技术领域
该发明主要是应用石榴酸来增强动物，包括哺乳动物和人类免疫应答，减少 免疫激活的副作用，防止免疫炎症和代谢紊乱。更明确地说，是应用石榴酸增强 免疫应答，促进免疫系统发育，防止或改善免疫炎症和代谢紊乱(例如代谢综合 征，肥胖和2型糖尿病)，维护或增强CD4+和CD8+T细胞水平，增进对病毒 性疾病的抵抗能力。
申请引用的文献
本申请是在下列文献基础上的连续申请，文献包括35U.S.C.§120 of.U.S. Utility Patent Application Serial No.11/XXX，XXX[Attorney Docket No. 34548.126]，filed 07 January 2005，and International(PCT)Application Serial No. PCT/US2005/XMX[Attorney Docket No.34548.128]，filed 07 January 2005，both of which also claim priority under 35U.S.C.§119(e)to U.S.Provisional Patent Application No.60/537,617 filed 20 January 2004，参考本文，所有的在先申请在 本说明书中均有提及。
参考文献：
该申请书参考文献见说明书后的章节
概念
以下概念在该申请书中全文应用：
抗原：任何可能被抗体分子或T细胞受体特异性结合的物质。
ANOVA：方差分析。是根据变异来源把所有数据之间的变异分解为几个组 成部分的统计方法。该统计方法被用来确定各治疗组之间的数据差异是否具有统 计学意义。
脂肪生成：新的脂肪细胞或贮脂细胞生成的过程。
CD19：分化群19。B细胞表面表达的一类蛋白。
CD4：分化群4.辅助性T细胞表面的一种共受体。
CD3：分化群3.所有T细胞表面的一种共受体。
CD8：分化群8.细胞毒性T细胞表面的一种共受体。
CD4+T细胞：辅助性T细胞。分泌蛋白质，调节其它免疫细胞应对抗原 活性的一类细胞。
CD8+T细胞：细胞毒性T细胞。能够破坏非正常细胞或使其丧失功能的细 胞，非正常细胞包括肿瘤细胞、病毒感染的细胞以及被细胞内细菌感染的细胞。
Con A：刀豆素A。是一种诱导淋巴细胞增殖的促细胞分裂剂。用Con A刺 激淋巴细胞被广泛用来检验饮食干预免疫功能的效果。
cRPMI：是一种细胞培养基，含有使细胞长期存活的所有必要的营养物质。 详细配方见培养基和试剂准备。
DSS：右旋糖苷硫酸钠。是一种通过饮水(2.5％wt/v)使用的化学药品，可以 使结肠上皮细胞死亡，诱发结肠炎。DSS肠炎模型是一种良好的实验性肠炎性 疾病模型。
抗原决定簇：是位于主要组织相容性复合物I或II的抗原的一部分，可以由 抗体或T细胞受体特异性识别。
FACS：荧光活性细胞缓冲液。一种用于流式细胞计数技术的特殊缓冲液， 可以防止细胞表面标记物内在化。详细组成见培养基和试剂制备。
血糖：血液中葡萄糖的浓度。
高血糖症：血液中葡萄糖浓度升高超过正常值。
高胰岛素血症：血液中胰岛素浓度升高超过正常值。
IBD：肠炎性疾病。肠的免疫源性疾病，以Crohn′s病(CD)and溃疡性结 肠炎(UC)这两种临床表现为特征。
血胰岛素：血液中胰岛素的浓度。
mAb：单克隆抗体。B细胞应答特异性抗原刺激产生的一种抗体，可以结合 于蛋白质的特异部位。
Nutraceutical：类似于营养物质的一种特殊药品。
PBS：磷酸缓冲盐。细胞培养中应用的一种缓冲液。细胞在转移到更有营养 的缓冲液中之前短时间内可以在PBS中悬浮。详细配方见培养基和试剂准备。
TCR：T细胞受体。T淋巴细胞表面表达的一种蛋白质，TCR总是和CD3 分子共同表达，识别特异性抗原。抗原识别后，TCR激活淋巴细胞，启动针对 抗原的免疫应答。
2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病：由于细胞对胰岛素活性无反应而引起 的一类更常见的糖尿病。如果细胞对胰岛素无反应，它们就不能从血液中获取葡 萄糖，过多血糖导致血糖毒性。另外，这些细胞也难以从葡萄糖氧化产生能量这 一途径获得足够能量。
背景技术
免疫应答是机体抵御外来物质入侵引发感染和/或疾病的机制。免疫系统功 能是包括白细胞在内的几种细胞共同参与的复杂过程。当抗原递呈细胞遇到外来 抗原时免疫应答就开始了。抗原递呈细胞使抗原(例如病毒、细菌或其它外来物 质)降解成为小片断排列在抗原递呈细胞表面，这些小片断称为抗原决定簇。
在体内不同克隆T细胞(白细胞的一种)中特殊的一点是，有一种特殊类 型的T细胞克隆能够识别陈列的抗原并结合抗原递呈细胞。这种细胞能够通过 抗原递呈细胞调节一种称作细胞因子的蛋白产物，例如白介素1(IL-1)和肿瘤坏 死因子(TNF)。这些蛋白质在抗原递呈细胞和T细胞中起通讯作用。T细胞也产 生其它蛋白质如白介素2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)。在接下来的过程中，IL-2 命令其它T细胞和杀伤性T细胞繁殖。
辅助性T细胞增殖释放一种物质使B细胞繁殖并产生抗体。这种由B细胞 释放的抗体和自由漂浮的病毒及其它致病原表面的抗原相结合。如果感染被控 制，活化的T细胞和B细胞就被抑制性T细胞抑制。但是少量“记忆性细胞” 仍旧存留，当受到相同致病原再次攻击时会迅速反应。
鉴于机体免疫应答的复杂性，需要进一步研究，揭示新的途径以支持动物免 疫系统，提高免疫应答。理想地来说，新的提高免疫系统的方法应该能够防止或 削弱伴随免疫应答和/或炎症反应的副作用。
目前研究也指出，其它免疫失调如肠炎性疾病(IBD)也可能从深入研究免 疫系统中获益。IBD是一种慢性、反复发作的免疫炎症性疾病，其发病机制不清， 在美国有超过1,000,000，在全世界有几百万人罹患此病。在很大一部分病人中， IBD是慢性疾病的主要因素。IBD分为两种不同的疾病：溃疡性结肠炎(UC)和 Crohn′s病(CD)，虽然这两种疾病临床表现非常相似，溃疡性结肠炎(UC)一般 包括结肠和直肠的炎症，而不是上部胃肠道，相反，CD涉及更大部分的上消化 道，因此更容易引起营养吸收障碍和慢性维生素及营养缺乏。
患IBD临床症状表现为肠道慢性炎症，腹泻，出血，腹痛，发热，关节痛 和体重减少。这些症状有轻有重。IBD可能从最初的轻微不适逐渐不易觉察地发 展，也可能突然表现为急性剧烈症状。
目前对IBD的治疗包括糖皮质激素如6-甲基强的松龙和budesonide，免疫 抑制剂如咪唑嘌呤，6-巯基嘌呤，环胞霉素和甲氨喋呤(Lichtenstein et al.2003)。 新的疗法包括食品与药品管理协会认可的抗肿瘤坏死因子(TNF-a)(Camilleri 2003；Lichtenstein et al.2003；Bassaganya-Riera et al.2004)仍旧处于发展阶段。尽 管现有的治疗IBD方法已经得到改良，但这些方法并不完全有效。另外，传统 疗法经常给患者带来明显副作用。因此，对于免疫炎症性疾病入IBD仍旧需要 新的预防和/或治疗方法。
利用营养物质提高哺乳动物免疫应答的新方法也需要研究。深入研究免疫系 统可能确定防止免疫抑制的营养干预法。
我们也需要研究提高免疫力低下人群，如婴儿、儿童和老年人的免疫应答力 的新方法。这一类人群对于病毒和细菌感染的反应能力有限，从而导致对病毒和 细菌感染性疾病的抵抗力下降。因此，我们需要确定提高这些易患人群免疫力的 新方法，包括营养方法。
治疗或预防代谢紊乱如代谢综合征或X综合征和2型糖尿病也需要新的方 法。在西方社会，肥胖症的高发病率导致几种代谢紊乱如2型糖尿病，心血管疾 病，高血压和高脂血症，这些疾病都表现X综合征特点。大约1500万美国人罹 患2型糖尿病，每年有1百万新确诊的病例，每年花费1320亿美元医疗费。有 些代谢综合征如胰岛素抵抗和肥胖看来与免疫炎症异常有关。腹部脂肪组织中， 免疫、炎症、代谢之间的这些相关性尤其强。Vohl等研究证实，前炎症性细胞 因子及其受体(IL-6和IL-IR)在人类大网膜脂肪组织中表达比在皮下脂肪组织 中表达增加(Vohl et al.2004)。吉非贝齐是一种过氧化酶增生剂α受体的激动剂， 研究证实它可以治疗心血管疾病，并有心脏保护功能，而这种功能并不能仅仅从 它对血脂方面的作用得到完全解释(Rubins et al.2000；Moller et al.2003)。因此， 在改善心血管疾病方面也可能还有其它机制。吉非贝齐调节免疫功能和炎症为其 有效改善健康提供了解释。另外，吉非贝齐是利用作用于代谢、免疫功能和炎症 方式成功干预代谢紊乱的一个例子。
治疗2型糖尿病的新方法包括过氧化酶增生剂γ受体的激动剂，如 thiazolidinediones(TZDs)。然而由于心血管(液流张力和充血性心力衰竭)和肝 脏(脂肪肝)方面的副作用，这种疗法的安全性受到质疑。因此我们需要在预防 或治疗代谢综合征，2型糖尿病和肥胖方面确定新的更安全的方法，包括作用于 免疫、炎症和代谢分子网络的营养疗法。
用石榴酸治疗可能是这样一种安全的新措施。石榴酸是一种无毒，天然，口 服有效的食品成分，数百年来已经被人们知晓并使用。石榴酸天然存在于石榴 (Punica granatum)的种子中，占其油的60％以上。Momordica balsamina是另 一种属于黄瓜家族的药用植物，它也含有相似浓度的石榴酸。石榴种子及其它药 用植物中含有石榴酸在该领域中众所周知。石榴抗癌的作用在业内也是众所周 知。例如，利用石榴治疗疾病是很普遍的。但是，利用石榴酸提高哺乳动物免疫 力的方法并不为人知。例如U.S.Patent 6,630,163 to Murad提供了一个用果汁包 括石榴汁治疗皮肤疾患的方法。这个方法是在治疗上给予至少一个果实提取物这 一有效数量来抑制皮肤疾患。这个方法目的在于治疗皮肤疾患。但是一个方法未 涉及利用石榴籽油或石榴酸来提高免疫力，治疗免疫系统和胃肠道疾病。另外， 利用石榴酸促进免疫系统发育和功能或预防代谢紊乱也未有报道。
U.S.Patent 6,030,622 to Shehadeh谈到一种制备草药提取混合物的方法，这 种混合物包括arum、石榴、茶和hibiscus的提取物。制备石榴提取物用的是石榴 皮，但石榴皮不含有石榴酸，石榴酸只存在于石榴籽中。另外，该方法制备的提 取物是水溶性成分(溶于水或乙醇)，而不是油或石榴酸。
此外，U.S.Patents 6,060,063 and 5,891,440 to Lansky讲述一种制备植物性 雌激素口服补充剂和药膏的方法，以水为溶剂提取石榴籽并与一种草药提取物混 合，该草药提取物含有shizandra berries、中国芦笋根以及中国甘草和中国当归根 二者任选一种。但这个方法也没有讲述应用石榴酸提高哺乳动物免疫力，预防代 谢紊乱。
Japanese Patent 2002238566 to Murase and Imamura讲述克隆基因，合成 catalpic和石榴酸。尽管这一技术可能有助于石榴酸的酶产品合成，但也没有讲 述应用石榴酸提高哺乳动物免疫力，预防代谢紊乱。
其它专利，如英国专利1466418 and 758724，讲述利用石榴酸聚合共轭三烯 脂肪酸改进合成树脂的方法。但这两个专利都没有涉及石榴酸对免疫系统的医药 效果。
此外，尽管有研究证实石榴籽油对抑制人类乳腺癌(MCF-7)细胞的增殖和存 活有用，但这项研究仅完成了离体研究，局部用药(Kim et al.2002)。也有研究证 实石榴籽油治疗化学因素诱导的小鼠皮肤癌有效(Hora et al.2003)。
发明内容
为了满足以上所述的需要，本发明提供了一种提高动物，包括哺乳动物和人 类免疫力的方法。该方法包括给予有效治疗浓度的混合物，该混合物由石榴酸， 及其酯，其合适的盐，其代谢物及化合物。这种混合物单一剂量或多剂量喂给动 物。这种方法利用了石榴酸的自然特性来提高动物包括哺乳动物和人类的免疫 力。
这里提供的方法表明石榴酸可以做为预防或治疗用药，以提高免疫力，治疗 免疫炎症(IBD，过敏和自身免疫性疾病)和代谢紊乱(肥胖和2型糖尿病)。 石榴酸在做为一种辅助疗法，可以进一步提高目前预防和改善IBD治疗的疗效。
因此，我们提供了治疗动物免疫失调的方法，其中包括给动物喂有效剂量的 石榴酸化合物以治疗免疫失调。尽管石榴酸的多种类型都可以应用，我们首选了 石榴酸的自由酸形式。
该发明的首选方法，石榴酸化合物是口服喂给动物的。石榴酸化合物可以单 独或以与其药理学适合的载体化合物形式喂给动物。
石榴酸化合物也可以经静脉或直肠等胃肠道外给药，石榴酸化合物可以单独 给药，也可以与其药理学适合的赋形剂结合后给药。
本发明的另一表现，有效治疗剂量的石榴酸化合物与食物营养补充剂混合后 喂给动物。这种补充剂包括但并不限于以下选择种类：婴儿配方、儿童产品、老 年配方、奶、乳酪、酸奶、谷物面包、体重控制配方、能量面包及其它人类食物、 功能食物和动物食物。
石榴酸也可以与其它活性成分如维生素或其它脂肪酸混合使用。
石榴酸化合物的有效剂量取决于动物的需求。本研究具体提供了对提高一种 动物免疫力的有效剂量。
另一具体体现，我们给动物服用有效剂量的石榴酸化合物，以提高动物对病 毒性抗原，尤其是流行性感冒病毒抗原免疫力。
另一具体实验，我们给动物服用有效剂量的石榴酸化合物以促进动物免疫系 统发育。这一剂量对促进初级及次级淋巴器官和免疫细胞发育尤其有效。这些初 级及次级淋巴器官和免疫细胞包括但并不限于以下：胸腺、脾脏、淋巴结、肠道 内的内脏相关淋巴组织及其它粘膜表面淋巴组织。
另一具体实验，我们喂给动物有效剂量的石榴酸化合物以治疗动物炎性肠道 疾病(IBD)。我们还给动物服用有效剂量的石榴酸化合物以预防或改善IBD的 临床表现和伴随的肠道损害。
另一具体实验，我们喂给动物有效剂量的石榴酸化合物以治疗2型糖尿病和 肥胖。我们还喂给动物有效剂量的石榴酸化合物，使其降低的葡萄糖耐量正常化， 预防高血糖症，预防高胰岛素血症，使腹部脂肪堆积减少到最低。
在另一具体实验中，我们给动物服用有效剂量的石榴酸化合物以增加CD4+ 和CD8+T淋巴细胞水平。我们还喂给动物有效剂量的石榴酸化合物，提高T淋 巴细胞水平同时，预防过度免疫应答，过敏，超敏反应或自身免疫反应。
在另一具体实验中，我们给动物，包括哺乳动物和人，服用有效剂量的石榴 酸化合物以预防免疫抑制。我们还分别给婴儿、儿童、老年人以及其他易患人群 服用，以预防免疫抑制。
这一发明还提供了一个预防和治疗哺乳动物病毒和/或细菌感染的方法，该 方法包括给受试者口服或非胃肠道应用有效且安全剂量的石榴酸。更好的是，这 一方法还能够增强免疫功能，因此能够通过提高受试者免疫功能治疗病毒和/或 细菌感染。
这一发明还提供了应用石榴酸制备合成物来预防和治疗病毒和/或细菌感 染，尤其是提高受试者免疫功能的方法。
这一发明还提供了应用石榴酸制备合成物来预防或改善肠道免疫或炎症性 疾患。
该发明的其它方面还有应用石榴酸制备合成物来促进免疫系统发育，应用石 榴酸制备药物来提高免疫功能，应用石榴酸预防或治疗病毒和/或细菌感染，预 防或改善肠道免疫或炎症性疾患，促进免疫系统发育或提高免疫功能。
该发明还包括在配方成分中添加安全且有效剂量的石榴酸，以提高婴儿配 方、老年配方、奶、乳酪、酸奶、谷物面包、体重控制配方及其它人类食物和动 物食物的营养价值。
该发明中石榴酸的制备剂型可以是方便的单位剂量形式，也可以用药剂学和 营养学工艺众所周知的任何方法来制备。可能的制备剂型包括但并不限于胶囊、 扁形胶囊、片剂、药丸、或锭剂，每种剂型都包含预定剂量的石榴酸。
更有利的是，给需要的动物服用石榴酸剂量没有上限。另外，该发明中的方 法可以用于动物包括哺乳动物和人类的任何年龄和健康状况。例如，易感人群包 括老年人、肥胖者，糖尿病患者、病人或低龄人都可能从该发明中获益，健康无 免疫抑制病史的人也是如此。另外，该发明中的方法可以通过多种方式实施，因 此为哺乳动物提供了促进免疫应答，预防代谢失调的多种多样并且有效的方法。
从以下对该发明首选实验以及相应图表的详细介绍，该发明的应用范围会得 到更完全的体现。
附图说明
图1A是说明实验1中石榴酸饮食和等热量对照组饮食对体重降低不同效 果曲线图。
图1B是说明实验1中石榴酸饮食和等热量对照组饮食对直肠流血不同疗效 曲线图。
图1C是说明实验1中石榴酸饮食和等热量对照组饮食对疾病活动指数不同 效果曲线图。
图2A是实验1中喂养石榴酸的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋显微 照片20x放大
图2B是实验1中喂养石榴酸饮食的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋 显微照片20x放大
图2C是实验1中喂养对照组饮食的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋 显微照片
图2D是实验1中喂养对照组饮食的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋 显微照片20x放大
图2E是实验1中喂养石榴酸饮食的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋 显微照片40x放大
图2F是实验1中喂养石榴酸饮食的小鼠恢复后结肠组织HE染色石蜡包埋 显微照片40x放大
图3A是说明实验4中石榴酸对喂养常规饮食的小鼠血葡萄糖浓度影响的 曲线图
图3B是说明实验4中石榴酸对喂养常规高脂肪饮食的小鼠血葡萄糖浓度影 响的曲线图
具体实施方式
石榴酸
这里应用的名词石榴酸是一种亚麻酸共轭异构体，它包含cis-9，trans-11， cis-13，双结合于碳链的C18、它的无毒性盐、活性酯、活性异构体、活性代谢 物、含有石榴酸的结构脂以及这些物质的混合物。石榴酸还是一种trichosanic acid，存在于Punica石榴(Punicaceae，Pomegranate)和Trichosanthes anguina (Cucurbitaceae，snake gourd)种子的油中。在石榴籽油中石榴酸含量大约为86％。 其无毒性盐包括，例如在烷基团上含有1至6个碳原子的烷酯，以及单-、双-和 三-甘油酯，以及它们的混合物。石榴酸的活性异构体包括几何异构体如 eleostearic acid(cis-9，trans-11，trans-13 octadecatrienoic acid)、它的无毒性盐(如 钠盐、钾盐、钙盐和镁盐)以及它的活性酯(烷基团上含有1至6个碳原子的烷 酯，以及单-、双-和三-甘油酯)，以及它们的混合物。
石榴酸可以是相当纯净的单一的化合物，也可以是以上所述的一种或多种石 榴酸化合物的混合。“相当纯净”在这里的意思是重量上至少达到90％以上的 纯度，最好至少是95％，例如最少98％或更好的99％和100％。石榴酸可以是 已制备好的提取物，也可以从石榴籽油中获得，直接或随后进行一步或多步纯化。
石榴酸有非常强的抗氧化、抗炎和抵抗氧自由基的破坏功能。已经证实石榴 酸可以抗粥样硬化，以及延缓机体癌症发展。石榴酸在生理学上是一种抗氧化剂， 可以降低血浆胆固醇。另外，石榴酸在离体实验研究中有抑制人类血小板聚集和 花生四烯酸代谢的功能。简言之，石榴酸在医学和保健、食品、化妆工业有广阔 的应用前景，在此所述的仅是一小部分。
在此所述的方法中，石榴酸可以是自由酸形式，也可以是通过酯连接形成的 化学物质。石榴酸的天然形式是热稳定的。石榴酸可以其天然油态或干燥粉末状 态使用。另外，石榴酸的自由酸形式可以通过将等价的自由酸和碱性氢氧化物发 生化学反应至一个基本pH值，转化成无毒盐形态，如钠盐、钾盐或钙盐。
服用
在该发明的方法中，我们给动物，包括哺乳动物和人服用有效治疗剂量的石 榴酸化合物。虽然最好的方法是口服或胃肠道外给予石榴酸化合物，其它给药方 式如药物混合或气雾剂也有可能。
口服给药时，有效剂量的石榴酸可以以固体，半固体，液体或气体形式给药。 具体包括片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液、混悬物、糖浆和精油。但石榴酸化 合物并不仅限于这些形式。
本发明中，将石榴酸做成片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液或混悬物给药，石 榴酸化合物最与一种结合剂、一种分解剂和/或一种润滑剂混合。如果有必要， 这种合成的混合物也可以用已知的方法与稀释液、缓冲液、渗透剂、防腐剂和/ 或香料添加剂相混合。举例说明，结合剂包括纤维素结晶、纤维素衍生物、玉米 淀粉和凝胶。分解剂可以用玉米淀粉、马铃薯淀粉和甲羧基纤维素钠。润滑剂包 括滑石粉和硬脂酸镁。另外，添加剂如乳糖、甘露醇也可以使用。
关于肠道外给药，该发明中石榴酸化合物可以通过直肠或注射给药。直肠给 药可以用栓剂。这种栓剂可以通过把本发明中石榴酸与药理学可溶的赋形剂混 合，使之在体温时溶化室温下保持固态。这些赋形剂包括但不限于以下几种：可 可油、碳蜡或聚乙烯醇。最后该化合物可以用业内熟知的方法制成任何想要的形 状。
关于注射给药，该发明中石榴酸化合物可以皮下注射、皮内注射、静脉注射 或肌肉注射。这种注射的药物可以以下方法制备：用已知的方法将本发明中的石 榴酸通过溶解、悬浮或乳化，制成为水溶性或非水溶性的蔬菜油、合成甘油脂酸、 高脂肪酸酯或丙烯醇。如果需要，添加剂如溶剂、渗透压调节剂、乳化剂、稳定 剂或防腐剂也可以使用。
将本发明中石榴酸制备成混悬液、糖浆或精油，需要用药理学上相适合的溶 剂。
本发明中石榴酸化合物也可以与另外的有其它药理学活性的化合物同时使 用，制备成医学用药。
本发明中，石榴酸也可以制成液体或细小粉末，与气体或液体喷雾剂混合， 如果需要，也可以加入一种已知的辅剂如膨胀剂，一起装入一个不受压的容器如 装喷雾剂的容器或喷雾器中，以气雾剂或吸入剂形式给药。加压气体，比如二氯 氟甲烷、丙烷、或氮气可以用做喷雾剂。
石榴酸可以根据需要做为药物或兽药，以片剂、胶囊、溶剂或乳剂给动物包 括哺乳动物和人服用。本发明采用最佳方式，即采用石榴酸的自由酸形式。但 是，石榴酸的其它形式，包括但并不限于以下形式：石榴酸的酯、其药理学相 配的盐、其代谢物和其化合物，都可以以单剂量或多剂量给药。
石榴酸也可以根据需要做为营养添加剂，或食品和营养补充剂。
这里应用的词语“预防或治疗”、“治疗或改善”和其它类似词语包括预防、 全部或部分治疗。这些词语也可以指减轻症状、改善症状、减轻症状的严重程度， 减少疾病发生率或改进治疗结果的病人其它任何病情变化。
石榴酸最好的应用和/或服用形式是化合物。合适的化合物最好是药学化合 物、食品或食物补充剂。这些化合物为利用石榴酸提供了方便的形式。本发明中 的该化合物可以包含一定有效剂量的抗氧化剂以提高石榴酸对氧化的稳定性。
石榴酸的服用剂量最好是每天服用石榴酸或其衍生物大约0.001克到20克 (更好的选择是0.1克到10克，比如0.5克到5克)。其适合的化合物也是相应 剂量。
根据该发明，很好的化合物是食品。食品(包括动物食物)最好含有脂肪， 脂肪里含有石榴酸。食品可以是含有补充脂肪的混合物。例如，这个混合物可以 含有0.3-95wt％，或2-80wt％，最好5-40wt％的石榴酸；99.7-5wt％或 98-20wt％最好95-60wt％的补充脂肪，如可可油、可可油类似物、棕榈油或其小 片断、棕榈核油或其小片断、上述脂肪或其小片断的酯化混合物或液体油，比如 向日葵油、含油量高的向日葵油、豆油、菜籽油、棉籽油、鱼油、红花油含油量 高的红花油和玉米油。适合的食品包括黄油、某些涂抹食品(fat continuous or water continuous or bicontinuous spreads)，脱脂酱、糖果类产品例如巧克力或巧克力糖衣 或巧克力夹心或面包馅、冰淇淋、冰淇淋表层、冰淇淋夹心、敷料剂、蛋黄酱、 乳酪、奶油替代品、汤料、饮料、谷物产品、沙司、快餐、奶制品、临床营养产 品和婴儿配方食品。
其它化合物的例子有药物化合物，如药片、药丸、胶囊、囊片、多微粒包括： 颗粒剂、小珠样剂、小球样剂和装成微胶囊的颗粒、粉末、精油、糖浆、混悬物 和溶液。药物化合物可以包含药理学适合的稀释剂或载体，最好适合胃肠道外给 药(例如口服)。口服给药的化合物可以是固态或液态，可以是片剂、粉末、混 悬液或糖浆。这些化合物也可以选择性加入一种或多种调味剂和/或食用色素。
适合该化合物应用的药理学载体在制药技术领域是众所周知的。本发明中的 化合物可以含有0.1-99％重量的石榴酸。本发明中该化合物通常制成单位剂量形 式。石榴酸的单位剂量最好是1mg到1000mg(更好的选择是100mg到750mg)。 制备这些化合物的赋形剂是本工艺中熟知的赋形剂。
该化合物的其它产品形式是食物补充剂，如以一种软性凝胶形式，或硬的胶 囊形式，胶囊内的物质从以下成分选择：凝胶、淀粉、精炼淀粉、淀粉衍生物如 葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖。装入胶囊的物质可以选择性含有交叉耦合或聚合物、 稳定剂、抗氧化剂、光吸收物质以保护光敏感性物质、防腐剂和类似物。食物补 充剂中石榴酸的单位剂量的适合剂量是1mg到1000mg(最好是100mg到 750mg)。
该发明的方法是给需要的动物服用有效治疗剂量的石榴酸化合物。石榴酸的 有效剂量取决于所用石榴酸化合物的形式，服用持续时间、给药方式(例如口服 或胃肠道外)、动物年龄和动物的状况。
举例来说，增强动物免疫力的石榴酸有效剂量是10-10,000mg/kg/day。适合 的有效剂量是100 to 5,000mg/kg/day，更好的剂量是10 to 100mg/kg/day。本发 明中也预想大约35到40mg/kg/day剂量的石榴酸是有效剂量，38mg/kg/day 是更适合的选择。有效剂量的上限并不重要，因为只要服用者饮食中含有必需脂 肪酸，石榴酸是相对无毒的。
治疗和预防IBD，包括UC和CD的石榴酸有效剂量可以是50到500 mg/kg/day，适合的剂量是100到150mg/kg/day。
使有效剂量的石榴酸在提高动物免疫力方面更有效，服用时间应该为7到 100天，适合时间是15到50天，更好的持续时间是30到42天。
在预防和治疗2型糖尿病和肥胖方面，石榴酸的服用剂量可以是40 to 500 mg/kg/day，更佳的剂量是100 to 150mg/kg/day。
本发明中有效剂量的石榴酸化合物应用于在营养、药用或兽药时，适合的剂 量是大约0.01到2.0％重量比例添加于食品或营养品中。
这个发明涉及到细菌或病毒感染或由细菌或病毒感染导致的疾病或紊乱的 治疗。细菌感染的例子包括，葡萄球菌属、气单孢菌属、军团菌、杆菌或微球菌 属等微生物导致的感染，这些微生物包括但不限于以下：aureus葡萄球菌、嗜水 气单孢菌、嗜肺性军团菌或laterosporus杆菌。病毒感染包括以下感染：微小核 糖核酸病毒、囊膜病毒、副粘病毒、原粘病毒、棒状病毒、呼吸道肠道病毒、逆 转录病毒、本雅病毒、冠状病毒、沙粒病毒、细小病毒、乳头瘤状空泡病毒、腺 病毒、疱疹病毒和水痘病毒。
免疫系统低下导致的疾病或紊乱包括，举例来说，药物治疗导致的疾病或紊 乱(如化疗)、营养不良和感染(如HIV病毒感染和艾滋病)
石榴酸的制备
富含石榴酸的石榴籽油在以前的发明中已经被从石榴籽中分离提取并做为 一种抗癌物质(Kim et al.2002；Hora et al.2003)。将石榴籽从包被它们的果肉中分 离，水中清洗并用对流干燥器烘干。其中的油使用一个40A的电动压榨器用“冷 压榨”法于80℃提取(SkeppstaMaskin，Orebro，Sweden)。每克榨出的油含有 480mg石榴酸。石榴酸也可以用生物酶合成法获得，该方法是本领域已知的技 术(Iwabuchi et al.2003)，(Hornung et al.2002)。
但是，因为酶合成和冷压榨法获取石榴酸提取物效率低下(10％产量)，我 们建议应用溶剂提取法。在使用溶剂提取之前，将石榴籽用蒸汽加热以降低酶水 解，加快处理过程。加热之后，将石榴籽精细研磨用于溶剂提取。常用的液体溶 剂如己烷，在大约12到20小时内，用己烷将石榴籽多次浸湿，伴以搅拌、过滤 和溶剂蒸发。富含石榴酸的石榴籽油也可以用业内熟知的CO2超萃取法产生。
由于这种油在从石榴籽中提取时易受氧化过程影响，所以提取过程最好在氮 气覆盖中进行，以避免与空气接触。另外，这种油是氮气净化的，可以用一种或 多种抗氧化剂在4℃暗室保存，如长期保存，需要置于-20℃。这一从石榴籽中 榨取油的工艺，其产量是油/石榴籽重量比是18％。
本发明中这一方法在下面的实验中会进一步阐述。实验章节中所引用的文 献、专利、专利应用都见于参考文献一节。尽管在前述的说明中该发明被描述成 特定的适合的具体方法，为了说明的需要，也列出了一些细节，业内有经验人士 显然知道这一发明亦适合于其它具体表现，这里所述的一些细节，在不偏离本发 明的基本原理的情况下，可以多种形式相应改变。
以下非限定性例子阐述该发明，但并不以任何方式限定其应用范围。在以下 的例子以及通篇的说明中，所有百分比、部分和比率都是重量比，除非特别说明。
实验
实验1
目的
明确石榴酸对IBD和肠相关性疾病的作用。
方法
在第一个实验中，11C57BL6小鼠每100克食物喂养0或0.6g石榴酸(1％ 石榴籽油)，共喂养38天。在对照组饮食中，石榴酸被等热量的油酸代替(重量 比值)。实验第32天(杀死小鼠前7天)，在饮用水中加入2.5％DSS 36,000到 44,000mol/wt(ICN Biomedicals，Aurora，OH)以诱发小鼠肠炎。IBD的动物模型包 括DSS结肠炎模型是探讨IBD免疫学发病机理的一种方法(Strober et al.2002)， 也是一种检验新的化合物如石榴酸预防和/或治疗效果的安全方法。DSS诱发的 主要特点是它能够破坏上皮细胞屏障，增加细胞对正常管腔和粘膜微绒毛的暴露 (Strober et al.2002)。DSS诱发之后，每天给小鼠称重，由不知情的检查人员检 查结肠炎相关疾病的临床体征(也就是肛门周围粪便、直肠流血、腹泻和毛发竖 立情况)。疾病活性指数和直肠流血分数通过以前发表的混合临床分数法来计算 (Saubermann et al.2000；Bassaganya-Riera et al.2004)。
动物杀死后，取出其结肠、大脑、肾脏、肝脏和脾脏。结肠称重并由不知情 的观察者根据其肉眼损害程度按照0到3的等级计分给予计分(0等于无损害， 3等于严重损害)。将一个小鼠喂饲针接到一个5mL针管上，用消毒1XPBS轻 柔冲洗结肠以去掉结肠内容物。其它组织直接放入福尔马林大烧杯中。所有标本 都标记以下信息：1)小鼠编号；2)采集日期；3)实验编号；4)溶剂类型和 5)组织名称。结肠、大脑、肾脏和肝脏切片用10％缓冲的中性福尔马林固定 (Fisher，Atlanta，GA)，然后石蜡包埋，然后切成6-um薄片，行苏木素-伊红(HE) 染色(AML Labs，Baltimore，MD)，进行组织学观察。组织切片在Olympus显微 镜下(Olympus America Inc.，Dulles，VA)，用Adobe Photoshop Elements 2.0 (Adobe Systems Inc.，San Jose，CA)软件进行处理。
用一种混合组织学方法给结肠分级，该方法包括以下内容：1)隐窝损害和2) 再生，3)化生/增生，4)固有层血管改变，5)粘膜下层变化和6)炎症浸润表 现。将这些切片进行上述指标的0到4分级，数据进行标准化复合计分。例如隐 窝损害：0＝无损害；1＝1/3基底部损害；2＝基底部2/3损害；3＝只有表面上皮 细胞未受损害；4＝隐窝和上皮完全丢失。上皮侵犯：0＝无损害；1＝1/3轻度局 部损害；2＝轻度多灶性损害；3＝全结肠的显著溃疡；4＝结肠结构完全丧失。粘 膜厚度：0＝正常厚度；1＝1/3厚度轻度增加；2＝厚度轻度到显著增加；3＝厚度 显著增加；4＝粘膜堵塞肠内腔隙。再生：4＝无组织修复；3＝表面上皮未受损 害；2＝隐窝损害再生；1＝几乎完全再生；0＝完全再生或正常组织。化生/增 生：0＝无；1＝轻度杯状细胞；2＝严重杯状细胞化生；3＝杯状细胞化生和基底 部不成熟细胞出现并扩展到2/3腺体；4＝和基底部不成熟细胞出现并扩展到2/3 以外的腺体。血管改变：0＝无；1＝固有层轻度毛细血管扩张；2＝固有层和粘膜 下层轻度毛细血管扩张；3＝严重毛细血管扩张；4＝固有层出血。固有层白细胞 浸润：0＝正常浸润(等比的浆细胞和淋巴细胞、中性粒细胞)；1＝固有层中性 粒细胞轻度增高；2＝固有层中性粒细胞轻度增高向粘膜下层扩散；3＝严重中性 粒细胞聚集于固有层和/或粘膜下层；4＝严重中性粒细胞聚集于固有层和/或粘膜 下层，固有层浆细胞转移。脑、肾脏和肝脏标本采集用于评定口服石榴酸的安全 性。
统计学分析采用方差分析(ANOVA).使用以前描述的(Bassaganya-Riera et al.2003)SAS(SAS 1988)一般线性模型程序进行ANOVA。概率值差异(P＜0.05) 认为统计相差显著。
结果
喂给2.5％DSS第六天，对照组结肠炎的死亡率是50％，而喂给石榴酸组小 鼠的死亡率是0％。对照组临床疾病平均发作日期是开始DSS喂水1天后；而喂 给石榴酸组小鼠(control diet)临床疾病直到DSS喂水6天后才出现。平均来说， 对照组小鼠直肠出血是在DSS喂水4天后开始出现，而喂给石榴酸补充饮食的 小鼠直到DSS喂水7天后才出现。喂给DSS导致体重减低、结肠炎相关的临床 疾病和直肠出血，对照组饮食小鼠的这些表现明显比石榴酸补充饮食的小鼠严 重。图1A说明在7天DSS喂水(2.5％，wt/vol)期间，石榴酸饮食(0.6g/100g)和 等热量对照组饮食对体重降低的影响。DSS喂水代表实验诱发IBD。图1B说 明在7天DSS喂水(2.5％，wt/vol)期间，石榴酸饮食(0.6g/100g)和等热量对照组饮 食对直肠出血的影响。图1C说明在7天DSS喂水(2.5％，wt/vol)期间，石榴酸 饮食(0.6g/100g)和等热量对照组饮食对疾病活性指数的影响。DSS喂水之前给小 鼠喂养石榴酸补充饮食32天，结肠炎相关性疾病得到改善。石榴酸饮食小鼠结 肠炎症临床体征的预防和改善与较低的结肠重量和肉眼分析损害严重度较低分 数相关联。
更明确地说，DSS喂水之后，对照喂养组小鼠结肠损害的平均肉眼计分(0 到3等级)是3，而石榴酸喂养组小鼠的分数是1.4。对照喂养组小鼠平均结肠 重量是0.958g，而石榴酸喂养组小鼠的结肠重量是0.153g。较低的结肠重量和 较轻微的损害可能是炎症细胞向结肠迁移降低所致。显微镜下对H&E染色的结 肠组织切片进行组织病理学检查发现，石榴酸喂养组小鼠没有显著损害，而对照 喂养组小鼠出现结肠粘膜增厚，上皮受损，炎症细胞浸润。在20倍镜下，与图2A. 相比，表面上皮缺失可见(图2C)。在40倍镜下，图2E和2F表现炎症细胞 浸润，上皮细胞扁平，上皮受损。图2D表现上皮细胞仍旧保持正常的柱状。
病理表现的计分提示，对照喂养组小鼠结肠损害严重程度高于石榴酸喂养组 (表1)。
表1 2.5％DSS喂水7天后组织学计分 项目 对照饮食 石榴酸饮食 P值 粘膜厚度 4.00±0.42* 1.83±0.24 0.0146 上皮受损 4.00±0.12* 0.00±0.00 0.0001 炎细胞浸润 4.00±0.30* 0.50±0.17 0.0001 血管改变 0.50±0.20 0.50±0.35 0.1927 化生/增生 3.50±0.50* 0.50±0.28 0.0061 隐窝破坏 4.00±0.45 0.33±0.26 0.0009
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
一般认为IBD预防和治疗方法的目标包括诱导产生实质性的临床改善 (Lichtenstein et al.2003)。给动物口服石榴酸导致显著的临床和病理学改善。另外， 对参与新陈代谢的主要器官(如肝脏和肾脏)和脑进行大体标本和组织学检查未 发现异常(数据未提供)，这表明所使用的剂量是有效且安全的。在研究期间我 们未发现副作用。
实验2
目的
检验石榴酸对免疫系统发育、淋巴细胞数量和淋巴细胞功能的影响。
方法
服用方法、剂量和石榴酸制备与实验1相同。
培养基和试剂制备
每种培养基或缓冲液制备完毕后，最后的产物做以下标注：1)产物名称， 2)制备日期，3)有效日期，4)贮存方法，5)技术员名字首字母，和6)无菌状 态。
制备的第一种培养基是cRPMI。这种配方是应用重碳酸盐缓冲系统，更换 氨基酸和维生素剂量的一系列细胞培养基。cRPMI培养基被用做正常人类和 neoplastic白细胞的培养。如适当补充，cRPMI广泛适用于支持多种培养的细胞， 包括新鲜人类淋巴细胞。cRPMI按照以下方法制备：
cRPMI： Amount Component 400mL RPMI 1640 50mL 胎牛血清 5mL 丙酮酸钠 5mL 非必需脂肪酸 10mL 必需脂肪酸 5mL L-谷氨酸盐 5mL 青霉素-链霉素 12.5mL 1M Hepes缓冲液
cRPMI的组成在业内众所周知(Bassaganya-Riera et al.2001)。所有成分在一 个消毒的层流工作罩内合成(Nuaire，Plymouth，MN)，然后用0.22-micron滤过膜 和60-micron的前滤过器过滤消毒(Fisher，Atlanta，GA)。制备好的培养基置于一 个500mL的环氧乙烷清洁的(Sigma，Saint Louis，MO)高压消毒灭菌(121℃ at 15 PSI 30分钟)的带螺丝盖的玻璃瓶，贴上标签，4℃储存。
FACS和PBS缓冲液按照以下浓度配制。
FACS缓冲液： Amount Component 500mL 1XPBS 5mL 胎牛血清 1mL 10％叠氮化钠
混合了这些成分后，将FACS缓冲液贴上标签，4℃储存。
PBS(1X)： Amount Component 1,000.00mL 去离子水 8.00g 氯化钠 1.15g 磷酸钠 0.20g 氯化钾 0.20g 磷酸钾
PBS(10X)： Amount Component 1,000.00mL 水 80.00g 氯化钠 11.50g 磷酸钠 2.00g 氯化钾 2.00g 磷酸钾
*去离子水是从E-纯净水净化系统获得(Barnstead Int.，Dubuque，IA)。
将这些成分混合，搅拌30分钟后，将溶液高压灭菌(Brinkman，Tuttnauer， Jerusalem，Israel)121℃，15PSI 30分钟。通过加入浓缩盐酸或碳酸钠将pH值 调至7.2(AR15PH/MV/TEMP meter，Accumet，Arvada，CO)。
实验2共使用C57BL6小鼠22只。所有小鼠出生于11-23-03，11-16-03断 奶，自12-19-03到1-15-04喂养实验饮食。10只小鼠喂养对照组饮食，12只喂 给石榴酸(0.6g石榴酸/100g食物)补充饮食。每周给小鼠称重。小鼠无痛致死 后，收集每只小鼠的血液制备血清，将血清置于-20℃保存。取出胸腺、脾脏和 结肠淋巴结，称重并在无菌条件下收集于cRPMI。结肠和肝脏标本收集于RNA later(Ambion Inc.，Austin，TX)，-80℃冷冻用于基因表达分析。脑、肾脏、肝脏、 结肠和回肠也收集于10％缓冲的中性福尔马林溶液，其处理步骤同实验1，用 于组织学评定。剩下部分的畜体保存于50mL锥形瓶，-20℃冷冻，用于尸体成 分和脂肪酸分析。所有标本都贴上标签，标注以下信息：1)小鼠编号；2)采集 日期；3)实验编号；4)溶剂类型和5)组织类型。组织切片用Olympus显微 镜(Olympus America Inc.，Dulles，VA)观察。用Flash Bus FBG软件(Integral Technologies，Indianapolis，IN)获取图像，Adobe Photoshop Elements 2.0(Adobe Systems Inc.，San Jose，CA)处理。
脾脏、胸腺和结肠淋巴结在冰块上收集于RPMI。在盛有3mL cRPMI的反 应皿中置两片冰冻玻璃片，轻柔打碎置于冰冻玻片之间的组织，获取单细胞悬浮 液。将单细胞混悬液从反应皿转移到15-mL聚丙烯试管中(Fisher，Atlanta，GA)， 在4℃Eppendorf 5810R离心分离机(Westbury，NY)中以200xg离心冲洗5 min。通过移注试管将浮在表面的物质除去。用试管轻轻撞击一个硬物表面以打 碎细胞团。每只小鼠脾脏细胞、胸腺细胞和结肠淋巴结淋巴细胞总数由Z1 Coulter Single Particle Counter(Miami，FL)记出。简单来说，把10-mL isoton II稀释液 (Beckman Coulter，Miami，FL)加入一个计数瓶，然后加入40μL细胞悬浮液、4 滴Zapaglobin(Beckman Coulter，Miami FL)，和10mL另外的isoton液。用一个 5mL消毒的吸液管来测定再次悬浮细胞的液量。用每毫升所含细胞的浓度和每 个小管中的总液量来计算每只小鼠每个组织的细胞总数。
流式细胞计数
流式细胞计数提供了一种分析细胞包括淋巴细胞表型的高效、敏感和定量的 方法。细胞表达位于膜表面的蛋白质，这些蛋白质可以分为特定的群或亚群，来 推测其某些功能特点如增生扩散的能力和产生抗体的能力等等。单克隆抗体 (mAbs)以一种特异性方式与这些蛋白质(如CD4，CD3，CD8，αβ-TCR，γδ- TCR，and CD 19)结合。在流式细胞检测的应用中，用不同的荧光染料(e.g.藻 红蛋白、PE、荧光素异硫氰酸盐、FITC、cychrome、Cy)标记mAbs。流式细胞 计数目前应用于研究(如免疫表型、淋巴细胞活性测量)和人类免疫缺陷病毒所 致的淋巴损耗、白血病和淋巴瘤的诊断以及移植排斥反应的监测。
为评价石榴酸对脾脏、胸腺和结肠淋巴结中CD4+，CD8+T-cell受体(TCR) αβ+，TCRγδ+，和CD 19+淋巴细胞的作用，用流式细胞计数对从石榴酸喂养和 对照饮食喂养的小鼠中获得的脾脏细胞、胸腺细胞和结肠淋巴结淋巴细胞进行了 表型检查。流式细胞计数使用的描述见实验1。用渗透溶解法(加入4.5mL消毒 去离子水，1到2秒钟后再加入0.5mL 10X PBS制成1X PBS溶液)将红细胞 从脾细胞混悬液中去除。4℃下在Eppendorf 5810R离心分离机(Westbury，NY) 内用离心法以200xg将细胞再次离心冲洗5min。通过移注试管将浮在表面的 物质除去。用试管轻轻撞击一个硬物表面以打碎细胞团。每支管中加入FACS 缓冲液(1mL)。脾脏细胞、胸腺细胞和结肠淋巴结来源的单核细胞由Z1 Coulter Single Particle Counter(Miami，FL)计数，以2×106cells/mL表示。脾脏细胞、胸 腺细胞和结肠淋巴结用以前描述的流式细胞计数(Bassaganya-Riera et al.2001； Bassaganya-Riera et al.2002；Bassaganya-Riera et al.2003)法来分析CD4，CD8， CD3，TCRαβ，TCRγδ和CD19分子的表达。简单来说，把100μL脾脏细胞、 胸腺细胞和结肠淋巴结淋巴细胞混悬液加入一个圆底的微量浓度测定板 (BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)，滴入50μL FACS缓冲的第一抗体溶液。抗 小鼠CD8-PE(1∶200稀释)、抗小鼠CD4-FITC，(1∶500稀释)、抗小鼠 CD3-CyChrome(1∶500稀释)、抗小鼠αβ-TCR-PE(1∶200稀释)、抗小鼠γδ -TCR-FITC(1∶500稀释)、和抗小鼠CD19-PE(1∶500稀释)。CD4和CD8表达用 双色分析法，CD 19表达用单色分析法来测定。用Coulter EPIC XL-MCL流式 细胞仪(Miami，FL)获取数据。采用CellQuest software(BD Biosciences，San Diego， CA)进行数据分析。
淋巴细胞芽生实验
cRPMI培养基的制备见以上所述。96孔平底微量浓度测定板(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)的孔内植入2×105单核细胞，每孔200μL。孔内 含有刀豆素A(5，μg/ml，Con-A；Sigma)，或单纯培养基(无刺激物)。培养板 在37℃5％CO2湿润空气中孵育5天。5天后，每孔内加入10μl含有0.5μ Ci甲基-[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷(特异放射性6.7Ci mmol-l；Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)的培养基，培养板再孵育20h。用一个PHD细胞 收集器(Skatron Instruments Inc.，Sterling，VA)把孔内含物收集到纤维过滤器 上，用液体scintillation counting(Beckman Instruments，Schaumburg，IL)测量其组 合的放射性。样本重复测量三次，刺激孔的计数min-l除以未刺激孔的计数 min-l，计算得出刺激指数(SI)。淋巴细胞芽生分析采用以前发明者描述的方法 进行。(Bassaganya-Riera et al.2001；Bassaganya-Riera et al.2002； Bassaganya-Riera et al.2003).
统计学分析采用方差分析(ANOVA)，使用以前描述的(Bassaganya-Riera et al.2003)SAS(SAS 1988)一般线性模型程序进行ANOVA。概率值差异(P＜0.05) 认为统计相差显著。
结果
淋巴结是对病毒、细菌和其它外来抗原发起免疫应答的次级淋巴器官。除了 γδT细胞，幼稚淋巴细胞从血液再循环到淋巴结，从淋巴结再到组织中。淋巴 结数量增多可能有助于对外来抗原启动更强和更有效的免疫应答。结果表明，石 榴酸喂养小鼠淋巴结淋巴细胞的总数多于对照组饮食小鼠(P＜0.0043)。石榴酸喂 养小鼠淋巴结重量大于对照组饮食小鼠(223.33vs 261.66mg)，但其差异无统计学 意义。另外，淋巴结淋巴细胞亚群表型分析表明，显著扩大的淋巴细胞亚群包括 CD4+T细胞、CD8+T细胞和TCRαβ+T细胞。石榴酸喂养小鼠B淋巴细胞 数量并不显著多于对照组饮食小鼠。这些数据表明，石榴酸喂养的哺乳动物，包 括人类，比非石榴酸喂养的哺乳动物能够诱发更有效的T细胞应答。这一发现 可能提示石榴酸对调节免疫系统发育、免疫健康和感染性疾病抵抗力的作用。表 2描述石榴酸喂养小鼠和对照组小鼠淋巴结的差别。
表2 结肠淋巴结表型和发育分析
项目 对照饮食 石榴酸饮食 P值 重量(mg) 223.33±3.79 261.66±3.28 0.4544 淋巴细胞(×106/mL) 11.03±1.77 18.64±1.53* 0.0043 CD8+T细胞 2.69±0.46 4.53±0.41* 0.0083 CD4+T细胞 4.10±0.64 6.65±0.58* 0.0087 CD3+T细胞 6.07±0.94 10.24±0.85* 0.0043 CD19+T细胞 3.80±0.80 5.98±0.72* 0.0602 TCRαβ+T细胞 6.59±1.14 11.78±1.08* 0.0042
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
脾脏是免疫系统另一个主要器官。脾脏发生的变化类似于血液循环中淋巴细 胞的变化。石榴酸喂养小鼠脾脏重量显著大于对照组饮食小鼠(P＜0.0151)。石榴 酸喂养小鼠脾脏较大是由于αβT细胞数量较多(P＜0.0352)。淋巴细胞群包括 CD4+和CD8+T细胞(表3)。
表3 脾脏细胞表型和发育分析 项目 对照饮食 石榴酸饮食 P值 重量(mg) 752.22±3.65 884.54±3.30* 0.0151 淋巴细胞(×106/mL)数目 148.87±7.89 144.21±7.13 0.6662 CD8+T细胞 13.19±0.80 12.72±0.73 0.6737 CD4+T细胞 16.08±1.22 17.04±1.10 0.5697 CD3+T细胞 29.25±1.97 30.05±1.78 0.7675 CD19+T细胞 106.59±4.99 102.22±5.42 0.5960 TCRαβ+T细胞 29.37±2.13 33.12±1.93* 0.0352
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
胸腺是免疫系统主要器官，起源于骨髓的T细胞前体在胸腺成熟，分化成 成熟的T细胞。成熟T细胞释放进血流，重新进入次级淋巴器官如脾脏和淋巴 结。石榴酸喂养小鼠胸腺重量显著增加提示石榴酸能够促进胸腺细胞发育。使胸 腺体积较多、细胞较多的主要的淋巴细胞群是CD4+和CD8+双阳性胸腺细 胞。这些胸腺细胞表现了成熟CD4+或CD8+T细胞产生之前的成熟过程。有些 双阳性淋巴细胞会分化成CD4+T细胞，其它的会分化成CD8+T细胞。这些数 据表明石榴酸贡献于胸腺发育，因此贡献于免疫系统发育(表4)。
表4 胸腺细胞表型和发育分析 项目 对照饮食 石榴酸饮食 P值 重量(mg) 611.11±5.41 845.00±4.68* 0.0041 淋巴细胞(×106/mL) 63.09±11.04 69.18±9.56 0.6814 CD8+胸腺细胞 1.36±0.21 1.34±0.18 0.9447 CD4+CD8+胸腺细胞 56.48±10.09 63.25±8.73 0.6178 CD4+胸腺细胞 2.39±0.33 2.51±0.28 0.7885 TCRαβ+胸腺细胞 7.39±1.40 9.12±1.21 0.3617
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
表1-4表明，石榴酸促进哺乳动物免疫系统发育(免疫器官重量和/或细胞结 构)，提高T细胞数量(CD4+和CD8+)。表5检验石榴酸是否能够调整这些 淋巴细胞功能。具体来说，表5说明淋巴细胞对于T细胞促分裂剂Con A.刺激 后的增殖能力。结果表明，石榴酸喂养小鼠脾脏细胞增殖能力显著大于对照组饮 食小鼠。这一发现可能说明石榴酸喂养的小鼠，当受到感染，其T细胞能够更 迅速增殖以应对病原体。比较于淋巴结起源的淋巴细胞增殖能力，也会发现同样 的数据变化倾向。但淋巴结的数据差异无统计学意义。
表5 Con A.刺激后淋巴细胞的增殖能力 项目 对照饮食 石榴酸饮食 P值 脾计数/min(cRPMI) 58.66±12.66 73.17±10.96 0.3974 脾计数/min(cRPMI&ConA) 694.00±293.78 1905.27±254.42* 0.0057 脾刺激指数 14.25±3.65 25.20±3.16* 0.0354 淋巴结计数/min(cRPMI) 35.05±4.35 43.12±3.76 0.1772 淋巴结计数/min(cRPMI&ConA) 516.51±186.03 929.06±161.10 0.1100 淋巴结刺激指数 14.83±4.16 22.40±3.61 0.1856
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
实验3
目的
明确接种疫苗后石榴酸对流行性感冒病毒抗原的细胞免疫应答的作用 方法
实验3共使用C57BL6小鼠25只。10只小鼠喂养对照组饮食，15只喂给 石榴酸(0.6g石榴酸/100g食物)补充饮食。所有小鼠在对照饮食或石榴酸补充 饮食喂养9周后，接种含有100μg UV-灭活流行性感冒病毒抗原的流感病毒 (VR-1469)疫苗in Freunds Incomplete adjuvant。补充饮食喂养第15周杀死小鼠， 脾脏在冰块上无菌条件下收集于cRPMI。收集每块组织的单细胞混悬液，方法 同实验1。在盛有3mL cRPMI的反应皿中置两片冰冻玻璃片，轻柔打碎置于冰 冻玻片之间的组织，获取单细胞悬浮液。将单细胞混悬液从反应皿转移到15-mL 聚丙烯试管中(Fisher，Atlanta，GA)，在4℃Eppendorf 5810R离心分离机 (Westbury，NY)中以200xg离心冲洗5min。通过移注试管将浮在表面的物质 除去。用试管轻轻撞击一个硬物表面以打碎细胞团。脾脏细胞数量由Z1Coulter Single Particle Counter(Miami，FL)记出。简单来说，把10-mL isoton II稀释液 (Beckman Coulter，Miami，FL)加入一个计数瓶，然后加入40μL细胞悬浮液、4 滴Zapaglobin(Beckman Coulter，Miami FL)，和10mL另外的isoton液，用于功 能检测。
细胞染色用色素(Carboxy Fluoroscein Succinimidyl Ester简称CFSE)增殖 检测
总计分离了2×107脾脏细胞来进行CFSE增殖检测(分子探针)。细胞以 200xg离心5min，吸出表面漂浮物。细胞在离心机内时，将1瓶CFSE用90μ l二甲基亚砜(成分B)稀释成10mM(成分A)。10mM CFSE溶液稀释成1μ M。总计2×107脾脏细胞团再悬浮于5μM CFSE溶液，在37℃5％CO2湿 润空气中避光孵育10分钟。细胞再次成团、再悬浮于含有10％胎牛血清的3mL RPMI-1640，37℃预热。再次将细胞在37℃5％CO2湿润空气中避光孵育15 分钟。加入含有10％胎牛血清的RPMI-16403mL，将细胞混悬液以200xg离心 5min，用一个消毒Pasteur移液管吸出表面漂浮物。重复最后两步，将细胞再悬 浮于cRPMI。计数染过CFSE的脾细胞，细胞浓度调整为2×106脾细胞/mL cRPMI。将细胞悬浮液(100μL)加入96孔平底微量浓度测定板，板内含有100 μL培养基(无刺激的)，或加入10μg/mL VR-1469流行性感冒病毒抗原的培 养基。每只动物每种喂养方式采样重复六次。将细胞在37℃5％CO2湿润空 气中孵育5天。随着细胞分开，CFSE膜染色减少，导致一个降低的平均荧光密 度。基于不同的平均荧光密度，这一特性被用来辨别增生扩散和未增生扩散的淋 巴细胞。6天后，从6个孔内取出培养的细胞，准备免疫表型检查，这些细胞来 自同一只小鼠同样喂养方式。把100μL CFSE染过的脾脏细胞加入一个圆底的 微量浓度测定板(BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)，滴入50μL FACS缓冲的第 一抗体溶液。抗小鼠CD8-PE(1∶200稀释)、抗小鼠CD4-Biotin，(1∶500稀释)、 抗小鼠CD3-CyChrome(1∶500稀释)、抗小鼠β-TCR-PE(1∶200稀释)、抗小鼠 γδ-TCR-FITC(1∶500稀释)、和抗小鼠CD19-PE(1∶500稀释)。CD4对CD8 染色需要一个额外的步骤，加入streptavidin-Cychrome，使之与生物素结合。细 胞表型用三色分析法来检验。用Coulter EPIC XL-MCL流式细胞仪(Miami，FL) 获取数据。
结果
实验2的结果显示，当应对于促有丝分裂刺激(一种导致增殖的刺激)时， 喂养石榴酸补充饮食能够促进淋巴细胞增生扩散(增殖)，实验3结果表明，石 榴酸也能够促进接种流行性感冒病毒(流感病毒)疫苗后淋巴细胞应对病毒的能 力。实验3检测了石榴酸调节对流行性感冒抗原的免疫应答能力，并检测了石榴 酸对其细胞对象(CD8+T细胞)的作用。通过检测淋巴细胞对流行性感冒病毒 的亚群特异性增殖，我们发现石榴酸能够促进CD8+T细胞对流行性感冒病毒的 反应能力(表6)。这一发现与实验2报告的结果一致，提示石榴酸能够提高已经 接种疫苗动物的病毒性疾病抗病力，预防普通感冒和流感。
表6 淋巴细胞对流行性感冒病毒抗原的亚群特异性增殖 项目 未接种 已接种 P值 对照 石榴酸 对照 石榴酸 CD8+T细胞相 对增殖指数 0.78±0.18 0.57±0.36 0.60±0.40 1.15±0.37* 0.06 CD4+T细胞相 对增殖指数 0.88±0.31 0.68±0.48 0.76±0.58 1.10±0.63 0.33 B细胞相对增殖 指数 1.00±0.04 1.15±0.63 0.96±0.57 1.16±0.27 0.90
以上数值是最小均方±均值标准差。
*表示统计学差异显著。
实验3也是一个补充饮食的长期研究(105天)。小鼠副作用和临床体征的 监测贯穿研究始末。实验中未发现与石榴酸补充饮食相关的不良作用。研究最后， 动物的脑、肾脏、肝脏、心脏和肺被收集，固定于福尔马林用于组织学分析。 H&E染色切片观察提示，显微镜下未见这些器官异常。因此，在105天补充喂 养阶段，石榴酸能够有效且安全地调节免疫功能。
实验4
目的
明确石榴酸对高脂饮食所致肥胖和2型糖尿病发展的影响。具体来说，我们 研究了石榴酸是否能够使高脂肪饮食喂养的小鼠降低的葡萄糖耐量恢复正常，是 否能够预防其高血糖症和高胰岛素血症，以及减少其腹部脂肪堆积。
方法
在西方国家，代谢综合征或综合征X(如糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血 压和高脂血症)在稳定增加。基于营养学的利用口服天然活性化合物的治疗方法 或预防性干预措施的发展不仅是适时的，更是迫切需要的。实验4共使用C57BL6 小鼠50只。25只小鼠喂养对照组饮食，25只喂给石榴酸(0.6g石榴酸/100g食 物)补充饮食。实验的前32天，所有饮食含有7％脂肪、0.02总胆固醇，从脂肪 中获得的热量占14.5％，对照组饮食是将石榴酸替换成linoleic acid(以重量为基 础)(表7)。这些饮食定义为规则性饮食，在不同处理组之间等热量配方。实验 第32天，每组取20只小鼠，开始喂给含有19.6％脂肪、0.2％总胆固醇的高脂 肪饮食，它们从脂肪中获得40.1％热量，对照组高脂肪饮食是将石榴酸替换成猪 油(以重量为基础)(表8)。高脂肪饮食也在不同处理组之间等热量配方。每组剩 下的小鼠(n＝5)喂给规则性饮食。在实验第78天，小鼠被杀死，采血，立即用 Accu-Check Instant Plus System(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN) 检测空腹葡萄糖浓度，或贮存用于以后的血浆胰岛素浓度分析。收集腹部白色脂 肪组织和肩胛间棕色脂肪组织，称重并贮存于-80℃，以便进行RNA分析。肉 眼检查肝脏、肺、肾脏、胰腺和心脏有无异常(大体损害)，固定于磷酸盐缓冲 的福尔马林(10％)，以用于组织学评定，处理方法同实验1。所有标本都贴上标 签，标注以下信息：1)小鼠编号；2)采集日期；3)实验编号；4)溶剂类型和 5)组织类型。
表7 规则性饮食成分1 成分 对照饮食 石榴酸饮食 干酪蛋白 200 200 L-胱氨酸 3 3 谷类淀粉 397.486 397.486 麦芽糊精 132 132 蔗糖 100 100 纤维素 50 50 混合矿物质(AIN-93)2 35 35 复合维生素(AIN-93)3 10 10 酒石酸氢盐维生素B 2.5 2.5 3丁基对苯二酚4 0.014 0.014 豆油 60 60 Linoleic acid 10 - 石榴籽油 - 10
1表示提供大约7％脂肪、0.02总胆固醇，从脂肪中获得的热量占14.5％
2表示每kg饮食供给：3g烟碱酸、1.6g泛酸钙，0.7g维生素B6HCI，0.6 g维生素B1HCI，0.6g核黄素、0.2g叶酸、0.02g D-生物素、2.5g维生素 B12(0.1％于甘露醇)、15g DL-维生素E(500IU/g)，0.8g棕榈酸维生素A (500,000IU/g)，0.2g维生素D3(cholecaleiferol，500,000IU/g)0.075g维生素 K(phylloquinone)，和974.705g蔗糖
3表示每kg饮食供给：357g碳酸钙、196g单碱磷酸钾、70.78g柠檬酸 钾、74g氯化钠、46.6g硫酸钾、24.3g氧化镁、6.06g柠檬酸铁、1.65g碳 酸锌、0.63g碳酸锰、0.31g碳酸铜、0.01g碘化钾、0.01025g硒酸钠、0.00795 g对-钼酸铵、1.45g硅酸钠、0.275g硫酸铬钾、0.0174g氯化锂、0.0815g硼 酸、0.0635g氟化钠、0.0318g碳酸镍、氢氧化物、四水合物、0.0066g钒酸 铵和蔗糖220.716g。
4表示抗氧化剂
表8 高脂肪饮食成分1 成分 对照饮食 石榴酸饮食 干酪蛋白 232 232 L-胱氨酸 3.0 3.0 DL-蛋氨酸 3.5 3.5 谷类淀粉 137 137 麦芽糊精 150 150 蔗糖 162.595 162.595 纤维素 50 50 胆固醇 1.9 1.9 混合矿物质(AIN-93)2 40.60 40.60 磷酸二氢钙 4.64 4.64 复合维生素(AIN-93)3 16.24 16.24 酒石酸氢盐维生素B 5 5 3丁基对苯二酚4 0.02 0.02 维生素K 0.005 0.005 豆油 30 30 猪油 163.5 153.5 石榴籽油 - 10
1表示提供大约19.6％脂肪、0.2％总胆固醇的高脂肪饮食，它们从脂肪中 获得40.1％热量。
2表示每kg饮食供给：3g烟碱酸、1.6g泛酸钙，0.7g维生素B6HCI，0.6 g维生素B1HCI，0.6g核黄素、0.2g叶酸、0.02g D-生物素、2.5g维生素 B12(0.1％于甘露醇)、15g DL-维生素E(500IU/g)，0.8g棕榈酸维生素A (500,000IU/g)，0.2g维生素D3(cholecalciferol，500,000IU/g)，0.075g维生素 K(phylloquinone)，和974.705g蔗糖
3表示每kg饮食供给：357g碳酸钙、196g单碱磷酸钾、70.78g柠檬酸 钾、74g氯化钠、46.6g硫酸钾、24.3g氧化镁、6.06g柠檬酸铁、1.65g碳 酸锌、0.63g碳酸锰、0.31g碳酸铜、0.01g碘化钾、0.01025g硒酸钠、0.00795 g对-钼酸铵、1.45g硅酸钠、0.275g硫酸铬钾、0.0174g氯化锂、0.0815g硼 酸、0.0635g氟化钠、0.0318g碳酸镍、氢氧化物、四水合物、0.0066g钒酸 铵和蔗糖220.716g。
4表示抗氧化剂
葡萄糖耐量实验
实验第78天进行葡萄糖耐量实验。动物头天晚上禁食(14小时)。小鼠腹 膜周注射D-葡萄糖(1mg/kg体重)。通过尾静脉采集血样。注射前血样(时间0)， 15、30和60min后分别采血。
血浆胰岛素浓度测定
通过市场可以购得的酶联免疫吸收剂检验包(Linco Research，St.Charles， MO)进行血浆胰岛素浓度测定
统计
统计学分析采用方差分析(ANOVA)。使用以前描述的(Bassaganya-Riera et al.2004)SAS(SAS Institute Inc.，Cary，NC)一般线性模型程序进行ANOVA。概 率值差异(P＜0.05)认为统计相差显著。
结果
过度腹部脂肪堆积和胰岛素抵抗代表代谢综合征的主要特征。葡萄糖耐量实 验是在体评价葡萄糖动态平衡的标准方法。通过葡萄糖耐量实验，我们发现在两 组喂养规则性饮食的动物当中，其葡萄糖耐量无差异，并不发展成糖尿病表型(图 3A)。但是，喂养对照组高脂肪饮食小鼠使受损葡萄糖耐量正常化的能力显著低 于喂养高脂肪饮食同时补充石榴酸组动物(图3B)。
表9 喂养对照或石榴酸(PUA)补充的规则性和高脂肪饮食小鼠的腹部白色脂 肪组织和肩胛间棕色脂肪组织重量、空腹血浆葡萄糖和胰岛素浓度1 项目 规则性饮食 高脂肪饮食 ANOVA 对照 石榴酸 对照 石榴酸 SEM2 P值 白色脂肪g 0.865b 0.801b 1.478a 0.830b 0.06 0.0001 棕色脂肪g 0.130 0.138 0.129 0.124 0.008 0.08 葡萄糖(mg/dL) 153.8b 121.40b 301.30a 219.5b 11.3 0.0001 胰岛素(ng/mL) 0.932b 0.669b 2.254a 1.229b 0.23 0.01
1表示不同上标标于每行每种特定组织的最小均方值表示差异显著(P＜ 0.05)。
2表示最小均方的标准差。
另外，喂养对照组高脂肪饮食的小鼠其血葡萄糖和胰岛素显著高于喂养高脂 肪补充石榴酸饮食和喂养规则性饮食的小鼠(表9)。因此，石榴酸饮食补充可以 预防或改善高脂肪饮食小鼠高血糖症的发展，改善其高胰岛素血症，使其受损的 葡萄糖耐量正常化(表9)这些发现在预防和治疗2型糖尿病、代谢综合征和它们 的并发症(如心血管疾病、中风、视网膜病、肾病和截肢手术(amputations))方 面具有重大临床意义。
对照组高脂肪饮食小鼠的高血糖症和高胰岛素血症与增加的腹部白色脂肪 组织沉积有关(表9)。然而，组间棕色脂肪组织重量无差异。与对照组饮食比较， 高脂肪饮食补充石榴酸喂养的小鼠腹部脂肪堆积减少，或者是由于受抑制的脂肪 形成所致，或者由于增加的脂肪酸消耗所致。因为石榴酸补充饮食喂养的小鼠未 见有脂肪肝或内脏增大，所以腹部无肥胖不太可能是由于脂肪形成减少所致，而 可能归因于增加的脂肪酸消耗。所有这些提示，石榴酸可以用于治疗和预防胰岛 素抵抗、腹部肥胖和代谢综合征。
可以明白该发明并不仅限用于在此所述的特别方面，还包括它的改良的应用 方式，在以下的权利要求中有这些方面。
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