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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810567200.3 (22)申请日 2018.06.05 (71)申请人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 肖波 陈秋冰 罗理勇 曾亮 汪敏 (51)Int.Cl. A61K 9/127(2006.01) A61K 36/82(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 133/00(2006.01) (54)发明名称 一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的 制备及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种新型天然茶。
2、树花衍生脂 质纳米囊泡的制备及其应用。 该纳米囊泡是从茶 树花中通过多次离心的方式提取, 可作为一种天 然可食用的纳米药物用于治疗疾病。 通过对纳米 囊泡进行一系列表征显示, 该纳米囊泡粒径较为 均一, 为131.61.6 nm, 色谱分析显示该纳米囊 泡天然负载着多种儿茶素成分。 通过将不同浓度 梯度的纳米囊泡与多种恶性肿瘤细胞共培养显 示, 该纳米囊泡可以有效地抑制乳腺癌、 结肠癌、 非小细胞肺癌以及宫颈癌等癌细胞的增殖, 表现 出良好的抗癌效果和广谱抗癌性能。 目前对于茶 树花的衍生药物制剂及商业化开发并未引起科 研人员及医药公司的广泛关注, 因此该发明有力 地证明了茶树花有着很好的药物。
3、应用前景。 权利要求书1页 说明书3页 附图4页 CN 108653209 A 2018.10.16 CN 108653209 A 1.一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 包含以下步骤: (1) 将新鲜茶树花组织放至榨汁机中搅拌破碎, 得到组织原浆; (2) 将步骤 (1) 得到的组织原浆在4oC条件下离心, 保留组织上清液; (3) 将步骤 (2) 收集得到的组织上清液在4oC条件下离心, 保留沉淀, 并用磷酸缓冲液重 悬, 得到重悬液; (4) 将步骤 (3) 收集得到的重悬液进一步进行蔗糖梯度离心, 其中蔗糖浓度分别为8%、 30%、 45%和60%; (5) 收集。
4、30%和45%之间的天然茶树花脂质纳米囊泡 (TFNPs) ,洗涤三次后重悬至PBS中, 放至-80oC长期保存。 2.根据权利要求1所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (2) 中离心转速为600025000 rpm, 离心时间为15 h。 3.根据权利要求1所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (3) 中离心转速为5000080000 rpm, 离心时间为15 h。 4.根据权利要求1所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (4) 中离心转速为5000080000 rpm, 离心时间为。
5、15 h。 5.根据权利要求2所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (2) 中离心速率为20000 rpm, 离心时间为3 h。 6.根据权利要求3所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (3) 中离心速率为65000 rpm, 离心时间为3 h。 7.根据权利要求4所述的一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备, 其特征在于: 所述步骤 (4) 中离心速率为65000 rpm, 离心时间为3 h。 8.根据权利要求1-7所述的制备方法得到新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡。 9.由权利要求8所述的新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡。
6、在恶性肿瘤治疗中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108653209 A 2 一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备及其应用 技术领域 0001 本发明涉及茶学、 药剂学、 药理学及生物纳米材料等领域, 具体涉及一种新型天然 茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备、 表征其在恶性肿瘤治疗中的应用。 背景技术 0002 茶树花, 作为茶树重要的组成部分, 内含多种活性有机物质, 被视为一种天然的中 药材。 但由于人们对茶树花了解不深, 重视程度远低于茶叶, 进而导致其尚未得到有效的开 发和利用。 自2002年徐纪英老师首次提出 “茶树花资源的综合利用” 这一理念以来, 人们逐 渐开始对。
7、茶树花开展一系列的研究。 目前已有的研究结果表明, 茶树花有着与茶叶类似的 生化成分, 包括茶多酚、 蛋白质、 维生素类、 咖啡碱、 多糖、 黄酮类、 超氧化物歧化酶和过氧化 氢酶等。 其中, 茶多酚作为一种常见的抗氧化物质, 被诸多研究人员证明其有很好的抗癌性 能。 茶树花中茶多酚含量较多, 尤以儿茶素占到了很大的比例, 高达约70%, 由EGCG、 ECG、 EC 等多个单体组成。 在我国传统医学学说中,“药食同源” 理论一直被大家沿用至今, 茶花作为 一种可食用性、 抗氧化活性表现良好的天然材料, 有着巨大的临床药用潜能。 0003 近几年, 研究人员发现, 新鲜植物中普遍存在着一种天然。
8、脂质纳米囊泡, 其内部包 含有许多不同种类的有机小分子、 核酸等活性物质, 可以作为一种很好的纳米药物用于部 分疾病的研究。 相较于目前热门的纳米药物而言, 天然脂质纳米囊泡有着更好的生物相容 性, 免去了纳米粒子制备过程中有机溶剂的使用, 克服了纳米药物无法大批量生产等问题。 2013年, 美国Huang-ge Zhang 课题组首次从葡萄柚中提取得到一种脂质纳米囊泡, 该种纳 米囊泡可以装载不同抗体或核酸等治疗分子用于肿瘤等疾病的治疗 (X . Hou et al.Biomaterials 2017: 124; 195-210) 。 随后, 该课题组又证实葡萄中同样存在着类似结 构的物质,。
9、 可以有效地治疗由葡聚糖硫酸钠诱导的急性溃疡性结肠炎疾病(S. Ju et al.Mol. Ther. 2013: 21; 1345-1357)。 最近, Huang-ge Zhang 课题组和美国Didier Merlin 课题组均从生姜中得到了类似的纳米脂质囊泡, 分别用于酒精引起的肝病、 急性结 肠 炎 、 慢 性 结 肠 炎 和结 肠 癌的 治 疗 , 均 有 着良 好的 治 疗效 果 (M . Z ha ng e t al.Biomaterials 2016: 101; 321-340. M. Zhang et al.Mol. Ther. 2016: 24; 1783- 1796. 。
10、X. Zhuang et al.J. Extra. Ves. 2015: 4; 28713.)。 发明内容 0004 鉴于此, 本发明的目的在于从新鲜茶树花中提取一种天然脂质纳米囊泡, 该纳米 囊泡天然装载多种儿茶素成分, 表现出较好的抑制肿瘤细胞增殖的能力, 可用于多种恶性 肿瘤的化学治疗。 0005 本发明的技术方案具体如下: 一种新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡的制备方法包括以下步骤: (1) 将新鲜茶树花组织放至榨汁机中搅拌破碎, 得到组织原浆; (2) 将步骤 (1) 得到的组织原浆在4oC条件下离心, 保留组织上清液; 说 明 书 1/3 页 3 CN 108653209 A 3 (。
11、3) 将步骤 (2) 收集得到的组织上清液在4oC条件下离心, 保留沉淀, 并用磷酸缓冲液重 悬, 得到重悬液; (4) 将步骤 (3) 收集得到的重悬液进一步进行蔗糖梯度离心, 其中蔗糖浓度分别为8%、 30%、 45%和 60%; (5) 收集30%和45%之间的天然茶树花脂质纳米囊泡 (TFNPs) ,洗涤三次后重悬至PBS中, 放至-80oC长期保存。 0006 进一步, 所述步骤 (2) 中, 离心速率为600015000 rpm, 离心时间为15h。 0007 优选的, 所述步骤 (2) 中, 离心速率为20000 rpm, 离心时间为3h。 0008 进一步, 所述步骤 (3) 。
12、中, 离心速率为5000080000 rpm, 离心时间为15h。 0009 优选的, 所述步骤 (3) 中, 离心速率为65000 rpm, 离心时间为3h。 0010 进一步, 所述步骤 (4) 中, 离心速率为5000080000 rpm, 离心时间为15h。 0011 优选的, 所述步骤 (4) 中, 离心速率为65000 rpm, 离心时间为3h。 0012 采用由上述任一所述方法制备新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡。 0013 采用由上述任一所述方法制备的新型天然茶树花衍生脂质纳米囊泡在恶性肿瘤 治疗中的应用。 0014 相对于现有的技术, 本发明的优点在于: (1) 本发明是从新鲜。
13、可食用植物茶树花中提取, 取材简单且成本低廉; (2) 本发明通过将天然茶树花脂质纳米囊泡与多种恶性肿瘤细胞共培养发现, 其对多 种肿瘤细胞均呈现出良好的抑制其增殖的能力, 具有很好的广谱抗癌性能; (3) 本发明的提出, 可以有助于我们对茶树花进行更进一步的研究与开发, 有着很大的 经济和临床转化意义。 附图说明 0015 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚, 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述, 其中: 图1为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡的制备过程及作用机理示意图。 0016 图2为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡的平均粒径大小及粒径分布; 图3为本发明实。
14、施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡内含物成分的高效液相色谱分析结 果图 图4为本发明实施例1中天然茶树花脂质纳米囊泡对MCF-7细胞、 CT-26细胞、 A549细胞、 Hela细胞的体外毒性结果图。 具体实施方式 0017 以下将参照附图, 对本发明的优选实施例进行详细的描述, 但不用来限制本发明 的范围。 0018 实施例1 (1) 将新鲜茶树花组织放至榨汁机中搅拌破碎, 得到组织原浆; (2) 将上述得到的组织原浆4oC条件下20000 rpm离心3 h, 保留组织上清液; (3) 将上述收集得到的组织上清液4oC条件下65000 rpm离心3 h, 保留沉淀, 并用磷酸 说 明 书 2/3。
15、 页 4 CN 108653209 A 4 缓冲液重悬; (4) 将上述收集得到的重悬液进一步进行蔗糖梯度离心, 其中蔗糖浓度分别为8%、 30%、 45%和60%, 离心参数为4oC条件下65000 rpm离心3 h; (5) 收集30%和45%之间的天然茶树花脂质纳米囊泡 (TFNPs) ,洗涤三次后重悬至PBS中, 放至-80oC长期保存。 0019 图1为天然茶树花脂质纳米囊泡的制备过程及作用机理示意图。 0020 试验1: 取50 L 天然茶树花脂质纳米囊泡贮存液稀释至1 mL, 使用动态光散射 粒度仪 (DLS) 分析其平均粒径大小及粒径分布。 0021 图2为天然茶树花脂质纳米囊。
16、泡粒径分布结果图, 结果显示脂质纳米囊泡粒径均 一, 平均粒径为 131.6 1.6nm。 0022 试验2: 为了探究天然茶树花脂质纳米囊泡内容物的成分组成, 我们对其进行了高 效液相色谱分析。 0023 图3为天然茶树花脂质纳米囊泡内容物的成分分析图, 结果显示茶树花脂质纳米 囊泡中负载了EGCG、 ECG、 EC等儿茶素成分。 0024 试验3: 天然茶树花脂质纳米囊泡治疗恶性肿瘤的效果 图4为将不同浓度的天然茶树花脂质纳米囊泡与多种恶性肿瘤细胞 (MCF-7细胞、 CT-26 细胞、 A549细胞、 Hela细胞) 共培养多个时间点 (24h、 48h、 72h) , 结果显示茶树花脂。
17、质纳米 囊泡具有很好的体外抑制恶性肿瘤细胞增殖的能力, 且具有很强的时间独立性、 浓度独立 性以及抗癌广谱性。 0025 最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说 明 书 3/3 页 5 CN 108653209 A 5 图1 说 明 书 附 图 1/4 页 6 CN 108653209 A 6 图2 说 明 书 附 图 2/4 页 7 CN 108653209 A 7 图3 说 明 书 附 图 3/4 页 8 CN 108653209 A 8 图4 说 明 书 附 图 4/4 页 9 CN 108653209 A 9 。