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1、(10)申请公布号 CN 103784944 A (43)申请公布日 2014.05.14 CN 103784944 A (21)申请号 201410031620.1 (22)申请日 2014.01.23 A61K 38/21(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 李红良 朱丽华 张书敏 张晓东 蒋丁胜 向梅 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 (54) 发明名称 IRF7基因在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的 功能和。
2、应用 (57) 摘要 本发明公开一种 IRF7 基因在支架及内膜剥 脱术后再狭窄中的功能和应用， 属于基因的功能 与应用领域。 本发明以IRF7基因敲除小鼠和野生 型 C57 小鼠为实验对象， 通过血管损伤模型， 进行 了血管损伤模型小鼠内膜新生测定和血管壁细胞 增殖水平的检测的研究， 结果表明与野生型 C57 小鼠对比， IRF7 基因敲除小鼠表现出内膜新生及 细胞增殖更明显。 这提示一种IRF7基因在支架及 内膜剥脱术后再狭窄中的功能， 主要体现在 IRF7 基因具有抑制血管损伤引起的再狭窄的作用， 特 别是 IRF7 基因能够抑制支架及内膜剥脱术后再 狭窄的作用。针对 IRF7 的上述功。
3、能， 其可用于制 备治疗血管狭窄疾病的药物， 特别是制备支架及 内膜剥脱术后再狭窄的药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103784944 A CN 103784944 A 1/1 页 2 1.IRF7 在制备治疗血管狭窄疾病的药物中的应用。 2. 一种治疗血管狭窄疾病的药物， 包含 IRF7。 3.IRF7 在制备治疗支架后再狭窄的药物中的应用。 4. 一种治疗支架后再狭窄的药物， 包含 IRF7。 5.IRF7 在制备治疗。
4、内膜剥脱术后再狭窄的药物中的应用。 6. 一种治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物， 包含 IRF7。 权 利 要 求 书 CN 103784944 A 2 1/5 页 3 IRF7 基因在支架及内膜剥脱术后再狭窄中的功能和应用 0001 技术领域 0002 本发明属于基因的功能与应用领域， 涉及一种 IRF7 基因在支架及内膜剥脱术后 再狭窄中的功能和应用。 背景技术 0003 目前， 血管狭窄引起的心血管疾病的数量不断上升， 目前对这类疾病尚无根治办 法， 血管外科的治疗手段包括球囊扩张、 支架置入及动脉旁路等方式， 但是血管重建后再狭 窄极大地影响了治疗效果。有关血管再狭窄的研究已进行了多年， 。
5、但是迄今为止还没有明 确。已有研究表明， 在损伤形成的过程中， 新生内膜及中膜组织过度增生以及同时伴随的 细胞外基质形成， 是造成再狭窄的主要病理基础。生理状态下， 血管内皮细胞 （vascular endothelialcell， EC）可以产生多种促进与抑制血管平滑肌细胞 （vascular smooth muscel cell， VSMC） 生长的物质， 且两者保持动态平衡， 维持 VSMC 处于相对静化状态。促进 VSMC 生长的物质主要有血小板衍生生长因子 （platelet-derived growth factor， PDGF） 、 内皮素 （endomthelin， ET） 和。
6、血管紧张素 U（angiotonin ， Ang ） 等， 而抑制 VSMC 增殖 的物质主要有批氮 （nitrogen monoxidum， NO） ， 前列腺环素 （prostacyclin， PGl2） 等。在血 管内皮损伤后， 促进VSMC增殖的生长因子增多而抑制VSMC增殖的因子减少， 这种动态平衡 被打破， 导致 VSMC 大量的增殖。 0004 血管的内膜新生是血管在各种损伤因素刺激下发生的病理改变， 是多种心血管系 统疾病共有的病理过程。 血管壁中的平滑肌细胞在这个过程中起着重要的作用， 它的增殖、 凋亡和表型改变在内膜增生的过程中扮演着重要的角色。血管损伤后， 血管平滑肌细胞。
7、由 中膜向内膜迁移， 平滑肌细胞的增殖凋亡失平衡， 表型由收缩型向合成型转变， 血管壁不适 重塑， 从而引起内膜增生。 近年来， 对于内膜增生过程中信号传导通路的研究越来越引起人 们的关注。 0005 对这类疾病目前尚无根治方法， 血管外科的主要治疗手段是闭塞段血管重建， 包 括球囊扩张、 支架置入以及动脉旁路手术等， 但是血管重建后再狭窄的发生率较高 （30% 60%） ， 极大地影响了治疗效果， 迄今为止血管重建后再狭窄依然是一个临床难题。 0006 IRF7 是干扰素调节因子 （interferon regulatory factor， IRF） 家族中的一个成 员。现有的研究提示 ： 。
8、IRF 家族成员参与了广泛的生物学过程， 主要涉及天然免疫和获得性 免疫反应， 抗肿瘤形成等。 0007 发明内容 0008 为解决上述现有技术的缺陷和不足， 本发明的目的在于提供一种 IRF7 在制备治 疗支架及内膜剥脱术后再狭窄药物中的应用。 说 明 书 CN 103784944 A 3 2/5 页 4 0009 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 本发明以野生型 C57 小鼠与 IRF7 基因敲除小鼠 （IRF7-KO 小鼠） 为实验对象， 通过颈动 脉导丝损伤模型诱导获得小鼠血管损伤模型 （vascular injury， VI） ， 进行了血管损伤模型 （VI） 小鼠内膜新生测定和。
9、血管壁细胞增殖水平的检测的研究， 结果表明 ： 与野生型 C57 小 鼠对比， IRF7基因敲除小鼠表现出内膜新生及细胞增殖明显高于WT小鼠 ； IRF7基因敲除可 以促进细胞增殖核抗原 （Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA） 的表达， 可促进平 滑肌细胞的增殖和内膜增生。上述结果提示 IRF7 基因敲除会加剧血管损伤后再狭窄的发 生， IRF7 基因能够抑制支架及内膜剥脱术后再狭窄的发生。 0010 一种 IRF7 基因的新功能， 具体体现在 IRF7 具有在支架及内膜剥脱术后再狭窄中 抑制内膜新生及细胞增殖的功能。 0011 针对 IRF7 具。
10、有抑制内膜新生及细胞增殖的功能， 提供 IRF7 在制备治疗血管狭窄 疾病的药物中的应用。 0012 一种治疗血管狭窄疾病的药物， 包含 IRF7。 0013 针对 IRF7 具有抑制内膜新生及细胞增殖的功能， 提供 IRF7 在制备治疗支架后再 狭窄的药物中的应用。 0014 一种治疗支架后再狭窄的药物， 包含 IRF7。 0015 针对 IRF7 具有抑制内膜新生及细胞增殖的功能， 提供 IRF7 在制备治疗内膜剥脱 术后再狭窄的药物中的应用。 0016 一种治疗内膜剥脱术后再狭窄的药物， 包含 IRF7。 0017 在本发明研究中， 野生型小鼠和 IRF7-KO 小鼠在血管损伤模型 （V。
11、I） 的诱导下均发 生血管损伤， 与野生型小鼠相比， IRF7-KO 小鼠内膜新生及细胞增殖显著。这些结果提示， IRF7 对抑制内膜新生及细胞增殖具有强大的调控能力， 有强大的血管狭窄清除和抗支架及 内膜剥脱术后再狭窄形成的能力。本发明证明了 IRF7 基因在血管损伤疾病模型中有着重 要的保护作用。 0018 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： （1） 本发明发现IRF7基因的新功能， 即IRF7基因具有抑制支架及内膜剥脱术后再狭窄 的作用。 0019 （2） 基于 IRF7 在抑制支架及内膜剥脱术后再狭窄中的作用， IRF7 可用于制备治疗 血管狭窄疾病的药物， 特别是用于制备治。
12、疗支架及内膜剥脱术后再狭窄的药物。 附图说明 0020 图 1 是 WT 和 IRF7-KO 小鼠的 HE 染色及内膜面积结果统计柱状图 ； 其中， A ： HE 染 色染色图， B ： 柱状图。 0021 图2是WT和IRF7-KO小鼠术后14d、 28d 血管壁细胞增殖水平标志物PCNA表达的 免疫荧光染色及结果统计柱状图 ； 其中， A ： 免疫荧光染色， B ： 柱状图。 具体实施方式 0022 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 说 明 书 CN 103784944 A 4 3/5 页 5 0023 实验用动物及饲养 ： 实验动物种属， 。
13、性别， 周龄及来源 ： C57BL/6 小鼠 （WT 小鼠）和 IRF7 基因敲除小鼠 （IRF7-KO 小鼠） ， 雄性， 8-10 周龄， 体重 24-27g， C57BL/6 小鼠购自北京华阜康生物科技有 限公司 ； IRF7 基因敲除小鼠 （IRF7-KO， C57BL/6J 背景）购自 RIKEN BRC 公司， BRC 编号 ： RBRC01420。 0024 动物饲养及环境条件 ： 所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所 SPF 级动物房 （许可证号 ： SYXK（鄂） ： 2009-0053） 。每 12 小时交替照明， 温度 242， 湿度 40%-70%， 小鼠自由饮。
14、水进食。 0025 实施例 1 小鼠血管损伤模型 （VI） 获得 1. 实验动物分组 ： 使用8-10周龄， 体重24-27g的WT和IRF7-KO小鼠， 共分为四组 ： WT 血管损伤组 ； WT 假手术组 ； IRF7-KO 血管损伤组 ； IRF7-KO 假手术组， 每组各 60 只小鼠。分 别在手术后 14 天、 28 天每组各处死 20 只小鼠， 取损伤节段血管进行分析。 0026 2. 小鼠血管损伤模型操作流程 ： 1） 用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重 （g） ， 用双蒸水准确配置 3% 戊巴比妥钠 溶液， 轻轻摇动使其充分溶解， 采用 80mg/kg 体重剂量， 计算所需。
15、戊巴比妥钠溶液体积后用 1mL 注射器准确抽取相应体积溶液， 行腹腔注射麻醉小鼠， 待小鼠充分麻醉倒 （约 3min） 后， 8% 硫化钠颈部脱毛。 0027 2） 分离颈内和颈外动脉。 0028 3）在颈内动脉和颈外动脉分叉处用 8-0 线结扎颈外动脉， 同时用血管夹 （WPI, 501784-G） 暂时性阻断颈内动脉及颈总动脉供血。 0029 4） 用显微剪 （WPI, 501839） 在颈外动脉结扎线的上方横向剪一个小口。经此血管 切口插入直径 0.015 英寸的导丝 （No. C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana） ， 旋转 导丝进退 5-6 次。
16、。 0030 5） 在切口近心端结扎颈外动脉， 松开颈内及颈总动脉置留的血管夹， 剪断线头， 清 理术野， 缝合颈部切口 （假手术除不进行导丝插入和旋转进退以外， 其他操作均相同） 。 0031 实施例 2 血管损伤模型 （VI） 小鼠内膜新生测定 1. 小鼠取材 1） 麻醉小鼠， 剪破心脏放血。 0032 2） 从颈动脉近分叉处剪下颈动脉， 取 0.5-0.6cm 长， 保留颈外动脉线结。 0033 3） 将颈动脉放入 PBS 中， 用显微镊轻柔排干管腔内的残血。 0034 4） 将血管放入装有 1mL 4% 多聚甲醛的 1.5mL EP 管中固定。 0035 2. 病理学检测 2.1 制备。
17、石蜡标本切片 由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片， 主要操作程序包括修剪心脏包埋框 处理流水冲洗脱水透明浸蜡包埋切片 （3m） 摊片晾干或烘烤后备用。 0036 2.2 苏木精 - 伊红 （HE） 染色 主要步骤为 ： 55烘烤 30min 二甲苯 5min， 3 次 100% 酒精 1min 95% 酒精 1min 70% 酒精 1min 双蒸水 1min 苏木素溶液 （珠海贝索， BA-4021） 5min 水 洗 1min 1% 盐酸酒精 （取 3mL 浓盐酸与 297mL 70% 酒精充分混合均匀） 1-3s 水洗 说 明 书 CN 103784944 A 5 4/5 页 6 1。
18、min Scott 液 （碳酸氢钠 0.35g， 硫酸镁 2g， 蒸馏水 100mL） 1min 水洗 1min 伊红溶液 （珠海贝索， BA-4024） 3-5min 蒸馏水洗去浮色 70% 酒精 1s 95% 酒精 1s 100% 酒精 30s， 3 次二甲苯 2min， 3 次趁二甲苯未干立即封片通风橱内吹干， 显微镜拍照。 0037 以血管内弹力纤维和外弹力纤维为界， 内弹力板以内为血管内膜， 外弹力板以外 为血管外膜， 内外弹力板之间为血管中膜。用 Image-Pro Plus 6.0 软件分别圈各血管管腔 面积。 0038 内膜面积大小的计算参照公式如下 ： 新生内膜面积 = 内弹。
19、力板面积 - 管腔面积 ； 中膜面积 = 外弹力板面积 - 内弹力板面积。 0039 小鼠 HE 染色后的血管内膜新生的结果如图 1。通过 HE 染色可以观察到， 假手术 组 （Sham 组） 血管壁结构完整， 排列整齐， 血管内膜为单层内皮细胞， 结构完整， 中膜平滑肌 细胞排列整齐。血管损伤组 （VI 组） 血管壁结构不完整， 血管内皮细胞缺失， 新生内膜增生 明显， 并伴有大量炎细胞浸润 ； IRF7-KO 组在术后 14d 新生内膜面积明显比 WT 小鼠要高， 这 种恶化作用在术后 28d 更明显。同样， 内膜面积 / 中膜面积的比值在 VI 术后 IRF7-KO 组要 高于 WT 组。
20、， 这种作用在 28d 要更显著。 0040 实施例 3 血管壁细胞增殖水平的检测 免疫荧光染色检测细胞增殖核抗原 （Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA） 的 表达。所需一抗信息 ： PCNA (#2586; 1:100; mouse; Cell Signaling Technology) ； 所需 二抗信息 ： Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse IgG (A11004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)。 0041 主要步骤为 ： 1） 烤片 ： 将石蜡切片置于烤。
21、箱中 30min 以上。 0042 2） 脱蜡 ： 二甲苯 5min3。 0043 3） 水合 ： 100% 乙醇 5min2 ； 95% 乙醇 5min ； 70% 乙醇 5min ； ddH2O 浸洗 5min2。 0044 4） 柠檬酸盐组织抗原修复 （高压修复） ： 取一定量的 pH6.0 柠檬酸盐抗原修复工作 液于修复盒中， 修复工作液的量必须能足够浸没整张切片， 将修复盒放入已加入适量自来 水的高压锅中， 大火加热至沸腾， 将脱蜡水合后的组织切片置于耐高温染色架上， 再将染色 架缓慢放入修复盒中， 盖上锅盖， 扣上压力阀， 继续加热至喷气， 开始计时 5min 后， 压力锅 断开电。
22、源， 去阀开盖， 取出修复盒 ； 室温放置 20min 自然冷却后取出切片。 0045 5） ddH2O 漂洗 5min2 次， PBS 漂洗 5min2 次。 0046 6） 组化笔划圈， 滴加 10% 羊血清 （GTX27481， GeneTex） 封闭， 于湿盒中 37封闭 60min。 0047 7） 弃封闭液， 滴加适当比例稀释的一抗， 4孵育过夜， 37复温 30min， 弃去一抗， PBS 洗 10min3 次。 0048 8） 滴加二抗， 于湿盒中 37孵育 60min， 弃去二抗， PBS 浸洗 5min3 次。 0049 9） SlowFade Gold antifade 。
23、reagent with DAPI（S36939， Invitrogen） 封片。 0050 10） 荧光镜下观察， 拍照。若需保存， 于暗湿盒中 4保存。 0051 荧光统计方法 ： PCNA 免疫荧光染色统计采用 IPP 软件计数， PCNA 阳性细胞百分比 =PCNA 阳性细胞个数 /（内膜 + 中膜） 的总 DAPI 个数 *100% ； 说 明 书 CN 103784944 A 6 5/5 页 7 免疫荧光发观察 PCNA 在 WT 和 IRF7-KO 小鼠血管损伤后的表达变化， 结果见图 2。PCNA 在血管组织中有表达， IRF7-KO小鼠在术后14d、 28d PCNA的阳性细。
24、胞个数要大于同组的WT 小鼠， 表明 IRF7 基因敲除可以促进 PCNA 的表达， 可促进平滑肌细胞的增殖。 0052 上述实施例结果显示， 野生型小鼠和 IRF7-KO 小鼠在血管损伤模型 （VI） 的诱导下 均发生血管损伤， 与野生型小鼠相比， IRF7-KO 小鼠内膜新生及细胞增殖显著。这些结果提 示， IRF7 对抑制内膜新生及细胞增殖具有强大的调控能力， 有强大的血管狭窄清除的能力。 证明了 IRF7 基因在血管损伤疾病模型中有着重要的保护作用， 可用于制备治疗血管狭窄 疾病的药物。 0053 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103784944 A 7 1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103784944 A 8 2/2 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103784944 A 9 。