技术领域
本申请涉及用于治疗微生物感染的抗微生物组合物。具体而言，该组 合物可以用于治疗细菌感染，或用于控制细菌污染，这避免了抗生素的使 用。此类感染包括乳腺炎、肺结核、囊性纤维化和其他肺感染，以及在诸 如医疗器械之类的表面上形成的生物膜所导致的污染。而且，所述的组合 物还适用于治疗病毒、酵母菌或真菌感染，或者用于控制此类有机体的污 染。
背景技术
乳腺炎为奶牛及其他产奶动物的乳房的持续炎性状况。其是美国奶牛 的最普通的疾病之一，并且也是乳品工业代价最高的。当通常响应于乳头 管中细菌的入侵而使得白细胞被释放到乳腺中时，形成乳腺炎。由患有乳 腺炎的奶牛得到的牛奶具有更高的体细胞计数，并且体细胞计数越高，则 牛奶的品质越低。
乳腺炎的常规治疗是使用抗生素，但是经过抗生素治疗的奶牛的牛奶 是不可销售的，直到药品离开奶牛的系统为止。使用的抗生素可以是系统 性的并被注入到肌体内，或者可以通过乳房内输注迫使它们通过乳头管进 入到乳头中。乳腺炎可以是临床的，由此感染的可见迹象被记录；或者可 以是亚临床的，其中感染的存在仅记录为所得牛奶中的体细胞计数的增 加。在一些临床情况中，通常使奶牛保持未治疗的，但是通过为牛奶所付 的钱数的减少而使得奶农的收益受损失，这种情况在牛奶中体细胞计数的 增加的情况下发生。
本发明的抗微生物组合物具有多种其他的用途。这些用途包括哺乳动 物的肺的感染。囊性纤维化和肺结核为目前极难治疗的两种疾病。
肺结核的症状是由于肺内感染所导致的，并需要长期抗生素治疗。囊 性纤维化（CF）为这样的状况，其中患者，特别是在肺内，不能调节氯离 子的跨膜转移。这种状况总是导致多种慢性的肺感染。抗生素对所述的两 种状况的治疗可以导致严重的抗药性，从而降低它们的效力。目前，抗生 素通过静脉血流、或者通过口服混悬剂/片剂、或者通过吸入来传递。由于 抗生素不能高效地横向穿过肺膜而达到其所需要地方，所以药品的传递是 CF患者的一个大问题。这导致了这样的问题，其中抗药性（通过引入亚抑 制浓度）可能成为严重的问题。在药品被废弃的情况下，上述情况要进行 任何其他的治疗。
烧伤患者或具有开放伤口的患者特别容易细菌感染，尤其是由于细菌 的金黄色葡萄球菌菌种或假单胞菌菌种所导致的那些。此类感染的治疗通 常通过口服或静脉内的抗生素规则。它们可以prophalactically给与，或者 在感染明显时给与。抗生素的此类用途通常导致抗药性及无效治疗结果。 研究者展望使用本发明的技术来治疗烧伤患者的新方法。
此外，每年大量抗生素治疗是由于医疗器械在患者使用时被污染的结 果。多种有机体是造成此类感染的原因，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细 菌。在诸如尿导管或静脉内导管之类的此类部件上，无菌安装此类器械的 结果通常是污染。经过多天后，在所述器械表面上存在的任何细菌细胞将 增殖，从而导致生物膜的形成。由于药品跨越生物膜团块的内部细胞的转 移较差，导致生物膜对抗生素的耐受水平甚至更高，使得此类生物膜极难 使用抗生素来处理。就患者的不适而言，污染的医疗器械通常需要被取走 及替换。虽然污染通常在医疗器械被安装后的多天后才被记录，但是其通 常是在安装的极早期存在细菌的结果。
公知的是细菌抑制作用是由于在过氧化氢与硫氰酸盐之间通过乳过 氧化物酶催化的反应（被称为乳过氧化物酶(LP)系统的过程）所导致。在 某些情况下，过氧化物源为葡萄糖与葡萄糖氧化酶之间的反应，其导致葡 萄糖酸和过氧化物的生成。该过程在牛奶的运输过程中使用。基于LP系 统，建议用于控制感染的抗细菌处理。例如，PCT申请WO2008/04128公 开了具有抗微生物和免疫刺激作用的制备物，其包含氧化还原酶、用于生 产过氧化氢的该酶的合适的底物、以及内源的过氧化氢制备物。该制备物 产生了2个阶段的过氧化氢的释放；内源形式的过氧化物确保具有即刻可 用的过氧化氢，并且通过氧化还原酶生产其他的过氧化氢。
美国专利No.6312687描述了用作抗微生物组合物的稳定的水性酶浓 缩物，其包含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱金属卤化物盐以及缓冲剂。 美国专利No.5607681描述了抗维生素组合物，其包含碘化物阴离子和硫 氰酸根阴离子、以及D-葡萄糖、和葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶及至少一 种抗氧化剂。该组合物可以额外包含乳过氧化物酶。牛奶中LP系统的细 菌抑制作用的建议基础是基于硫氰酸盐和过氧化氢源。在过氧化氢存在 下，硫氰酸根离子被乳过氧化物酶氧化，从而生产次硫氰酸。在某些实施 方案中，过氧化物离子由葡萄糖通过葡萄糖氧化酶的作用而非使用过氧化 氢溶液或由合适的过氧化氢过水合物（例如过碳酸钠）的释放来生产。本 申请提出使用其他的底物来帮助实现所述的反应，从而通过补充的酶催化 手段来生产过氧化氢。过氧化氢对细菌和哺乳动物细胞是毒性的，而次硫 氰酸与细菌蛋白质中的游离巯基反应，从而使多种代谢的酶失活。
文献中的一致结论教导，LP系统主要对过氧化氢酶阳性革兰氏阳性细 菌具有细菌抑制作用，而且教导对一些革兰氏阴性细菌具有pH依赖的杀 菌作用（Wofson and Sumner,1993,"Antibacterial activity of the lactoperoxidase system:a review"Journal of Food Protection1993, 56(10):887-892;Kussendrager and van Hooijdonk,2000"Lactoperoxidase: physico-chemical properties,occurrence,mechanism of action and applications",British Journal of Nutrition,84,Suppl.1,S19-S25;Seifu et al, 2005"Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications:a review",Trends in Food Science&Technology16, 137-154）。精确的机制为保持未解决的LP系统的抗微生物性质提供了基 础。在文献中报告的试验方案大幅改变，并且许多作者报告了细菌的抑制， 但是在一段特定的时间后会再生长，并由此得到生物抑制而非杀灭生物的 作用（例如Ishido et al."Continuous supply of OSCN-ions by lactoperoxidase system developed from Lactose as the primary substrate and its anti-bacterial activities",Milchwissenschaft,661,2011）。此外，文件还提出了使用LP系 统的杀细菌活性，而且报告了甚至在高LP浓度下，在测试后仍保持大量 的培养细胞（例如Garcia-Garibay et al,1995,Antimicrobial effect of the lactoperoxidase system in milk activated by immobilised enzymes"Food Biotechnology,(3),157-166）。如本申请中其他处所讨论，在培养基中提供 的或者在LP反应过程中生产的过氧化氢对细菌细胞是毒性的，直到进行 特定的控制，所述的过氧化氢有助于所报告的抗微生物活性。此外，现有 技术公开了多种据报告有协同作用的化合物，其被提出会增强或者确实能 够具有LP系统的效力。此外，美国申请号2011/0008361Al提出所述的提 取的阳离子级份（包含LP）的抗微生物作用为免疫刺激的组合，其有助于 明确感染并定向抗微生物活性。
系统性信息的缺乏（关于影响LP系统的抗微生物作用的精确因素） 是商业化应用的障碍—在敏感性环境（例如哺乳动物的肺）下，所述的系 统潜在地具有过氧化氢毒性。
尽管广泛描述了LP系统，但是本领域的技术人员认为其为用于治疗 细菌感染的无效系统（Rainard&Riollet2006,"Innate immunity of the bovine mammary gland",Veterinary Research37,369-400;Sakai et al.,2008, "Generation of hydrogen peroxide by a low molecular weight compound in whey of Holstein dairy cows",Journal of dairy Research,75,257-261;Sakai et al.,2008,"Production of hydrogen peroxide by a small molecular mass compound in milk from Holstein cows with high and low milk somatic cell count",Journal of Dairy Research,75,335-339）。LP及相似系统的有力且有 效的杀灭细菌能力的缺乏是此类应用的显著障碍。目前基于LP系统的商 业化应用包括漱口剂、牙膏、食品防腐剂和消毒剂，其主要基于微生物生 长的抑制而非细胞的杀死以及由各种环境下得到的细菌菌群的完全消除。 例如，所提交的关于乳过氧化物酶系统的专利（美国专利号4726945和US 5607681）用于局部治疗，并且主要的设计方式为减少所存在的细菌的生 长（在溶液中，例如离子乳液，或者粉刺或运动员足部的治疗；或者实际 上在动物饲料中作为预防剂）。
本发明的抗微生物物质的光谱且大量潜在的目标不可能诱导抗性基 因的增殖。由于药物组合物的成分可以在哺乳动物肌体内天然生产（例如 通过中间体，例如硫氰酸盐、乳过氧化物酶、葡萄糖），所以药品反应也 不是问题。对药品的反应是目前的问题，20%的患者对β-内酰胺药品有反 应（"Rapid de-sensitization for non-immediate reactions in patients with cystic fibrosis",Whitaker et al.,2011,Journal of Cystic Fibrosis,10(4):282-5）。
Ishido et al.（Milchwissenschaft,Vol.66,No.1,2011）描述了乳过氧化 物酶系统，其包含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、乳糖和 硫氰酸钾作为试剂，据说该试剂是抗细菌的。在所有的情况下，乳糖存在 于组合物中。但是，所述的文件仅描述了细菌的生长抑制，并且未进行超 过48小时的分析。此外，该文件陈述，对革兰氏阴性细菌E.coli和肺炎 克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、以及革兰氏阳性菌种木糖葡萄球菌（S. xylosus）、粪肠球菌（E.faecalis）,屎肠球菌（E.faecium）以及棉子糖肠 球菌（E.raffinosus）不具有抑制作用。在文件中，结果被标记为“生长抑 制”时间，测试时间不超过12小时。总之，该文件由此描述了细菌抑制 作用而未描述杀菌作用。
Garcia-Garibay et al.（Food Biotechnology,9(3),157-166(1995)）描述 了β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶在生牛奶中生产过氧化氢从而减少牛奶中 不需要的微生物有机体的用途。仅在24小时内，再次实施测试，由此呈 现显示微生物有机体的数量减少的数据仅表明细菌抑制作用。
Sandholm et al.（J.Vet.Med.B35,346-352(1988)）描述了葡萄糖氧化 酶用作乳头或乳房内杀菌剂的抗细菌试剂。
美国专利No.5607681描述了抗微生物的组合物，其包含碘离子和硫 氰酸根离子、氧化还原酶及其相应的可氧化底物、以及乳过氧化物酶。该 文件仅描述了在至多72小时内对细菌的活性，并未描述该系统的治疗应 用。
本发明提出了由现有技术转变的范例。其描述了用于治疗感染的广谱 的真正的杀菌剂。
·本发明显示由LP系统或通过其他手段生产的活性氧物质（ROS）事 实上根据浓度依赖的剂量应答，在多种培养基及跨越大范围的pH和温度 下，为大量的致病革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的杀细菌剂（参见发明详 述）。我们还显示，ROS能够完全杀死在多种表面上的生物膜中生长的细 菌和真菌。
·在一系列详细的受控的试验中，已经显示该杀细菌活性由于ROS的 作用而是独特的，并且就这一点而言，在不具有残余的过氧化氢存在并且 缺乏任何其他的协同试剂（例如乳铁蛋白、季铵化合物、脂肪酸等）下， ROS是有效的（参见发明详述）。
·可以与用于抗生素和其他抗微生物治疗试剂相同的方式，计算在特 定的环境中完全杀死特定的细菌菌群所需的ROS浓度，并用于生成精确的 剂量应答/最低抑菌浓度信息（参加发明详述）。
·给药这些剂量水平的ROS物质可以用于完全杀死多种革兰氏阴性 和革兰氏阳性细菌病原体，包括由牛乳房和哺乳动物的肺分离的那些；作 为附着在多种表面上的生物膜生长的那些；由患者分离的那些；以及对多 种抗生素具有抗性的那些（参见发明详述）。
·此外，还显示，可以例如在牛乳房中使用LP系统，在治疗位点处 生成所需的ROS的杀细菌及治疗浓度，或者可以在外部，在感染位点处制 备ROS物质，并在缺乏允许成功治疗并消除细菌感染的任何其他活性组分 下进行传递。
因此，本技术提供了在例如医疗器械的表面上限制微生物感染和生物 膜生长的独特方式。
发明目的
本发明的第一目的为提供用于治疗微生物感染的经改善的组合物。另 一个目的为提供能够杀死细菌、病毒、真菌和酵母菌（与延缓细菌、病毒、 真菌和酵母菌的生长相对）的组合物。另一个目的为提供能够杀死对抗生 素具有抗性的有机体的组合物。
乳腺炎
另一个目的为提供在未使用抗生素的条件下用于治疗临床和亚临床 乳腺炎的组合物。本发明的另一个目的为提供对乳腺炎的治疗，其无需在 治疗过程中将牛奶丢弃。
本发明的另一个目的为提供容易给药的乳腺炎的临床溶液。在上文所 讨论的现有技术中，所述的反应如下：如果将所有的成分混合在一起，则 反应立即发生，由此得到短的货架期。在现有技术中，必须具有在给药所 述产物之前进行混合的2种等分液，由此开始反应。另一个缺点为这样的 事实：葡萄糖的浓度总是为限定因素。为了在临床情况下具有足够的葡萄 糖，必须加入浓缩的来源。这导致了溶解度的问题。此外，加入外源葡萄 糖还可以在牛奶的下游处理中产生问题，并且还可以导致消费者关于消费 用牛奶的风味和甜味的问题。
本发明人检验了牛奶本身的特征，以试图回避葡萄糖给药的需要。牛 奶为乳糖来源。Β-半乳糖苷酶被分解并将二糖转化为其构成成分（葡萄糖 和半乳糖）的酶。由此，酶的使用依赖于牛奶本身的重要构成成分，从而 开发LP系统在感染位点处生成活性氧物质的能力。当所述的系统直到葡 萄糖存在时才发生反应时（并且直到Β-半乳糖苷酶与牛奶接触时，才生成 葡萄糖），则使用所述的酶使得给药所述的混合物更加容易。这比在使用 前不得不给药葡萄糖或者实际上的合适的单糖或二糖更有用，从而无需使 用浓缩的且有问题的糖溶液。
肺的感染
本发明的另一个目的为治疗大量的其他的细菌感染。药品的传递以及 对抗生素的抗性为治疗囊性纤维化（CF）和肺结核（TB）的主要问题。 抗生素抗性通常在仅有亚抑制浓度的药品到达目标位点（即，肺）时发生。 这种情况通常导致慢性感染，严重的损害了患者的健康。肺的成分的理想 传递为喷洒喷雾，从而直接进入肺。这具有这样的优点：所述的成分在正 确的位点处并且在正确的浓度下与有机体直接相互作用。如果所述的成分 以口服给药或者通过血流给药，则需要更高的浓度来得到相同的效果。当 使用抗生素时，这导致使用高浓度的药品，增加了抗性的几率或者与药品 的反应。由于本系统的成分天然存在于哺乳动物系统（或者在饲料中规律 使用）中，所以与它们的反应是极不可能的，这是在药品反应是通常的情 况下使用抗生素进行治疗的优点。在患有CF的患者中，在肺中，硫氰酸 盐的天然水平由于膜中水的调节失败而减少，从而降低了器官中天然发现 的乳过氧化物酶系统的效力。外部加入对诊断患有CF的人propylactically 作用的或者用于治疗已经发展成肺感染的患者的活性氧物质。此类喷洒喷 雾具有在医院使用的潜力，从而减少手术过程（其中肌体腔对环境是开放 的并处于风险下）中的感染，特别是由对抗生素具有抗性的细菌菌株所引 起的那些感染。
烧伤/皮肤/口
所述技术的合适目标的其他感染为烧伤或开放性伤口引起的那些。就 药品反应、安全、效力和抗性而言，使用所述的系统高于目前抗生素治疗 方案的优点与治疗CF或TB中上文所述的那些相似。本发明人显示活性 氧物质在治疗生物膜基的细胞（附着于固体层的那些）中是有效的。这为 大多记录于TB/CF患者的肺、开放性伤口或烧伤中的细菌表现型。这种表 现型赋予细菌以对抗多种抗生素的广泛的抗性（"Antibiotic resistance of bacteria in biofilms",Stewart&Costerton,2001,The Lancet,358,135-138）。
此外，就多数目的而言，所述系统的形式还起到一般抗细菌溶液的作 用。例如，包含抗细菌系统的漱口剂有助于防止生物膜在口内形成。同样， 抗细菌的鼻洗剂可以用于帮助减少窦道问题，例如鼻窦炎或敏感性鼻炎。 目前，使用类固醇和含盐的鼻洗剂。此外，抗细菌的含盐洗剂还有助于与 鼻腔内的细菌菌落战斗。
医疗器械
此外，使用活性氧物质（例如通过卤代过氧化物酶基系统生成的那些） 在治疗和预防植入医疗器械上的细菌感染中具有多个优点。感染（对抗性 的生物膜形式）在多种器械（例如导管）中是特别普通的。浸渍或涂敷多 种酶的器械能够与血液中天然存在的底物反应。
一般的抗细菌洗剂
本发明的另一个目的为提供一种组合物，其用作用于多目的产物的一 般的、安全的抗细菌洗剂。所提出的系统在洗涤/除去表面、管、啤酒管线、 烹饪器材等的细菌中是有效的。
抗真菌试剂
感染可有由于酵母菌或真菌的生长以及细菌的生长而发生。如此，能 够发挥抗微生物活性（与抗细菌活性相对，其为使用抗生素的情况）的治 疗方案是非常有利的。最后，针对值得注意的2种真菌菌株测试活性氧物 质（次碘酸盐）的抗微生物活性（下文的实施例18）。真菌的假丝酵母菌 株通常描述为机会病原体。它们可以导致多种皮肤状况，例如外阴阴道炎 和尿路感染。它们在HIV患者和其他免疫系统损伤的患者中是普遍的。酿 酒酵母（Saccharomyces cerevesiae）（通常称为酵母菌或烘焙者酵母菌）为 食品生产中的重要有机体。此外，其为饮品工业提出了大问题，其为在啤 酒管线中发现的典型有机体，并且为饮料腐败的原因。如此，本发明的抗 微生物活性氧物质为治疗或控制真菌感染或清除表面从而消除真菌污染 的良好的治疗候选物。
此外，本发明发现了作为抗病毒试剂的用途。
发明概述
根据本发明，提供了杀灭微生物的组合物，其包含能够生产反应性物 质的活性氧物质或成分，该组合物在24小时的时间内能够传递活性氧物 质至至少0.4毫摩尔/升的水平。该组合物在24小时的时间内能够传递活 性氧物质至至少0.5毫摩尔/升、至少0.6毫摩尔/升、至少0.7毫摩尔/升、 至少0.8毫摩尔/升、至少0.9毫摩尔/升、至少1.0毫摩尔/升、至少2.0毫 摩尔/升的水平。
所述的活性氧物质可以通过过氧化物酶、用于过氧化物酶的底物以及 过氧化氢的反应来生产。
就杀灭微生物而言，我们是指能够杀死诸如细菌、病毒、真菌和酵母 菌之类的微生物的组合物，这与简单的延缓它们的生长相对。杀灭微生物 的组合物能够杀死在其所施加的环境中存在的至少90%、优选为至少95%、 更优选为至少99%、更优选为至少99.99%的微生物。
此外，所述的组合物能够杀死抗生素抗性有机体。
所述的组合物的活性氧物质可以包含卤代硫氰酸盐（也称为亚硫氰酸 盐，SCNO—）。
此外，所述的组合物的活性氧物质还可以包含次碘酸盐（IO—也称为 次碘酸盐）
此外，所述的组合物的活性氧物质还可以包含次氯酸盐（ClO—）。
在另一个方面中，本发明提供了杀灭微生物的组合物，其额外包含过 氧化物酶和氧化还原酶。该组合物特别适用于治疗囊性纤维化或肺结核患 者的感染、烧伤受害者或者具有插入的医疗器械的患者。
在另一个方面中，本发明提供了杀灭微生物的组合物，其额外包含过 氧化物酶、氧化还原酶以及糖苷水解酶。该组合物特别适用于治疗乳腺炎 感染。
此外，所述的组合物还可以包含用于过氧化物酶的底物。
过氧化物酶可以为卤代过氧化物酶。该卤代过氧化物酶可以为乳过氧 化物酶、氯代过氧化物酶、溴代过氧化物酶或碘代过氧化物酶。合适的氯 代过氧化物酶包括髓过氧化物酶和嗜曙红细胞过氧化物酶。合适的溴代过 氧化物酶包括卵过氧化物酶、钒溴过氧化物酶和Murex snail bromoperoxidase。合适的碘代过氧化物酶包括辣根过氧化物酶和甲状腺过 氧化物酶。
如果使用乳过氧化物酶，则所述的组合物可以进一步包含碘化钾或碘 化钠、或者硫氰酸钾或硫氰酸钠作为底物。氯代过氧化物酶与牛奶、血液 等中容易利用的氯离子反应，这样不必总数添加氯离子。如果使用溴代过 氧化物酶或碘代过氧化物酶，则底物可以为分别为溴离子或碘离子的来 源。
卤代过氧化物酶与可利用的过氧化氢以及合适的底物（碘化物/溴化物 /氯化物或硫氰酸盐）反应，从而生产抗细菌的反应性物质。糖苷水解酶可 以为β-半乳糖苷酶，其将牛奶中随意可得的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖。
氧化还原酶可以为葡萄糖氧化酶，其与所得的葡萄糖反应，从而生产 过氧化氢。相似地，还可以使用半乳糖氧化酶，从而与半乳糖反应，由此 生产过氧化氢。
优选地，所述的组合物可以进一步包含二糖。该二糖随后可以被其相 应的糖苷水解酶水解，例如蔗糖和蔗糖酶，从而允许单糖的释放，通过使 用相应的氧化还原酶，上述过程由此可以起到额外的过氧化氢的来源的作 用。
此外，可以加入包含多于2个糖分子、并且被分解生成过氧化氢来源 的寡糖或多糖。
在一些实施方案中，所述的组合物包含传递过氧化氢来源的2种酶； 将二糖分解成构成成分的单糖的糖苷水解酶；以及与单糖反应从而释放过 氧化氢的其他的氧化还原酶。
所述的组合物可以包含额外的过氧化氢来源。一种额外的过氧化氢来 源为外源加入过氧化氢溶液，或者通过合适的过氧化氢过水合物（过碳酸 钠）释放。
备选地或者此外，多种酶可以用于生产过氧化氢。黄嘌呤氧化还原酶 /氧化酶与次黄嘌呤或黄嘌呤（均存在于牛奶中）反应，从而生产过氧化氢。 因此，可以将黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶和/或黄嘌呤加入到所述的组合物 中，从而生产过氧化氢。相似地，糖醇可以与它们的合适的氧化酶反应， 从而生产过氧化氢来源。例如，甘油氧化酶与甘油反应，从而生产过氧化 氢来源，因此，可以将甘油氧化酶/甘油加入到所述的组合物中。另一个实 例为甘露醇与甘露醇氧化酶反应。此外，已知柠檬酸会释放过氧化氢，并 由此还可以将其加入到所述的组合物中。相似地，L-氨基酸氧化酶为与游 离的氨基酸（也存在于牛奶中）反应的酶，从而生产过氧化氢。相似地， 该氨基酸的加入（具有或不具有L-氨基酸的补充）可以提供过氧化氢的来 源。
本发明的方面证明在牛奶中具有特别有效的抗细菌品质，其中本发明 提供了杀灭细菌的组合物，其额外包含过氧化物酶、氧化还原酶以及糖苷 水解酶（具体为β-半乳糖苷酶）。具体而言，所述的系统在高水平的生物 负荷下，有效地完全杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体（即，消除108—10细胞/ml）。根据现有技术，当WHO陈述乳过氧化物酶系统在生牛奶中 主要发挥细菌抑制作用、并且在缺乏冰箱的条件下在生牛奶的运输过程中 仅适用于通过此类手段在短期内限制细菌的生长时，本发明为惊人的发现 （Report of an F AO/WHO Technical Meeting FAO Headquarters,Rome,Italy, 28November-2December2005）。其他研究者推论所述的系统中的任何杀灭 细菌的活性均是由于过氧化氢成分，并且乳过氧化物酶系统为细菌抑制的 （Thomas et al.,1994,"Antibacterial activity of hydrogen peroxide and the lactoperoxidase-hydrogen peroxide-thiocyanate system against oral streptococci",Infection and Immunity,Vol.62,No.2,p529-535）。
β-半乳糖苷酶与牛奶中存在的乳糖反应，从而生产葡萄糖和半乳糖。 所得的葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应，从而生产过氧化氢。该过氧化氢与碘 化钾/硫氰酸钾反应，从而产生抗细菌的作用。抗细菌作用是由乳过氧化物 酶促进的，所述的乳过氧化物酶催化碘化物及其他合适的底物的过氧化。
依赖于牛奶中固有的乳糖可以取消高浓度葡萄糖溶液的使用，该溶液 为内外情况中的限定因素，从而可以现场使用所述的产物。
在本发明的另一个方面中，提供了用于治疗感染或污染的组合物，其 包含黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶。所述的组合物可以进一步包含次黄嘌呤和 /或黄嘌呤。此外，所述的组合物还可以包含氧化还原酶、糖苷水解酶或二 糖。
在本发明的另一个方面中，提供了用于治疗感染或污染的组合物，其 包含L-氨基酸氧化酶。所述的组合物可以进一步包含游离的氨基酸。此外， 所述的组合物还可以包含氧化还原酶、糖苷水解酶或二糖。
本发明的组合物的一个潜力在于治疗牛（或其他哺乳动物）乳腺炎。 其可以用于治疗临床及亚临床乳腺炎，并提供这样的优点：无需除去由大 池塘得到的经治疗的牛奶。在所提出的溶液中存在的酶是安全的，并且潜 在的底物（包括碘化钾或硫氰酸钾）在使用浓度下是安全的。所述的组合 物不可能诱导对抗生素的抗性，这为另一个优点。此外，在2005年11月 22日-12月2日在Rome,Italy举办的FAO/WHO技术会议的报告表明乳过 氧化物酶系统不会将非正常代谢物的物质引入到牛奶中。
使用生产本发明的杀灭生物的活性氧物质的酶提供了在一段时间内 连续生产组合物的手段，其在与抗生素治疗时是有利的，其中必须另外加 入新的分子，从而补充抗微生物的活性。
适用于治疗乳腺炎的一种产物为加载7-10mL溶液（通过补充胶质来 增加其粘度）的乳房内输注传递器械（可任选地提供为双桶注射器），其 中所述的溶液包含2mg葡萄糖氧化酶（-200单位/mg）、0.5mLβ-半乳糖苷 酶（>2,600单位/mg）、4mg乳过氧化物酶（>80单位/mg）、以及100-150mg 碘化钾，从而用于生产杀灭细菌的活性氧物质，以治疗乳腺炎。
其他的制备物可以将酶保持为在使用前与底物的溶液混合的冻干粉， 由此有助于在不可能冷藏的情况下的反应物的货架期。可以根据动物（羊 等）的重量、牛奶的生产情况以及感染乳房中生物负荷的水平来生产其他 相似的产物。此外，尤其适用溴化物/硫氰酸盐替代碘化物、使用不同的氧 化还原酶、或者补充不同的过氧化氢的可能来源、或者使用黄嘌呤氧化还 原酶（包含黄嘌呤氧化酶的复合酶）或L-氨基酸氧化酶（氧化还原酶家族 的成员）方法来制备多种成分的不同组合。备选产物涉及使用任何其他的 酶来替代乳过氧化物酶，其中所述的任何其他的酶与过氧化氢及合适的底 物反应，从而生产抗微生物物质。其中，氯代过氧化物酶适用于加载7-10mL 溶液（通过补充胶质来增加其粘度），其中所述的溶液包含2mg葡萄糖氧 化酶（-200单位/mg）、0.5mLβ-半乳糖苷酶（>2,600单位/mg）以及50μl 氯代过氧化物酶（>11，100单位/ml）。
在多种配制物中，之前已经描述了乳过氧化物酶系统（美国专利号 US4726948和US5607681）。World Health Organisation（2005年11月28 日-12月2日FAO/WHO Technical Meeting FAO Headquarters,Rome,Italy的 报告）建议在缺乏冷藏的第三世界国家，所述的系统用作增加牛奶的寿命 的方法。WHO建议使用过碳酸钠作为过氧化氢来源的系统。在此提出的 本发明的一个方面不同于已知的LP系统，不同之处在于本发明使用了过 氧化氢的备选来源，前体是牛奶中存在的乳糖依次分解。此外，备选方法 是使用氯代过氧化物酶替代乳过氧化物酶，其中所述的氯代过氧化物酶与 牛奶中已经存在的盐反应，从而消除了向乳房中补充卤化物的需要。本发 明这一方面的任一种形式（如过氧化物酶/氯代过氧化物酶）提供了由于现 有制备物的优点，其在于这两种形式直到向乳房给药前都不会开始反应。 各种形式在4℃下均具有长的货架期。WHO讨论了在它们所述的LP系统 的对应物中存在的大量问题，而这些问题在本文所述的本发明的方面中不 会发生。WHO提出的系统将香包形式的硫氰酸盐和过碳酸盐粉末传递至 牛奶。粉末状的硫氰酸盐为吸湿性的，并且经过一段时间会降解，并且过 碳酸钠作为过氧化氢来源可以导致氧的形式，这会使香袋破裂及破坏。
本文所描述的本发明改善了Kussendrager and van Hooijdonk,2000所 述的乳过氧化物酶系统（Lactoperoxisdase:physico-chemical properties, occurrence,mechanism of action and applications.British Journal of Nutrition, 81,519-525）。在治疗乳腺炎时，其使用了牛奶本身的重要组分—乳糖，从 而驱动反应物生产特定需要浓度的杀灭细菌的活性氧物质，从而消除感 染。与过碳酸钠相对，补充2种酶（β-半乳糖苷酶及葡萄糖氧化酶）允许 缓慢持久地释放可以连续地生产受控水平的杀灭细菌试剂所需的过氧化 氢。由于在所提出的环境下的乳糖的可用性，过氧化氢在反应中不会成为 限定因素。相对少量的β-半乳糖苷酶证明与补充的大量葡萄糖同样有效。
本发明改善了在哺乳动物中天然发现的乳过氧化物酶系统，这是由于 该系统调节了存在的过氧化氢的水平（以及实际上任何其他的成分）。在 典型的感染过程中，过氧化氢的水平被细菌的触媒活性所抑制，由此降低 了该系统的效力。过氧化氢的可用性低导致很多研究者认为乳过氧化物酶 系统的抗微生物本性是“可疑的”（Rainard&Riollet2006,"Innate immunity of the bovine mammary gland",Veterinary Research37,369-400;Sakai et al., 2008,"Generation of hydrogen peroxide by a low molecular weight compound in whey of Holstein dairy cows",Journal of dairy Research,Journal of Dairy Research,75,257-261;Sakai et al.,2008,"Production of hydrogen peroxide by a small molecular mass compound in milk from Holstein cows with high and low milk somatic cell count",Journal of Dairy Research,75,335-339）。
使用黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶、或者L-氨基酸氧化酶作为过氧化氢 来源的本发明的实施方案改善了所述的技术，既无需补充糖（使用牛奶本 身的构成成分），也不会改变牛奶的风味（就其甜味而言）。
与乳过氧化物酶系统有关的提交的专利（US4726945和US5607681） 用于局部治疗，并且主要设计为减少存在的细菌的生长的方式（在溶液中， 例如离子乳液，或者粉刺或运动员足部的治疗；或者实际上在动物饲料中 作为预防剂）。本发明提供了作为抗生素方案的备选方案来治疗“全面” 细菌感染的新手段。使用本发明，在其多个方面（在体外及体内）中，已 经显示出高水平的杀灭细菌的活性。
技术上的改变，即，用于生产杀灭细菌的活性氧物质所使用的酶和底 物的类型，可以用于治疗其他类型的细菌感染。
根据本发明的抗微生物的鼻洗剂产物包含所述的系统的所需的成分。 这些成分包括合适的过氧化物酶，例如乳过氧化物酶或氯代过氧化物酶； 合适的底物（例如碘离子、硫氰酸根离子或氯离子）。相似地，可任选地 通过单糖及其分解酶（例如葡萄糖和葡萄糖氧化酶）、或过氧化氢释放分 子（例如过碳酸盐或柠檬酸）来提供过氧化氢来源。这些成分和底物可以 以存在于香袋中的盐的干粉/冻干的酶的形式补充，所述的盐的干粉/冻干 的酶可以在使用前再水合。使用盐水溶液（或者将额外的氯化钠加入到香 袋中）可以调节所需的盐度。相似地，使用过碳酸钠可以调节酸性。干粉 形式的系统可以允许产物保持货架期，减小产物的体积从而仅需要水来 “活化”所述的系统。
用于治疗CF/TB的组合物可以为通过喷洒喷雾手段传递至肺的溶液， 其可以将本发明的所需的成分（乳过氧化物酶或氯代过氧化物酶、所需的 底物(硫氰酸盐/氯化物)以及过氧化氢来源(葡萄糖及葡萄糖氧化酶；或者其 他可行的酶方法，例如黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶及次黄嘌呤/黄嘌呤、或 者L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸；或者通过加入过水合物，例如过碳酸钠； 或者通过直接加入过氧化氢溶液)）传递至肺。可以通过分离某些成分来实 现溶液的储存，从而确保反应仅在传递至肺时发生。如此，一种溶液可以 包含卤代过氧化物酶和葡萄糖，并且可以与包含底物和葡萄糖氧化酶的另 一种溶液混合。这些成分的混合将开始反应，从而生产高度抗细菌活性的 物质，该物质可以以给定的量通过喷洒器传递至肺。
可以根据人类的肺来调整各成分的浓度，而且可以为与上文所述的用 于乳腺炎治疗的那些同样可能的最大级别。相似地，相同的整体传递机制 可以用于一般的抗细菌咽喉喷雾，其无需喷雾。
通过本发明高效地根除生物膜细胞的能力（参见本发明实施例3的详 细描述）赋予了超过目前使用的抗微生物治疗的显著改善，已知目前使用 的抗微生物治疗在治疗肺的囊性纤维化感染中是无效的，这是因为假单胞 菌菌株表现出对抗生素更高的耐受性（"Differences in biofilm formation and antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from airways of mechanically ventilated patients and cystic fibrosis patients",Fricks-Lima et al., 2011,International Journal of Antimicrobial Agents,37(4),309-315）。
此外，本发明的一个实施方案还提供了治疗烧伤患者的新方法。使用 能够生产抗微生物物质的酶（尤其是卤代过氧化物酶，例如乳过氧化物/ 氯代过氧化物酶；以及氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶）浸渍的膏状药可 以浸于凝胶基溶液中，所述的溶液包含生产抗细菌化合物所需的组分；潜 在的底物，尤其是碘化物/硫氰酸盐/氯化物；以及与氧化还原酶反应的单 体，尤其是葡萄糖。可以将该膏状药放置于所需的伤口上，从而允许安全 地释放高度抗细菌的化合物，由此保持组织修复所需的安全需氧环境。
此外，各成分的浓度可以与上文所述的用于治疗乳腺炎的浓度相似。 可以通过改变氧化还原酶和糖，通过其他酶反应（L-氨基酸氧化酶和L-氨 基酸、黄嘌呤氧化还原酶/氧化酶以及黄嘌呤/次黄嘌呤），通过加入诸如过 氧酸钠之类的过水合物，或者直接加入过氧化氢溶液来使用生产过氧化氢 的备选方法。
使用了卤代过氧化物酶基系统的本发明的实施方案还可以用于改善 医疗器械的物理性质，从而限制在植入患者的过程中引起感染的几率。该 方法是安全的，限定了药品的反应或抗性，而这通常是使用抗生素会产生 的情况。所需的酶（乳过氧化物酶或卤代过氧化物酶，以及氧化还原酶、 葡萄糖氧化酶和/或额外的地位）浸渍在器械的表面上是可行的传递方法。 通常，驱动反应所需的底物（尤其是葡萄糖和硫氰酸盐/氯化物）存在于血 液、唾液、牛奶和尿中，由此反应在酶和/或额外的底物的缓慢释放时发生。 酶的缓慢释放可以通过电荷手段将它们锚定/涂敷在表面（浸渍的可生物降 解的聚合物形式）上来进行。当聚合物降解时，新的酶分子是游离的，从 而与通过器械上的底物反应。在浸渍后，在最初数天内这些酶的稳定释放 将在重要的机会窗口（其中感染/生物膜通常会形成）保持器械的无菌。
可以通过将2种溶液（或可行的，将它们的干粉溶于水中）混合来生 产一般的抗细菌溶液。例如，可以通过将过氧化物酶（例如氯代过氧化物 酶或乳过氧化物酶）、合适的底物（可任选地盐形式，例如碘化钠/硫氰酸 钠/或氯化钠）以及过氧化氢（廉价来源可以包括柠檬酸、过碳酸盐、过氧 化氢本身、或与合适的酶发生反应的糖以及合适的酶，例如葡萄糖和葡萄 糖氧化酶）的粗来源混合来制备抗细菌溶液。本发明的这一方面可以通过 混合溶液中的各成分来活化。可以将溶液传递至需要清洁的表面。此类实 例包括啤酒管线、陶瓷表面、金属表面等，并且可以在医院、工厂、厨房 等地使用。所述的溶液可以是相对无毒的，并且不会生产与许多清洁产物 （例如漂白剂）有关的气味。此外，诸如乳铁蛋白之类的蛋白质可以补充 至所述的系统中，从而增加效力。已知乳铁蛋白有助于使细菌生物膜破裂， 并由此可以起到强调产物的抗微生物本性的作用。
同样，所提出的组合物可以在给药感染位点之前预制备或活化。
发明详述
实施例1
通过向7mL无菌水中加入150mg碘化钾、4mg乳过氧化物酶（>80 单位/mg）以及2mg葡萄糖氧化酶（-200单位/mg）来生产抗微生物组合物。 该实施方案被称为“KI-Dose-150”。相似地，使用150mg硫氰酸钾制备组 合物，并且该组合物被称为“Thio-Dose-150”。使用双倍稀释96孔板生长 测试基方法来测定这些组合物的抗微生物性质。将组合物的等分液加入到 包含107-8个细菌细胞的150μl生长培养基（存在有1-2%葡萄糖）中，并 使最终体积为300μl。通过除去150μl混合物来双倍稀释组合物的浓度，并 转移至包含150μl相同的生长培养基的下一个孔中，其中所述的培养基缺 少生产ROS的成分。在595nm下，在24小时内测量培养基的光学密度。 完全抑制细菌所需的浓度为在24小时后在培养基中不会出现可见的生长 迹象的组合物的使用浓度。对照包括这样的孔，其中未补充所述的组合物， 或者其中一种成分由所述的组合物中除去。该方法用于测定所述的组合物 对抗多种微生物有机体的抗微生物效力，其中所述的微生物有机体尤其为 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、 绿脓杆菌（Psuedomonas aeruginosa）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepaciae）、Streptococcus dysglactiae、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、 非溶血大肠杆菌。这些有机体通常被描述为多种感染的病原体（causative agent），其中所述的感染尤其为牛乳腺炎、囊性纤维化肺感染、皮肤感染、 烧伤感染等，并由此代表了将使用所述的组合物来进行治疗的多种有机 体。有机体对组合物的相对易感性在表1中有所描述（比例表示组合物的 最低稀释，在该稀释条件下没有生长被记录，例如1:800是使组合物被稀 释至这样的当量：每800μl生长培养基有1μl的组合物），并且为组合物抑 制生长的最低浓度。此外，还提供了经过24小时生产的抗微生物活性氧 物质（ROS）的估计水平（也参见以下实施例19）。
表1.细菌菌株对“Thio-Dose-150”和“KI-Dose-150”的易感性。MIC 表示活性氧物质的水平，低于该水平时，未记录有杀灭细菌的作用（经过 24小时生产的，单位为毫摩/升）。
实施例2
已经根据乳过氧化物酶系统的细菌抑制或抑制质量对其进行了讨论。 以更大的规模实施实施例1中所述的方案（将最初的500μl KI-Dose-150或 Thio-Dose-150的等分液加入到包含测试有机体的10mL生长培养基中，并 双倍稀释）。在温育48小时后，通过将接种的肉汤在琼脂平板中进行亚培 养来研究所述系统的杀灭细菌的质量。如果在新鲜的琼脂平板上亚培养之 后的24小时后（即，在暴露于抗微生物组合物后的72小时）回收的细胞 不超过0.0001%，则对于细菌菌株而言，所述的组合物在特定的浓度下似 乎是杀灭细菌的。所述的组合物在可取的感染治疗的浓度下对各种测试菌 株是可杀灭细菌的（其中记录有抑制的最低稀释示于上表1中）。
实施例3
显示过氧化氢来源的选择可以影响LP系统，并且还可以影响基于 ROS的、生产杀灭细菌浓度下的抗微生物组合物的能力。将营养肉汤的等 分液（20ml）接种E.coli ATCC25922的108个细胞，并将150μl的接种肉 汤加入到96孔板的孔中。使用接种肉汤重复上述过程，其中所述的接种 肉汤培养基中进一步补充有LP（37.5μl4mg/ml溶液）和KI（75μl40mg/ml 溶液）。
将过氧化氢来源加入到孔1（150μl）中，并双倍稀释至孔11，但是不 稀释至孔12，孔12作为对照。过氧化氢来源如下：
·包含40μl H2O2的5ml水（30%w/v）；
·包含50mg过碳酸钠的5ml水；
·5ml葡萄糖（20%）+47μl葡萄糖氧化酶（2.5mg/ml，200单位/mg）。
图1示出，1:8和1:16稀释的H2O2溶液会抑制E.coli，但是1:32 稀释的H2O2溶液不会抑制。在补充的KI和LP存在下，上述测试的重复 不会减弱直接使用H2O2所观察到的作用，并且1:32稀释仍不会抑制细菌 （图2），但是在这种情况下，H2O2的水平在温育过程中会显著降低。这 是由于补充的LP会使用可利用的过氧化物来催化活性氧物质的生产（使 用补充的KI作为底物）。
向接种肉汤中加入过碳酸钠溶液所引起的抑制模式（图3）与直接加 入H2O2后观察到的抑制模式一致。清楚的是，就抑制而言，当使用过碳 酸钠作为过氧化氢来源时，在补充KI和LP之后（图3和4），上述二者不 存在差异，但是过氧化物已经用于在温育过程中生产毒性低的活性氧物质 次碘酸盐。
清楚的是，所加入的仅1:2和1:4稀释的葡萄糖/葡萄糖氧化酶溶液会 产生足量的H2O2来进行抑制（图5），但是在1:8(部分)、1:16或1:32 稀释下则不会。而且，清楚的是在KI和LP存在下重复葡萄糖/葡萄糖氧 化酶测试（图6）时，与在缺乏加入的KI和LP下所取得的抑制相比，前 者在更高的稀释程度下发生E.coli的抑制（至多并包括1:32稀释）（图5）。
该结果清楚地表明酶生产大幅低于抑制细菌的水平的过氧化氢足以 驱动抑制浓度的抗微生物活性氧物质的生产。这提供了在未积累潜在毒性 H2O2的条件下传递治疗剂量的抗微生物活性氧物质。
实施例4
一定量的牛奶（10mL）接种E.coli，并补充乳过氧化物酶、葡萄糖氧 化酶、碘化钾和β-半乳糖苷酶作为生成本发明的抗微生物组合物的机制。 浓度为3.75mg/L葡萄糖氧化酶（-200单位/mg）、12mg/L乳过氧化物酶 (>80单位/mg)、120mg/L碘化钾/硫氰酸盐、以及400ml/Lβ-半乳糖苷酶(> 2,600单位/ml)或更高足以观察到抗细菌活性。在最优浓度下，这些混合物 证明致死至多108个细胞/ml的E.coli（将所述的溶液在新鲜琼脂平板上亚 培养得到不可回收的细胞）。
同时存在的阴性对照（排除了多种成分的一种成分）使得牛奶中在超 过24h的时间内细菌数量增加。按照这种方式生成的组合物在最初的2小 时高效地工作，从而消除细菌。
涉及制备物以用于通过乳房内输注方法来治疗牛乳腺炎。实施现场试 验（6只奶牛，6个处所），其中挤奶后，在4种场合下治疗奶牛，其中所 述的挤奶具有通过酶系统生产的提出的杀灭细菌的组合物（在这种情况 下，使用β-半乳糖苷酶牛奶的活化作为本发明的目的）。每个剂量的制备 物包含乳过氧化物酶(4mg>80单位/mg)、葡萄糖氧化酶(2mg,-200单位 /mg)、β-半乳糖苷酶(0.4ml,>2,600units/ml)以及碘化钾(150mg)。治疗 结果为动物的体细胞计数记录为显著减少，记录为治疗后5至30天。由 该试验得到的结果如下表所列（表2）—农场C和D。
表2.治疗动物的体细胞计数
进行测定牛奶巴斯德消毒法对酶成分的作用的尝试，其中所述的酶成 分可以用于生产本发明的组合物的活性氧物质。将50μl体积的工作浓度的 酶加热至72℃，并保持15、30、60、300或600秒。
然后，将合适浓度的这些等分液转移至包含系统的必需成分以及～108个细胞/ml E.coli的牛奶中。在37℃下温育24hr后进行活菌计数。这允许 测定所述的酶在加热后是否仍是有活性的。葡萄糖氧化酶证明，其如同乳 过氧化物酶，在300秒的加热后是具有活性的。但是，加热过程损害了β- 半乳糖苷酶的活性，并且典型的巴斯德消毒法周期（72℃，15秒）完全使 酶失活。这表明在牛奶（酸奶和奶酪）的后处理中使用的细菌起始物培养 物不会受到所使用的所述制备物的抑制，其中所述的制备物会生成本发明 活性氧物质。
10mL体积的牛奶用作测试所述的假设的模型，其中所述的假设为： 使用氯代过氧化物酶替代乳过氧化物酶，来生成抗微生物活性氧物质。牛 奶的E.coli会再次尖峰化（～107个细胞/ml）。向牛奶中补充合适浓度的β- 半乳糖苷酶（2-3μl，>2,600单位/ml）和葡萄糖氧化酶（15μl2.5mg/ml溶 液，-200单位/mg）。然后，加入氯代过氧化物酶制备物（0.5μl，>11,100 单位/ml），并在37℃下在24小时内完全消除E.coli。对照试验（不具有一 种酶或2种酶）会在相同的温育条件下增殖细菌的数量（108-9个细胞/ml）。
实施例5
使用补充的葡萄糖基的酶系统来实施现场试验，从而生产活性氧物 质，并评估该方法生产抗微生物试剂的效力。2天内，使用提供的系统每 天2次处理一些奶牛（8）。这些奶牛证明使用测量细菌加载的替代方法， 奶牛的体细胞计数显著减少（参见表3的农场A和B，5天后50%的地区， 然后对于农场B，在过5天后，体细胞计数相似的减少，其中随后的数据 是可利用的）。这证明乳过氧化物酶系统在未使用β-半乳糖苷酶的条件下 在生成抗微生物物质中的效力，从而确保所述的系统为用于生成杀灭细菌 的物质的可行来源。
表3.使用了生产抗微生物活性氧物质的葡萄糖补充系统的治疗动物的体 细胞计数。
实施试验来测定所提出的组合物消除生物膜基细菌细胞的能力。使用 2种培养计数来实施上述试验。使用恒化器建立E.coli的连续培养。该系 统被设计为允许操作者具有控制有机体的生长速率的能力。大部分的感染 是由于缓慢生长的细胞所导致（由于有限的营养可用性）。该表现型在细 胞对抗微生物的耐受性方面具有作用，并且为更现实的宿主环境。此外， 这些培养物用于在Modified Robbins Device上生长生物膜，其中，允许所 述的细胞在聚亚胺酯试样的表面上附着并增殖。这些细胞共有在乳腺炎、 CF/TB肺、伤口、烧伤以及医疗器械的典型感染中记录的生物膜细胞的表 现型，并以相似的方式应答，并且提供用于抗微生物测试的可行模型。
使用乳过氧化物酶基系统，通过在37℃下将试样在所述的溶液中浸没 24-48小时来在测试试样上生产抗微生物的物质，其中所述的细胞包含乳 过氧化物酶(2mg/L,>80单位/mg)、碘化钾,(300mg/L)、葡萄糖(12.5g/L) 及葡萄糖氧化酶(0.57mg/L,>200单位/mg)。此外，使用缺乏一种成分的 系统的盐水溶液或混合物处理对照试样。
然后，通过超声手段由试样的表面上回收细胞，并测定它们的生存能 力。仅使用盐水处理的细胞是可行的（105个细胞/试样），该细胞为使用缺 乏生产抗微生物物质所需的一种成分的系统测试的那些。在细胞暴露于由 全功能LP系统生产的抗微生物物质的试样上未回收到可行的细胞。该结 果可以与之前报告的使用多种抗生素的相似的治疗方案媲美（"Linezolid compared with eperezolid,vanocmycin,and gentamicin in an in vitro model of antimicrobial lock therapy for Staphycoccus epidermidis central venous catheter-related biofilm infections",Curtin et al,2003,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Vol.47,No.10,p3145-3148），其中在使用10g/L庆大霉 素处理10天后以及使用10g/L万古霉素处理7天后仍回收到细胞，但是针 对利奈唑胺和依哌唑胺记录到更好的结果。该浓度比对以浮游方式生长的 相同的菌株致死的浓度更高（至多1000倍）。相比之下，在现有试验下生 成的抗微生物物质的浓度与用于杀死浮游生物细胞的浓度为相同的数量 级。
实施例7
使用实施例1中所述的方法测试一些绿脓杆菌菌株对KI-Dose-150组 合物的易感性。这些菌株是受到关注的，因为它们证明对多种重要的抗生 素的耐受性增加，其中所述的抗生素通常用于治疗与囊性纤维化有关的肺 感染的，并由呈现肺感染的囊性纤维化患者的痰回收到所述的菌株。相对 易感性如表4中所述。由表4显而易见的是，绿脓杆菌的抗生素耐受菌株 不再耐受KI-Dose-150，表明当所述的系统被传递至肺时在治疗此类感染 时是有效的。“S”表示敏感，“R”表示抗性或耐受性增加。
表4.抗生素耐受的绿脓杆菌菌株对“KI-Dose-150”的易感性。MIC值表 示杀死所述菌株所需的最低水平的活性氧物质（次碘酸盐）（经过24小时 生产的，单位为毫摩/升）。
阿米卡星 托普霉素 环丙沙星 庆大霉素 MIC PA001（野生型） s s s s 0.25mM R550/20129026 R R R R 0.12mM R468/20129027 R s s s 0.06mM R479/20129028 R R s R 0.12mM R480/201209029 R s R R 0.12mM 绿脓杆菌D12 s s R s 0.25mM
实施例8
通常，使用口服或静脉内药品传递通过抗生素治疗呼吸感染。此外， 气溶胶形式的抗生素可以用于抵消药品由血液穿过肺泡达到感染位点的 较差的转移。使用AeroNeb雾化器（courtesy of Aerogen Ltd.）使多种实施 方案的所提出的抗微生物组合物形成气溶胶。过氧化氢/葡萄糖/葡萄糖氧 化酶/乳过氧化物酶/碘化物/或硫氰酸盐的溶液每次通过雾化器一种物质， 或者混合物在一起并通过雾化器，并将气溶胶收集在无菌的25mL容器中。 在多孔板基测试上使用双倍稀释，将气溶胶化形式的抗微生物效力与非气 溶胶化的形式的效力相比（如实施例1中所述）。当与未气溶胶化的溶液 相比时，所提出的组合物未显示出活性的任何降低。此外，证明可以用于 生产抗微生物物质的酶系统未受雾化方式影响。
特别地，当与相同成分的原液相比时，所述的溶液未显示酶活性有任 何降低，或者存在的化合物的水平降低。该模型表明所提出的抗微生物系 统为用于成功地将气溶胶传递至肺以治疗呼吸感染的良好的目标或候选 物。
实施例9
乳铁蛋白为哺乳动物蛋白，其已经表征为特别是在生物膜上发挥抗微 生物性质。由此，其为良好的能够靶向并破坏感染模型中生物膜的生产的 化合物，并且与诸如本发明的抗微生物组合物之类的系统协同作用的化合 物。按照实施例1所述，在浓度改变的乳铁蛋白存在及缺乏下测试 KI-Dose-150和Thio-Dose-150的相对抗微生物的效力。在硫氰酸盐模型中 存在补充的乳铁蛋白不会增强已经存在的抗微生物性质（乳铁蛋白与硫氰 酸盐的比例为1:1、1:2、1:4）。这表明存在显著浓度的乳铁蛋白不会抑 制乳过氧化物酶-硫氰酸盐模型生产抗微生物物质的作用。使用浮游生物细 胞，从而允许这样的可能性：针对急性感染的治疗，记录到减轻的抗微生 物作用。
但是，乳铁蛋白与碘化物的相同比例会导致用于生产抗微生物物质的 乳过氧化物酶-碘化物模型的抗微生物活性记录为增加2倍，表明乳铁蛋白 在所提出的治疗方案中为合适的伴侣。在缺乏乳铁蛋白的情况下，256倍 稀释的系统仍会抑制E.coli。在加入乳铁蛋白的情况（在3种所述的比例 下）下，512的稀释因子也会抑制细菌培养物。感染位点通常由生物膜构 成，这允许待记录的乳铁蛋白的活性增加。
实施例10
设计用于治疗牛乳腺炎的抗生素疗法通常会诱导乳房发炎，从而导致 动物的体细胞计数增加。由于出售牛奶的价格取决于低的体细胞计数，所 以上述情况是不利的。通常可以加入一些药品来对抗由于抗微生物疗法的 乳房内输注而引起的发炎。强的松（或其活性形式—泼尼松）为用于减少 不需要的免疫应答的糖皮质类固醇。通常给与10-20的剂量以及抗生素基 的乳房内输注，以终止体细胞计数的升高。使用一定剂量的所提出的乳过 氧化物酶系统（KI-Dose-150）在强的松或泼尼松缺乏及存在下的体外试验 未得到所述组合物的抗微生物效力的任何降低。这表明使用典型剂量的任 一种药品不会干扰本发明的组合物消除乳房内（或其他环境）的细菌的能 力，并且有助于减少体细胞计数的增加。
实施例11
通过向包含抗细菌成分的溶液中重复接种细菌培养物来测定以连续 方式生产抗微生物物质的酶系统的能力。10mL体积的LB生长培养基补充 有葡萄糖氧化酶(15μl2.5mg/ml,200单位/mg)、β-半乳糖苷酶(30μl,10 mg/ml,48,000单位/mg)、乳过氧化物酶(20μl,4mg/ml,80单位/mg)、碘化 钾(30μl,40mg/ml)，并且最终浓度为2%乳糖。
加入大约108cfu E.coli ATCC25922，并将混合物在37℃下温育过夜。 24小时后，没有细胞可回收至新鲜的营养琼脂平板中。然后，将大约108cfu E.coli ATCC25922细胞的其他接种物加入到所述的体积中，并允许混合物 再次温育过夜。相似地，肉汤与细菌的随后的温育（10次接种，间隔1天） 不会使得细菌细胞生长或回收。该结果证明抗微生物活性物质的浓度在显 著的时间内保持足够高于杀灭细菌的水平。
实施例12
使用改变的抑制生长测试来测定底物选择对通过各种系统生产的组 合物的效力的影响，其中，首先H2O2（通过葡萄糖和葡萄糖氧化酶的酶反 应来生产）的浓度是恒定的，并且改变所选的底物的浓度。
其次，使用其中底物浓度保持恒定而H2O2的水平改变的测试。
（I）恒定的H2O2
将E.coli（50μl过夜培养物）加入到包含5μl葡萄糖氧化酶(2.5mg/ml) 和10μl LP(4mg/ml)的Mueller Hinton肉汤中。将所得物等分（150μl）至 96孔板的各排中。将等体积（150μl）的碘化钾或硫氰酸钾（均为40mg/ml） 加入到初始孔中。将样品双倍稀释至孔11，将孔12留作对照。将平板在 37℃下过夜温育，并在其期间测量光学密度。
结果：稀释1至9中的硫氰酸盐浓度为足以完全抑制细菌的水平。稀 释1至8中碘化物的浓度为足以完全抑制细菌的水平。该结果初步表明由 任一种底物生产的活性物质的效力不具有显著性差异，并且无论记录何种 差异均为摩尔浓度差异的结果。
（II）恒定的底物
将E.coli（200μl过夜培养物）加入到已经包含40μl LP(4mg/ml)和 60μl碘化钾或硫氰酸钾（40mg/ml）的20mL Mueller Hinton肉汤中。将所 得物等分（150μl）至96孔板的各排中。将生产H2O2的系统的样品（包 含10μl葡萄糖氧化酶,2.5mg/ml的2ml20%葡萄糖）加入到初始孔中并双 倍稀释，并将孔12留作对照。
结果：使用具有恒定浓度的硫氰酸盐的肉汤，在2种最高稀释的样品 （H2O2）中存在抑制。但是，在使用碘化物时，在至多并包括6倍稀释的 样品中存在对细菌生长的抑制。
该结果表明当底物水平保持在恒定的水平时，在使用酶系统（其释放 了低水平的过氧化氢）生产的抗微生物物质的效力中存在显著的差异。这 意味着当生产低水平的H2O2为典型时，使用碘化物是明显有利的。当使 用碘化物替代硫氰酸盐时，摩尔浓度的差异不能解释结果的表观差异。
使用牛奶作为生长培养基的重复（I）和（II）显示出极相似的结果和 模式。使用H2O2的备选来源（在这种情况下直接加入）在碘化物和硫氰 酸盐之间未显示特有的结果差异。
实施例13
拟定这样的方案，其允许操作者测定本发明的抗微生物物质的合适浓 度，所述的物质用于抑制/杀死肉汤中细菌细胞。该方案基于成分的双倍稀 释，与实施例1所述的96孔板中的双倍稀释相似。建立细菌培养物（107cfu/ml），并等分至管中（加入到15ml管中的5ml体积允许具有所需氧的 足够的顶部空间，并且第一管包含双倍体积，10mis。如果使用酶来生产 H2O2，则所述的肉汤应该包含足够的合适的糖，例如，如果使用葡萄糖氧 化酶，则合适的糖为葡萄糖，并且1-2%通常是足够的）。
将生产过氧化氢的成分的等分液（优选为不超过所述溶液的总体积的 5%，500l）加入到初始体积中，并双倍稀释。在24小时后，可以通过管 中生长/未生长的模式来测定细菌菌株对过氧化氢的固有耐受性的水平。
生产过氧化氢的成分可以由单糖或二糖、以及它们的合适的分解酶 （尤其为乳糖和β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶，或者葡萄糖和葡萄糖氧化 酶）构成，或者可以直接加入更简单的过氧化氢，或者释放过氧化氢的过 碳酸盐或柠檬酸等。
结合用于测定测试菌株的固有过氧化氢敏感性的测试，使用生产活性 氧物质的溶液液使用了相同的测试（例如Thio-Dose-150或者KI-Dose-150， 如实施例1所述），其中示出了生产过氧化氢的成分，并且还示出了过氧 化物酶（氯代过氧化物酶或乳过氧化物酶、以及它们的合适的底物）。
尽管不同比例和浓度改变的LP系统可以用于例如生产抗微生物和杀 灭细菌的浓度的活性物质，但是本作者推荐底物与乳过氧化物酶的可行比 例为75:2（例如，150mg KI以及4mg乳过氧化物酶(至少80单位/mg)）。 相似地，例如，如果H2O2是由葡萄糖的酶分解产生的，则本作者推荐底 物、乳过氧化物酶及葡萄糖氧化酶的比例为75:2:1（200单位/mg葡萄糖 氧化酶）。样品应该在合适的温度下温育，并摇动过夜。对照培养物（例 如不具有LP成分或H2O2）应该产生细菌的生长。在足够高的H2O2浓度 （最初的几个管）下，不应该观察到生长，但是随着H2O2水平的下降（更 稀释的培养物），生长将明显。这将允许操作者测定所述的菌株对H2O2的 作用的固有耐受性。通常，葡萄球菌菌株对H2O2的作用是极为敏感的， 这是因为它们缺少分解H2O2分子所需的过氧化氢酶，而其他菌种（例如 一些酵母菌）耐受～2mM水平的H2O2。将底物和乳过氧化物酶加入到最初 的管中应该在之前并非为抑制的H2O2水平下没有导致生长，这是因为生 产出更有效力的活性物质。相似地，存在这样的水平，当稀释至该水平时， 使得生长发生。在“仅仅H2O2”和“H2O2、底物和LP”之间的结果的差 异提示操作者关于杀死测试菌株或者经过24或48小时抑制测试菌株生长 的所需的LP系统的成分的浓度（如果需要）。本作者推荐选择这样的浓度： 在该浓度下，H2O2不会抑制其本身。实施例3所述的数据描述了糖的酶分 解的用途，其允许存在这样的“窗口”，在该窗口下，溶液中生产的H2O2的水平不足以引起抑制，但是足以驱动通过LP反应生产抗微生物活性氧 物质（在其中所述的菌株不会生产过氧化氢酶的情况下，并由此对H2O2的作用特别敏感，本作者推荐使用足以杀死典型的生产过氧化氢酶的菌株 的水平）。在24/48/72小时时间点下在合适的琼脂平板中的亚培养将允许 操作者测定在哪个浓度下生产杀灭细菌的浓度的成分（与细菌抑制水平相 对）。当由肉汤回收到起始细胞数量的不超过0.001%时，则该组合物将被 测定为是杀灭细菌的。
本测试允许操作者测定一剂药量的杀灭细菌的浓度，此外还允许操作 者使用酶系统，在未生产抑制水平的过氧化氢的条件下生产所述的成分所 需的过氧化氢的浓度。如果考虑将酶系统引入到敏感环境（哺乳动物的肺） 中，则上述信息是有价值的。
现有的统计模型允许操作者随后适当地“按比例增加”，从而测定治 疗感染或大量液体等（例如乳房或肺）所需的必需水平。
实施例14
酶系统中，生产抑制性杀灭生物浓度的抗微生物试剂所需的各成分的 下限被测定（例如表1和表5）。为了建立用于各成分的这些下限，按照与 实施例1所述相似的方式使用96孔板上的双倍稀释来计算用于各成分的 最小抑制性浓度，其中所选的成分的浓度下降，直到记录到对生长无效。 在10mL LB肉汤生长培养基（具有2%葡萄糖）中，必须充满120mg/L KI、 320单位LP、至少0.5单位葡萄糖氧化酶/ml来生产过氧化氢。低于这个 浓度会导致生产的过氧化氢不足以提供杀灭细菌浓度下的活性氧物质的 生产。相似地，葡萄糖水平的降低需要葡萄糖氧化酶水平升高来补偿；1% 葡萄糖需要1单位/ml葡萄糖氧化酶，而0.5%葡萄糖需要2单位/ml的活 性葡萄糖氧化酶。在其中葡萄糖水平和葡萄糖氧化酶水平足够的溶液中， 所需的碘化物（或硫氰酸盐）底物的水平为大约0.5mM。在低于该水平下， 不足以生产出有效的杀灭细菌活性的活性氧物质。用于反应从而生产出所 需浓度的活性氧物质所需要的LP水平测定为0.15单位活性/ml（存在1mM KI）。低于该水平的水平会导致较少的抗细菌活性。此外，适用于治疗乳 腺炎的本发明的该实施方案还包括β-半乳糖苷酶，从而将牛奶中存在的乳 头转化为葡萄糖。在牛奶（5%乳糖）中实施上述酶的所需水平的体外检验， 其中所述的牛奶具有1mM KI、0.75单位/ml葡萄糖氧化酶活性/ml（低于 该水平的水平将在酶途径中产生“瓶颈”，从而导致生产出不足的活性氧 物质）、以及1单位乳过氧化物酶活性/ml。所需的β-半乳糖苷酶的活性为 大约1.5单位活性/ml。低于该水平的β-半乳糖苷酶不会产生对细菌生长的 抑制或者杀死细菌细胞，而是产生细菌增殖。
实施例15
可以在将本发明的组合物的抗微生物活性氧物质加入到感染位点之 前生产这种物质。可以通过混合所需的酶成分，确保所得的活性氧物质 （ROS；次硫氰酸盐、次碘酸盐或次氯酸盐）在治疗位点之外生产来达到 上述目的。此外，可以通过加入过氧化氢酶（其与过氧化氢反应，从而生 产氧气和水）除去在反应后任何过量的过氧化氢。这可以证明在不具有任 何潜在的不利的过氧化氢分子的条件下传递所选的ROS的极为安全的方 法。
相似地，还可以在感染位点引入过氧化氢酶，从而帮助“淬灭”潜在 建立的有害的过氧化氢。
为了证明上述情况，使用实施例1中所述的方案，在包含过氧化氢酶 （20μl4mg/ml，在20ml肉汤中>1,000单位/mg）的肉汤生长培养基中测试 KI-Dose-150和Thio-Dose-150组合的效力。一剂药量的效力没有逆转。1: 1024稀释的一剂药量在过氧化氢酶缺乏下是抑制性的，而1:512稀释的一 剂药量在过氧化氢酶存在下是抑制性的。
作为比较，仅使用过氧化氢（0.85M），在过氧化氢酶存在及缺乏下试 试所述的测试。过氧化氢酶的水平足以完全逆转过氧化氢的抑制本性，表 明用于所述试验的过氧化氢酶的水平足以“淬灭”所述的活性，由此当碘 化物或硫氰酸盐底物被用光时，所述的过氧化氢酶为用于“扫净”所生产 的过量的过氧化氢的、合适的成分，而且在底物仍存在时，所述的过氧化 氢酶不会抑制反应本身。
这可以起到保护哺乳动物组织的作用。
实施例16
按照如下使用预活化系统的其他实例：将包含0.85M H2O2加上无或 2.5M NaCl/5μl氯代过氧化物酶（-10,000单位/ml）的溶液（体积为4ml） 进行温育。然后分开所述的溶液，一种为过氧化氢酶处理的（50μl4mg/ml， >1,000单位/mg），或者为未经过氧化氢酶处理的。然后，使用如实施例1 所述的方案，使用补充有E.coli的肉汤测试所述溶液的相对抗微生物性质。 对于仅具有过氧化氢、过氧化氢+氯代过氧化物酶/NaCl、以及过氧化氢酶 处理的过氧化氢+氯代过氧化物酶/NaCl样品而言，细菌的抑制记录至 >1:640的稀释。但是，对于过氧化氢酶处理的过氧化氢样品而言，未记录 有抑制。该结果表明可以通过过氧化氢酶处理的手段，在不降低活性氧物 质的效力的条件下除去过量的过氧化氢。允许所述的溶液温育更长的时 间，其后（72小时）结果是重复的。这表明这种形式的ROS是相对稳定 的，并且可以在使用前制备。
实施例17
实施例1中所述的方案用于测试“KI-Dose-150”、缺乏碘化物和乳过 氧化物酶的版本、以及缺乏葡萄糖氧化酶的版本。所有版本均针对光滑假 丝酵母（Candida glabrata）、克鲁斯氏念珠菌（Candida krusei）、热带假 丝酵母（Candida tropicalis）、白色念珠菌（Candida albicans）以及酿酒酵 母（Saccharomyces cerevesiae）进行测试。使用实施例1中所述的方法， 分别针对营养肉汤和LB肉汤中的假丝酵母菌株和酵母菌菌株实施所述的 方案，其中所述的肉汤均补充有2%葡萄糖。结果示于表5中。由表5清 楚的是所有的菌株均受到“KI-Dose-150”作用的抑制，并由此活性氧物质 是抗微生物的，并不仅是抗细菌的。在这些稀释的组合物中生产的过氧化 氢的水平本身对测试菌株是非抑制性的。
表5.真菌和酵母菌菌株对“KI-Dose-150”的易感性。MIC值表示杀死所 述的菌株所需的活性氧物质（次碘酸盐）的最低水平（经过24小时生产 的，单位为毫摩/升）。
MIC 白色念珠菌 0.25-0.5mM 热带假丝酵母 0.12-0.25mM
Candida glabrata 0.25-0.5mM Candida kruset 0.25-0.5mM Saccharomyces cerevisiae 0.12-0.25mM
实施例18
实施例3中所示的结果证明存在3个重要的H2O2的水平。如图7所 示，可以使用示意模型来描述这些水平。
首选，存在较高的H2O2的阈值水平，处于或高于该水平，生长培养 基中H2O2浓度的直接结果为细菌的生长受到抑制。由于例如H2O2对宿主 细胞具有毒性并且与哺乳动物组织的损伤有关，所以对于抗微生物组合物 而言，上述情况并非是优选的作用机制。
就有效地生产抗微生物活性氧物质而言，需要第二的H2O2的阈值水 平。本文所示的试验（实施例3）描述了通过使用酶方法生产H2O2所赋予 的显著的优点，其中在较长的时间段内，可以使H2O2的水平保持在这种 所需的“窗口”内（图7）（即，这些窗口为这样的H2O2的浓度：它们有 效地允许生产所需浓度的活性氧物质，但是本身并非是毒性的）。
最后，第三的H2O2的阈值水平为这样的水平，在该水平下存在不足 的H2O2来抑制或提供使用酶系统生产活性氧物质。
使用更加直接的过氧化物来源（例如过碳酸钠或过氧化氢本身）会导 致高的H2O2初始浓度，该浓度快速降至这样的水平：该水平对于生产所 需的活性氧物质而言是无效的（图7）。
实施例19
通过在转化过程中以及例如在24小时之后直接测量相关底物的浓度 来估计底物向抗微生物活性氧物质（ROS）的转化。多种抗微生物的活性 氧物质是相对短期活性的，但是根据使用的底物而具有不同的半衰期，因 此直接滴定是无用的。例如，在包含葡萄糖、乳过氧化物酶和葡萄糖氧化 酶的溶液中温育之前和之后比较在1x(1.36mM)和5x(6.8mM)水平下的硫 氰酸盐浓度。按照如下使用比色测试将上述的浓度与硫氰酸盐水平的标准 浓度曲线比较（0,0.0625,0.125,0.25,0.5,1,2和5x浓度）：
将5克氯化铁悬浮于50ml水中。通过离心除去任何未溶解的氯化铁， 得到-30ml氯化铁溶液。向比色杯中加入150μl铁溶液，然后加入700μl 水。将一定体积的10x硫氰酸盐加入到各个比色杯中（200μl,160μl,100μl, 40μl,20μl,10μl,5μl,25μl(1:10),12.5μl(1:10),0μl）。通过加入水使得比色 杯中的最终体积为1050μl。在460nm下记录光学密度，然后使用标准曲线 计算浓度。所得的标准曲线的r2值>0.99（参见图8），表明其为测定未知 浓度的硫氰酸盐的精确方法。
24小时后，1x一剂药量（与酶系统温育过夜）读作0.17x一剂药量。 相似地，在24小时后，5x一剂药量（与酶系统温育过夜）读作1.1x一剂 药量。这2个结果均表明在这些条件下，硫氰酸盐的水平下降80-85%。假 设硫氰酸盐的损失与ROS的生产（在这种情况下为OSCN-）的比例为1:1， 则对于1x和5x一剂药量而言，经过24小时，所测定的所生产的ROS水 平分别为1mM和5mM的区域。可以使用较高的底物浓度来采用该值，通 常保持高效的转化，至少在本文所测试的范围内。
本文所公开的用于提供杀灭细菌和杀灭真菌活性的ROS的特定水平 高于其他处使用LP系统生产的水平。在本申请中所述的浓度依赖的杀灭 微生物作用；以及测定ROS在各种培养基和环境下对抗目标菌株的最小抑 制浓度的能力允许使用本发明的组合物作为目标杀灭细菌和杀灭微生物 的治疗及抗微生物组合物，这与仅仅一般的非特异性细菌抑制作用相对。
实施例20
再次使用牛奶模型来研究在体内取得潜在治疗剂量的活性氧物质的 能力。使用乳房内输注方法将所述的实施例4的原型[150mg KI、4mg乳 过氧化物酶(320单位)、2mg葡萄糖氧化酶(400单位)、以及β-半乳糖苷 酶,(1,350单位)]引入到牛乳房中。在动物挤奶后实施上述过程。在下一次 挤奶时，获得牛奶样品。用约107cfu/ml细菌菌株（E.coli、绿脓杆菌或S. dysgalactiae）牛奶的等分液（10ml体积）尖峰化，并允许在37℃下温育 过夜，同时进行摇动。使用琼脂平板进行活菌计数。牛奶中的菌株被完全 抑制。这表明牛奶中存在浓度足以杀死引起这些乳腺炎的有机体的活性氧 物质。这在证明所述的技术为治疗技术时是重要的。此外，由于活性氧物 质是相对短期活性的，所以可能的是其浓度高于乳房本身的浓度，总而增 加了进一步治疗的有效性。
适用于给药的组合物
包含1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的乳过 氧化物酶、0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘化物、以及0.01-100,000单位活性的 β-半乳糖苷酶的溶液作为乳房内输注适用于给予动物的乳房。
包含1-100,000单位活性的半乳糖氧化酶、1-100,000单位活性的乳过 氧化物酶、0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘化物、以及0.01-100,000单位活性的 β-半乳糖苷酶的溶液作为乳房内输注适用于给予动物的乳房。
包含1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的乳过 氧化物酶、0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘化物、以及0.01-100,000mg葡萄糖 的溶液作为乳房内输注适用于给予动物的乳房。
包含1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的乳过 氧化物酶、0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘化物、以及0.01-100,000mg葡萄糖 的溶液作为喷洒喷雾适用于给予肺以用于治疗细菌感染。
如上所述的相同的溶液，其补充有乳铁蛋白乳铁蛋白(0.01-100,000 mg)、强的松(0.01-100,000mg)或泼尼松(0.01-100,000mg)、过氧化氢酶 (1-1,000,000单位)、或者这些物质的2种或多种的组合。
包含1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的氯代 过氧化物酶、0.1-10,000mg氯离子、以及0.01-100,000mg葡萄糖的溶液作 为喷洒喷雾适用于给予肺以用于治疗细菌感染。
如上所述的相同的溶液，其补充有乳铁蛋白乳铁蛋白(0.01-100,000 mg)、强的松(0.01-100,000mg)或泼尼松(0.01-100,000mg)、或者这些物 质的2种或多种的组合。
包含1-100,000单位活性的乳过氧化物酶、0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘 化物、以及0.01-100ml过氧化氢的溶液作为喷洒喷雾适用于给予肺以用于 治疗细菌感染。
浸渍有1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的乳 过氧化物酶以及随附的凝胶的膏状药用于治疗患者的烧伤或开放性伤口， 其中所述的随附凝胶包含0.1-10,000mg硫氰酸盐/碘化物、以及0.01- 100,000mg葡萄糖，其在使用前被施加到膏状药上。
浸渍有1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1-100,000单位活性的氯 代过氧化物酶以及随附的凝胶的膏状药用于治疗患者的烧伤或开放性伤 口，其中所述的随附凝胶包含0.1-10,000mg氯离子、以及0.01-100,000mg 葡萄糖，其在使用前被施加到膏状药上。
如上所述的相同的膏状药，其补充有乳铁蛋白(0.01-100,000mg)、强 的松(0.01-100,000mg)或泼尼松(0.01-100,000mg)、过氧化氢酶 (1-1,000,000单位)、或者这些物质的2种或多种的组合。多种医疗器械在 插入患者肌体之前可以涂敷/浸渍1-100,000单位活性的葡萄糖氧化酶、1- 100,000单位活性的乳过氧化物酶。
包含碘离子/硫氰酸根离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在乳过氧化 物酶(0.01-1,000,000单位)存在下允许与过氧化氢(0.01-100ml)完全反 应。该组合物经过过氧化氢酶处理(0.01-1,000,000单位)，从而除去过多 的过氧化氢，然后将该组合物用于治疗感染位点。
包含氯离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在氯代过氧化物酶(0.01- 1,000,000单位)存在下允许与过氧化氢(0.01-100ml)完全反应。该组合物 经过过氧化氢酶处理(0.01-1,000,000单位)，从而除去过多的过氧化氢， 然后将该组合物用于治疗感染位点。
包含氯离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在氯代过氧化物酶(0.01- 1,000,000单位)存在下允许与过碳酸钠(0.01-100,000mg)完全反应。该组 合物经过过氧化氢酶处理(0.01-1,000,000单位)，从而除去过多的过氧化 氢，然后将该组合物用于治疗感染位点。
包含硫氰酸根/碘离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在乳过氧化物 酶(0.01-1,000,000单位)存在下允许与过碳酸钠(0.01-100,000mg)完全反 应。该组合物经过过氧化氢酶处理(0.01-1,000,000单位)，从而除去过多 的过氧化氢，然后将该组合物用于治疗感染位点。
包含氯离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在氯代过氧化物酶(0.01- 1,000,000单位)存在下允许与葡萄糖(0.01-100,000mg)和葡萄糖氧化酶 (0.1-1,000,000单位)完全反应。该组合物经过过氧化氢酶处理(0.01- 1,000,000单位)，从而除去过多的过氧化氢，然后将该组合物用于治疗感 染位点。
包含硫氰酸根/碘离子(0.1-10,000mg)的预制备组合物在乳过氧化物 酶(0.01-1,000,000单位)存在下允许与葡萄糖(0.01-100,000mg)和葡萄 糖氧化酶(0.1-1,000,000单位)完全反应。该组合物经过过氧化氢酶处理 (0.01-1,000,000单位)，从而除去过多的过氧化氢，然后将该组合物用于 治疗感染位点。
上述预制备溶液补充有乳铁蛋白(0.001mg-10,000mg)、强的松(0.001 mg-10,000mg)或泼尼松(0.001-10,000mg)（单独的或者这些物质的2种 或多种的组合）。
词语“动词形式的包含/动名词形式的包含”以及词语“具有/包括” 当参照本发明在本文中使用时，用于说明存在所述的特征、整数、步骤或 成分，但是不排除存在或加入一种或多种其他的特征、整数、步骤、成分 或其组别。
应该理解的是，为了清楚起见在分开的实施方案中描述的本发明的某 些特征还可以与单一的实施方案组合提供。相反，为了简洁起见在单一的 实施方案中描述的本发明的不同特征还可以分开或者以任何合适的亚组 合的方式提供。