乳清饮料、乳酸菌饮料、酸奶、冰激淋等普通加工食品，也可包括软浸膏剂、干燥浸膏剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、片剂、液剂、浸剂、汤剂、含片、流浸膏剂、酊剂这样的浸膏剂或酒精饮料。
<医药组合物>
本发明的医药组合物作为主要成分含有本发明的效果成分。作为药剂的形态，包括胶囊剂、颗粒剂、溶液、乳浊剂、混悬剂、散剂、片剂、液剂、浸剂、汤剂、含片、流浸膏剂、酊剂、滴眼剂、滴鼻液、软膏、霜、洗剂、注射剂、栓药等。
这些制剂根据通常的方法在主要成分中使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浊剂、涂覆剂、稀释剂等在医药的制剂技术领域中通常可使用的已知的助剂来进行制剂。此外，本发明的医药组合物也可在本发明的效果成分以外含有其他药理活性成分。
固形的制剂例如为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、糖衣片等，可含有作为有效成分的本发明的效果成分、和稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉、马铃薯淀粉等)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、聚乙二醇等)、粘合剂(例如淀粉类、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、分散剂(例如淀粉、褐藻酸、褐藻酸盐等)、饱和剂、着色料、甜味料、湿润剂(例如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐等)等。这些可通过已知的方法、例如混合、粒状化、片剂化、糖衣化等方法进行制剂。
液状的制剂例如可制成糖浆、溶液、乳浊剂以及混悬剂的形态。混悬剂以及乳浊剂可作为载体含有例如天然橡胶、琼脂、褐藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等。
实施例
1.供试样品的制备
粉碎西瓜CS种苗3kg(湿重量)，在该粉碎物中加入5L乙醇，一边搅拌一边在常温下制备乙醇溶出物。重复该操作三次。溶出液使用旋转蒸发器在减压下进行浓缩干燥。
评价乙醇溶出物(EtOH Fr.)的Jurkat细胞增殖抑制能力后，再用蒸馏水再溶解该乙醇溶出物后，依次使用己烷(Hexane Fr.)、乙酸乙酯(EtOAc Fr.)、丁醇(n-BuOH Fr.)通过溶剂分配法制备各溶出组分以及蒸馏水溶解物(Water Fr.)。提取的流程图示于图1。
2.细胞培养
人白血病T细胞株Jurkat细胞从独立行政法人理化学研究所生物资源中心(筑波市，茨城县)获得。用含有10％胎牛血清(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientifics)，K.K.，美国马萨诸塞州)、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(均为生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)的RPMI1640培养基(和光纯药工业株式会社(和光純薬工業株式会社)，大阪市，大阪府)在37℃、95％空气-5％CO2环境下进行培养。
3.从西瓜苗乙醇溶液提取的各组分以及分离物质对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响
将Jurkat细胞调整为1×105个细胞/mL，在24孔板(赛默飞世尔科技公司)上以500μL/孔进行接种。接种后，分别进行处理，使得西瓜苗乙醇溶出物(EtOH Fr.)终浓度达到10、25、50、100、200、300μg/mL，己烷(Hexane Fr.)、乙酸乙酯(EtOAc Fr.)、丁醇(n-BuOH Fr.)以及蒸馏水溶解物(Water Fr.)终浓度达到25、50、100μg/mL，进行培养。在样品处理24、48、72小时后用台盼蓝(トライパンブルー)(生命技术公司)对细胞进行染色，使用血细胞计数板对活细胞进行计数。
4.细胞周期分析
将(已经调整为1×105个细胞/mL的)Jurkat细胞以每个孔3mL的方式接种在6孔板上，进行2小时的前培养。在2小时的前培养后，添加己烷组分以使终浓度达到10μg/mL，进行培养。培养12、24、48以及72小时后回收细胞，用PBS清洗2次后，加入70％乙醇，在-20℃下固定一晩。
第二天，以300×g对固定的细胞进行离心后，用PBS清洗细胞团块2次。清洗结束后，加入Muse(注册商标)细胞周期试剂盒(密理博公司(Millipore)，德国达姆施塔特)中含有的细胞染色试剂200μL，在室温避光环境下染色30分钟。之后，用Muse(注册商标)细胞分析仪(密理博公司)进行细胞周期分析。
5.从西瓜苗乙醇溶液提取的己烷组分对人正常淋巴细胞的影响
人正常淋巴细胞是通过Ficoll密度梯度分离法(Ficoll-paque PLUS,GE医疗集团英国有限公司(GE healthcare UK Ltd.)，英格兰)用人外周血制备的。调整为1×105个细胞/mL，在96孔板(赛默飞世尔科技公司)上以100μL/孔进行接种。接种后，对西瓜苗己烷溶出物进行处理，使得终浓度达到10μg/mL，进行培养。在样品处理48小时后用台盼蓝(生命技术公司)对细胞进行染色，使用血细胞计数板对活细胞进行计数。
6.效果成分的分离
分离己烷溶解物中的效果成分。流程图示于图2。将图1所示的己烷溶解物(Hexane Fr.)10g供至硅胶色谱法，用己烷(Hex)︰二氯甲烷(DCM)＝1︰1、1︰2、二氯甲烷、二氯甲烷︰乙酸乙酯＝5︰1进行洗脱，分为6个组分(Fr.1～Fr.6)。在图2中，示出为SiO2CC(Hex/DCM＝1/1→1/2→DCM→DCM/EtOAc＝5/1)。“SiO2CC”是硅胶色谱法。
对于6个组分，分别确认对Jurket细胞的效果，选择有效果的4个组分(Fr.2，Fr.3，Fr.5，Fr.6)。将该各组分进一步供至各种硅胶色谱法，分离4个化合物(叶绿醇、叶黄素、22-脱氢胆固醇以及亚麻酸)。
更具体而言，第2组分Fr.2进一步用己烷(Hex)︰氯仿(CHCl3)＝1︰1进行分离，得到叶绿醇(Phytol)。此外，第3组分用己烷(Hex)︰丙酮(Acetone)＝10︰1进行分离，得到22-脱氢胆固醇(22-Dehydrocholesterol)。
此外，第5组分用己烷(Hex)︰氯仿(CHCl3)＝1︰2进行分离，得到叶黄素(Lutein)。此外，第6组分最初用己烷(Hex)︰乙酸丁酯(EtOAc)＝1︰4进行分离，再用己烷(Hex)︰丙酮(Acetone)＝10︰3的溶液得到亚麻酸(Linolenic acid)。
7.用西瓜苗乙醇溶液提取的己烷组分对各种人癌细胞的增殖的影响
将人宫颈癌细胞株HeLa细胞、人肺泡基底上皮腺癌细胞A549细胞、人胃癌细胞株KATOIII细胞、人肝脏癌细胞株HepG2细胞分别调整至1×105个细胞/mL，在96孔板(赛默飞世尔科技公司)上以100μL/孔进行接种。接种后，添加己烷溶出物(Hexane Fr.)，以使终浓度达到2.5、5、10、25、50、100、200μg/mL，进行培养。
在样品处理24、48、72小时后去除细胞培养液，将10％的WST-1试剂置换为新鲜的培养基(Takara生物(Takara bio)，草津，滋贺)，培养45分钟。45分钟后，将50μL培养基移至新的96孔板，加入50μL的蒸馏水，测定440nm下的吸光度(A440)。用以下的式求出活细胞数(％)。
活细胞数(％)＝{(己烷处理后的癌细胞的A440)/(无处理的癌细胞的A440)}×100
<实验结果>
[西瓜苗乙醇溶出物对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响]
对Jurkat细胞进行处理，以使西瓜苗乙醇溶出物(EtOH Fr.)终浓度达到10、25、50、100、200、300μg/mL。结果示于图3。横轴为处理时间(小时)，纵轴为生存细胞数(105×个细胞/mL)。从处理48小时后起，与无处理组(符号000)相比，在300μg/mL处理细胞组(符号300)中确认增殖显著地被抑制。
[西瓜苗乙醇溶出物的使用各种溶剂的细分离部分对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响]
将浓缩干燥乙醇溶出物而得的产物用蒸馏水再溶解后，使用己烷(Hexane Fr.)(图4(b))、乙酸乙酯(EtOAc Fr.)(图4(c))、丁醇(n-BuOH Fr.)(图4(d))通过溶剂分配法制备各溶解物以及蒸馏水再溶解物(Water Fr.)(图4(a))。另外，这些溶解物也可称为提取组分。
任一图中横轴为处理时间(小时)，纵轴为生存细胞数(105×个细胞/mL)。使用这些处理Jurkat细胞，以使终浓度达到25、50、100μg/mL，24、48、72小时后对细胞进行计数。其结果是，确认己烷溶出组分(Hexane Fr.)(图4(b))中显著的增殖抑制能力。具体而言，相对于对照(符号000)，在加入己烷溶出组分24μg/mL以上的情况下，细胞数没有增殖。其他分离部分(图4(a)、(c)、(d))中几乎没有发现Jurkat细胞的增殖抑制。
[己烷溶解物对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响]
由于在己烷提取组分中发现对Jurkat细胞的强增殖抑制效果，因此降低己烷提取组分的浓度，考察对Jurkat细胞的增殖抑制效果。其结果示于图5。图5中，横轴为处理时间(小时)，纵轴为生存细胞数(105×个细胞/mL)。
图中的线分别为己烷溶解物的浓度为2.5μg/mL(符号2.5)、5μg/mL(符号5)、10μg/mL(符号10)、25μg/mL(符号25)、对照(符号000)。
参照图5，己烷提取组分依赖于处理浓度地抑制Jurkat细胞的增殖。10μg/mL处理(符号10)下，与25μg/mL处理(符号25)细胞相同，在48小时后Jurkat细胞几乎全灭。
[西瓜苗-己烷溶解物处理对Jurkat细胞的细胞周期的影响]
讨论己烷提取组分处理对于Jurkat细胞的细胞周期的影响。结果示于图6。图6(a)是Sub-G1期，图6(b)是G0/G1期，图6(c)是S期，图6(d)是G2/M期。各图中，横轴为处理时间(小时)，纵轴为相对于细胞数(总数)的计测比例(％)。
其结果是，令人感兴趣地，随着处理时间推进，G2/M期的细胞数减少，S期的细胞数增加。由该结果显示，己烷提取组分处理中，通过使Jurkat细胞的细胞周期在S期中停止来抑制增殖。
此外，对用己烷提取组分处理的Jurkat细胞进行赫斯特染色、碘化丙啶染色，进行镜检，几乎没有发现核和线粒体的崩坏。此外，提取的DNA的分解也几乎没有发生，认为不是坏死或细胞凋亡导致的。由以上，认为西瓜苗的己烷提取组分中，有诱导S期细胞周期停止的作用。
[西瓜苗乙醇溶出物的使用各种溶剂的分离物质对人白血病T细胞株Jurkat细胞的增殖的影响]
用制备型HPLC分离Hexane Fr.(己烷提取组分)时，作为主要的成分，检出了叶绿醇(phytol)、叶黄素(lutein)、22脱氢胆固醇(22-dehydrocholesterol)以及亚麻酸(linolenic acid)。使用这些成分，讨论Jurkat细胞的增殖抑制效果。用各个成分处理Jurkat细胞，使得终浓度达到10、25、50μM，在24、48、72小时后对细胞进行计数。
结果示于图7。图7(a)为叶绿醇，图7(b)为叶黄素，图7(c)为22脱氢胆固醇，图7(d)为亚麻酸。各图中，横轴为处理时间(小时)，纵轴为生存细胞数(105×个细胞/mL)。终浓度10μM用符号(10)、25μM用符号(25)、50μM用符号(50)、对照用符号(000)表示。
参照图7，在叶绿醇(图7(a))以及叶黄素(图7(b))中确认了显著的增殖抑制能力。另一方面，22-脱氢胆固醇(图7(c))以及亚麻酸(图7(d))中，几乎没有发现Jurkat细胞的增殖抑制。求出该叶绿醇以及叶黄素的Jurkat细胞的增殖抑制的IC50值时，分别为12.8μM以及22.6μM。
接着，考察Hexane Fr.(己烷提取组分)对正常淋巴细胞的影响。对正常淋巴细胞进行处理，使终浓度达到10μg/mL，讨论处理后72小时的细胞增殖抑制效果。结果示于图8。横轴为处理液的种类(CS Hexane Fr.和无处理)，纵轴为细胞增加率(％)。此处用相对于无处理的细胞增加数的百分比表示。在己烷溶出物处理的情况下(CS Hexane Fr.)，观察到的细胞增殖与无处理的情况几乎相同。该结果确认己烷提取组分对正常细胞没有增殖抑制效果。
[西瓜苗-己烷溶解物处理对各种癌细胞的增殖的影响]
通过WST-1法讨论各种癌细胞的增殖抑制效果时，得到如表1所示的IC50值。对癌细胞的感受性发现有一些差别，但提示对任一种癌细胞都显示出有效的效果。
[表1]
接着，进一步考察叶绿醇以及叶黄素的、对Jurkat细胞的增殖的抑制。Jurkat细胞的增殖抑制的原因是诱导细胞分裂中的S期细胞周期停止，如图6以及图7所示。然后进一步，考察叶绿醇诱导S期细胞周期停止的原因。具体而言，通过蛋白质印迹法，对于S期中的调节细胞周期的分子的蛋白质表达进行讨论。
其结果是，发现与DNA的复制相关的细胞周期蛋白A的表达量下降。细胞周期蛋白A的表达下降使从S期向G2期的转移停止。因此，认为基于叶绿醇处理的该细胞周期蛋白A的表达下降导致S期停止。
图9(a)是用蛋白质印迹法检出从用叶绿醇处理的Jurkat细胞的S期的细胞中提取的作为蛋白质的细胞周期蛋白A的结果。相对于叶绿醇处理的有(Phytol(+))、无((Phtol(-))，为细胞周期蛋白A(CyclinA)和β―肌动蛋白(β―Actin)的结果。
此外，图9(b)用图像分析软件imageJ进行图9(a)的蛋白质印迹的结果的背景校正，光密度分析后，求出相对于β-肌动蛋白的条带密度的细胞周期蛋白A的条带密度的比例。数据用将phytol(-)的值作为1时的phytol(+)的值进行评价，用平均+标准差(n＝5)表示。phytol(-)和(+)比较用Turkey-Kramer法检验(p<0.01)。
参照图9(a)，测定β-肌动蛋白的用意是作为内源性对照。β―肌动蛋白无论有无叶绿醇处理，都以相同的浓度检出。另一方面，对于细胞周期蛋白A，没有用叶绿醇处理的情况(Phytol(-))，比用叶绿醇处理的情况(Phytol(+))观测到更深的阴影。因此，可知进行叶绿醇处理者抑制了细胞周期蛋白A的表达。
由以上，可知叶绿醇抑制作为癌细胞的Jurkat细胞的细胞周期蛋白A的表达，因此诱导S期细胞周期停止。另一方面，由图8，叶绿醇对正常细胞没有增殖抑制效果。因此，可知叶绿醇具有选择性地仅抑制癌细胞的功能。
如上，西瓜苗的己烷提取组分有抑制各种癌细胞的增殖的效果。此外，可知其效果的主要的成分是叶绿醇和叶黄素。此外，这些成分(包含西瓜苗的己烷提取组分)对正常细胞没有抑制细胞增殖的效果。即，本发明的效果成分具有特异性抑制癌细胞的增殖的效果。这意味着可提供副作用少的抗癌用医药组合物。
产业上利用的可能性
本发明的效果成分可适合地制成具有癌预防或癌治疗效果的加工食品或医药组合物。