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1、10申请公布号CN102337213A43申请公布日20120201CN102337213ACN102337213A21申请号201110310986922申请日20111013C12M3/00200601C12M1/34200601B29C39/02200601B29C39/22200601B29B7/00200601B29B13/0620060171申请人西北工业大学地址710072陕西省西安市友谊西路127号72发明人叶芳常洪龙何洋高洁续惠云谢丽张卫菊黎永前74专利代理机构西北工业大学专利中心61204代理人吕湘连54发明名称一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片及其可控制备方法57摘要本。
2、发明公开了一种基于微细加工技术实现的三维单细胞培养芯片，属于生物微机电系统BIOMEMS。本芯片包含阵列分布的腔体，各相邻腔体之间有微沟槽相连接，微沟槽深度与腔体高度一致，腔体底部包含纳米突起。本芯片利用细胞在空白PDMS表面及具有纳米微观形貌结构的PDMS表面黏附性的不同，结合表面拓扑图型，实现细胞图型化培养。该芯片无需任何化学和生物试剂即可用于细胞培养，克服了上述常用图型化方法稳定性差的缺陷，具有图型持久稳定、制备过程可控等特点，可满足批量生产的需要。同时，采用腔体之间具有微槽连接的图型化设计，可实现细胞间相互作用的研究。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要。
3、求书1页说明书4页附图3页CN102337224A1/1页21一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度一致，腔体1底部包含纳米突起；腔体1最大内切圆直径满足其中，是待培养细胞2的平均直径；腔体1高度H满足05H0H2H0，其中，H0是待培养细胞2的高度平均值；相邻两个腔体1间的距离L满足当应用于细胞接触性连接研究时，当应用于细胞非接触性连接研究时，其中，L0是待培养细胞2突触长度的平均值；所述微沟槽3呈90均匀分布，微沟槽3宽度A满足05MA10M。2所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和。
4、复制模塑技术完成，具体包括如下步骤步骤一按质量或体积比为101混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；步骤二将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含立柱阵列，立柱最大外接圆直径满足高度H满足05H0H2H0，相邻两个立柱间的距离L满足当应用于细胞接触性连接研究时，当应用于细胞非接触性连接研究时，立柱间有呈90均匀分布的梁连接，梁宽度A满足05MA10M，在立柱顶部有不规则纳米突起；步骤三将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；步骤四将冷却后的PDMS剥下，得到所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。
5、。权利要求书CN102337213ACN102337224A1/4页3一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片及其可控制备方法0001所属领域0002本发明涉及一种基于微细加工技术实现的三维单细胞培养芯片，属于生物微机电系统BIOMEMS领域。背景技术0003微图型化单细胞培养芯片作为贴壁依赖型细胞研究及行为控制的实验性工具，在基础细胞生物学、生命科学、组织工程学以及药物筛选、基于细胞的生物传感器等领域具有广阔的应用前景。0004用于实现细胞微图型化的典型代表是微接触印刷技术，是一类借助中间图型间接实现细胞图型化的方法，中间图型的稳定性直接关系到细胞图型构建的成败。由于存在蛋白质“失活”和蛋白质解。
6、吸附，以及自组装分子层不具备高度致密性等问题，细胞图型的稳定性成为该技术发展的瓶颈。AHMICHOIA等AHMICHOIA，JAEYOUNGKIMC，JONGEUNLEECETALEFFECTSOFPDMSCURINGRATIOAND3DMICROPYRAMIDSTRUCTUREONTHEFORMATIONOFANINVITRONEURALNETWORKCURRENTAPPLIEDPHYSICS2009，9，4294297直接在PDMS表面制备棱锥阵列，利用细胞的自重使细胞滑入沟槽中，并通过对PDMS表面进行氧等离子体处理，实现了海马神经元细胞的培养。虽然PDMS表面经氧等离子体处理后呈现出亲。
7、水性，但是，随着时间的推移将出现疏水性回复，如果不能在处理后立即进行细胞实验，将无法顺利实现细胞的黏附和增殖，即图型性质的稳定性差。发明内容0005本发明的目的是为解决现有单细胞微图型化培养芯片存在的图型形状和图型性质稳定性差的不足，本发明提供一种稳定的三维单细胞培养芯片。0006本发明的技术方案是一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度一致，腔体1底部包含纳米突起；腔体1最大内切圆直径满足其中，是待培养细胞2的平均直径；腔体1高度H满足05H0H2H0，其中，H0是待培养细胞2的高度平均值；相邻两个腔体1间的距离L。
8、，即腔体1中心线之间的距离满足当应用于细胞接触性连接研究时，当应用于细胞非接触性连接研究时，其中，L0是待培养细胞2突触长度的平均值；所述微沟槽3呈90均匀分布，微沟槽3宽度A满足05MA10M。0007所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤0008步骤一按质量或体积比为101混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；0009步骤二将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含立柱阵列，立柱最大外接圆直径满足高度H满足05H0H2H0，相邻两个立柱间的距离L满足当应用于细胞。
9、接触性连接研究时，当应用于细胞非接触性连接研究时，说明书CN102337213ACN102337224A2/4页4立柱间有呈90均匀分布的梁连接，梁宽度A满足05MA10M，在立柱顶部有不规则纳米突起；0010步骤三将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；0011步骤四将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。0012本发明的有益效果是本发明提出了一种基于PDMS材料的细胞图型化芯片结构及制备方法。利用细胞在空白PDMS表面和具有微纳复合结构的PDMS表面黏附性的差异，即空白PDMS表面不利于细胞黏附生长，而具有纳米结构的PDMS。
10、表面利于细胞生长的特性，在PDMS芯片上构建同时包含促进和抑制细胞黏附区域的图型化结构，实现细胞的定位生长；同时，采用腔体1之间具有微沟槽3连接的图型化设计，使PDMS芯片不仅可用于细胞培养，亦可用于细胞间相互作用的研究。0013本发明提出的图型化细胞培养芯片，直接在PDMS表面构建图型化基底，利用PDMS表面微纳结构对细胞黏附的促进作用实现单细胞定位生长，芯片无需经过任何物理或化学修饰，即可用于细胞培养，因而具有图型性质和图型结构长期稳定、可靠的特点，克服了基于微接触印刷技术实现图型化时，图型稳定性差的缺陷；克服了目前PDMS表面需经过氧等离子体处理，且处理后须立即进行细胞实验的缺陷。该细胞。
11、培养微芯片将为贴壁依赖型细胞研究及行为控制、理解细胞功能等提供强有力的工具。附图说明0014图1为本发明提出的基于PDMS的三维单细胞培养芯片效果图0015图2为本发明提出的基于PDMS的三维单细胞培养芯片结构示意图0016图3为图2的局部放大图0017图4为图2的AA剖面图0018图5本发明提出的硅模板结构示意图0019图6为图5的AA剖面图0020图7为基于PDMS的三维单细胞培养芯片制备方法示意图0021图8为硅模板制备方法示意图0022图中1腔体，2待培养细胞，3微沟槽具体实施方式0023实施例10024本实施例中的芯片用于培养成骨细胞MC3T3E1来进行细胞接触性连接研究。MC3T3。
12、E1平均直径为20M，平均高度H0为3M，平均突触长度L0为20M。0025参阅图1图3。本实施例中用于MC3T3E1培养的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的圆形腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度H均为4M；腔体1底部包含纳米突起；腔体1直径相邻两个腔体1间的距离L50M；所述微沟槽3呈90均匀分布，微沟槽3宽度A2M。0026本实施例中基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制说明书CN102337213ACN102337224A3/4页5模塑技术完成，具体包括如下步骤0027步骤一按质量为101混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均。
13、匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；0028步骤二将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含圆柱阵列，圆柱直径高度H4M，相邻两个立柱间的距离L50M，立柱间有呈90均匀分布的梁连接，梁宽度A2M，在立柱顶部有不规则纳米突起；0029所述硅模板包括微米图型结构制备和纳米结构制备两部分，其中，所述微米图型结构制备包括如下子步骤0030子步骤一制作掩模版；0031子步骤二光刻；0032子步骤三电感耦合等离子体反应刻蚀，得到符合要求的硅微米结构；具体工艺参数为SF6，气体流量180SCCM/MIN，刻蚀时间14S；C4F6，气体流量85SCCM/MIN，钝化时。
14、间7S；刻蚀/钝化循环的次数为12；刻蚀结束后，以O2作为工作气体，去除光刻胶；0033所述纳米结构制备包括如下子步骤0034子步骤1对硅片表面进行清洗，对硅片的清洗顺序是用丙酮震荡清洗10分钟，然后用乙醇震荡清洗10分钟，再用体积比为31的98的硫酸和30的过氧化氢混合溶液清洗10分钟，最后用去离子水清洗，然后用氮气吹干；0035子步骤2将清洗过的硅片放入等体积比的46MOL/L氢氟酸和001MOL/L硝酸银混合溶液中，室温处理1分钟；0036子步骤3在30条件下，将硅片放入等体积比的2MOL/L氢氟酸和01MOL/L硝酸铁的混合溶液中，处理30分钟，得到硅微纳复合结构；0037子步骤4取出。
15、硅片，用去离子水多次漂清后用氮气吹干，得到所述硅模板；0038步骤三将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为固化温度80，固化时间2H；0039步骤四将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。0040实施例20041本实施例中的芯片用于培养人乳腺上皮细胞HMEC来进行细胞非接触性连接研究。HMEC平均直径为45M，平均高度H0为5M，平均突触长度L0为10M。0042参阅图1图3。本实施例中用于HMEC培养的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的圆形腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度H均为H7。
16、M；腔体1底部包含纳米突起；腔体1直径相邻两个腔体1间的距离L80M；所述微沟槽3呈90均匀分布，微沟槽3宽度A5M。0043本实施例中基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤0044步骤一按质量为101混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；0045步骤二将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含圆柱阵列，圆柱直径高度H7M，相邻两个立柱间的距离L80M，立柱间有呈90均匀分布的说明书CN102337213ACN102337224A4/4页6梁连接，梁宽度A5M，在立柱顶部有不规则纳米突起；0046步骤三将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为固化温度90，固化时间2H；0047步骤四将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。说明书CN102337213ACN102337224A1/3页7图1图2说明书附图CN102337213ACN102337224A2/3页8图3图4图5说明书附图CN102337213ACN102337224A3/3页9图6图7图8说明书附图CN102337213A。