一种MIR17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201710891241.3 (22)申请日 2017.09.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 107625771 A (43)申请公布日 2018.01.26 (73)专利权人 徐州玖胜医疗器械有限公司 地址 221412 江苏省徐州市新沂市阿湖镇 工业园区323省道西侧8号821室 (72)发明人 张丹丹 杨勇 薛致远 (74)专利代理机构 北京华识知识产权代理有限 公司 11530 代理人 江婷 (51)Int.Cl. A61K 31/473(2006.。

2、01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/00(2006.01) 审查员 贺伊博 (54)发明名称 一种miR-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的 用途 (57)摘要 本发明涉及一种miR-17基因抑制剂及用于 治疗胃癌的用途。 本发明证实， 磺酰胺衍生物A、 C 能有效抑制miR-17表达， 可以制备成miR-17表达 抑制剂； 该磺酰胺衍生物通过抑制miR-17表达可 以有效抑制胃癌细胞增殖， 可以开发成抑制胃癌 生长的药物。 现有技术未见该磺酰胺衍生物在抑 制miR-17表达和抑制胃癌生长方面的报道。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 107625771 B 2。

3、018.12.14 CN 107625771 B 1.一种磺酰胺衍生物用于制备miR-17抑制剂的用途， 其化学结构如下： ； 其中， R为(CH2)n， n为1或3。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107625771 B 2 一种miR-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用途 技术领域 0001 本发明涉及基因药物领域， 尤其涉及一种miR-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用 途。 背景技术 0002 已知miR-17在多种肿瘤细胞中表达异常， 如在胃癌细胞株中表达明显上调， miR- 17抑制剂可以有效抑制胃癌细胞的增殖， 并促进其凋亡(参考文献： 特异性微小RNA抑制剂 对胃癌细胞。

4、增殖的影响， 中国病理生理杂志， 2009)。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种miR-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用途。 0004 为实现上述目的， 本发明提供了以下技术方案： 0005 一种磺酰胺衍生物用于制备miR-17抑制剂的用途， 其化学结构如下： 0006其中， R为(CH2)n， n为1或3。 0007 一种miR-17抑制剂组合物， 包含上述的磺酰胺衍生物， 还包含药学上可以接受的 载体， 制成药学上可以接受的剂型。 0008 优选地， 所述药学上可以接受的载体包括一种或多种固体、 半固体或液体辅料等。 0009 优选地， 所述药学上可以接受的剂型包括注射剂、 片。

5、剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂、 糖 浆剂、 散剂、 膏剂等。 0010 上述的磺酰胺衍生物在制备抑制胃癌增殖的药物中的应用。 0011 上述的组合物在制备抑制胃癌增殖的药物中的应用。 0012 本发明的优点： 0013 本发明证实， 磺酰胺衍生物A、 C能有效抑制miR-17表达， 可以制备成miR-17表达抑 制剂； 该衍生物通过抑制miR-17表达可以有效抑制胃癌细胞增殖， 可以开发成抑制胃癌生 长的药物。 现有技术未见该磺酰胺衍生物在抑制miR-17表达和抑制胃癌生长方面的报道。 附图说明 0014 图1是磺酰胺衍生物A-C对SGC-7901细胞中miR-17表达水平(miR-17/U。

6、6)的影响。 0015 图2是磺酰胺衍生物A、 C对SGC-7901细胞的半数抑制浓度IC50值( M)。 具体实施方式 0016 实施例1： 0017 一、 实验材料 说 明 书 1/4 页 3 CN 107625771 B 3 0018 磺酰胺衍生物A、 B、 C参照文献方法自制， 化学结构如下表： 0019 0020 人胃癌SGC-7901细胞株由本公司长期冻存， 使用前进行复苏。 0021 RPMI-1640培养基、 胎牛血清均购于美国GIBCO公司。 0022 二、 实验方法 0023 1、 细胞培养和分组 0024 人胃癌细胞株SGC-7901培养于含10小牛血清的RPMI1640。

7、培养液中， 置于37、 CO2体积分数为5的培养箱中培养。 1-2d换液， 每3-4d传代1次， 实验时选用对数生长期细 胞。 0025 取对数生长期的SGC-7901细胞， 调整细胞密度为1106个/ml， 随机分组如下： 0026 磺酰胺衍生物A组： 使用含0.5、 2、 5、 25、 50 M磺酰胺衍生物A的培养基孵育24h； 0027 磺酰胺衍生物B组： 使用含0.5、 2、 5、 25、 50 M磺酰胺衍生物B的培养基孵育24h； 0028 磺酰胺衍生物C组： 使用含0.5、 2、 5、 25、 50 M磺酰胺衍生物C的培养基孵育24h； 0029 对照组： 使用不添加药物的空白培养。

8、基孵育24h。 0030 2、 RT-PCR法测定miR-17表达水平 0031 提取总RNA： 收集各组培养24h的SGC-7901细胞， 按德国QIAGEN有限公司产品 miRNeasy Mini kit试剂盒说明书进行样本总RNA提取。 用超微量核酸蛋白测定仪(Thermo 美国)测定提取样本的总RNA浓度及纯度， 待用于后续实验。 0032 逆转录合成cDNA： 按照QIAGEN miScriptRT kit反转录试剂盒说明书进行， 反应 体系20 l： 5HIFlex Buffer 4 l， 10Nucleics Mix 2 l， RT Enzyme Mix 2 l， Total R。

9、NA(浓度约20ng/ l)+RNase-Free H2O2共12 l。 反应条件： 3760min， 955min。 反应在美 国Bio-Rad C1000Touch PCR仪上进行。 0033 实时荧光定量PCR反应： 采用QIAGEN miScript SYBR Green PCRkit试剂盒， 反应 体系20 l： 2Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 l， 10miScript Primer 说 明 书 2/4 页 4 CN 107625771 B 4 Assay 2 l， 10miScript Universal Primer 2 l， 。

10、RNase-FreeH2O25 l， 模板cDNA 1 l。 miR-17特异性引物及U6内参引物均购自德国QIAGEN有限公司产品。 反应在荧光定量PCR仪 (Rotor Gene-Q德国)上进行， 反应条件： 9515min， 1个循环； 9415s， 5530s， 7030s， 40个循环。 每个样本做3个复孔， 在相同反应条件下同时检测miR-17和U6的扩增情况， 程序 运行结束后利用Rotor-Gene Q Series Software软件进行数据分析， 计算miR-17相对U6表 达量。 0034 3、 MTT法检测胃癌细胞增殖率 0035 将SGC-7901细胞密度调整为1.。

11、0106个/mL， 接种于96孔培养板中， 每孔200 L。 置 于37、 CO2体积分数为5及饱和湿度的培养箱内培养。 待细胞贴壁后按照上述分组方法 于给药组加入磺酰胺衍生物A或B或C， 使其终浓度分别为0.5、 2、 5、 25、 50 M。 培养24h后， 每 孔加入MTT(50mg/mL)20 L， 继续培养4h后， 吸去培养液， 每孔加入二甲基亚砜150 L， 在酶标 仪波长570nm处测定吸光度(A)值。 每组实验重复3次， 取均值。 计算细胞抑制率， 细胞抑制率 (1-A给药组/A对照组)100。 0036 使用改良寇氏法计算药物半数抑制浓度IC50值。 0037 二、 实验结果。

12、 0038 1、 药物孵育处理对miR-17表达水平的影响 0039 如表1和图1所示， 与对照组相比， 磺酰胺衍生物A、 C各剂量组均可见miR-17表达水 平显著下调(P0.05)， 磺酰胺衍生物B各剂量组miR-17表达量均未见明显下调(P0.05)。 0040 表1磺酰胺衍生物A-C对SGC-7901细胞中miR-17表达水平(miR-17/U6)的影响 0041 0042 该结果表明， 磺酰胺衍生物A、 C均可以下调SGC-7901细胞中miR-17表达水平， 磺酰 胺衍生物B在测试浓度范围内不能下调SGC-7901细胞中miR-17表达水平， 磺酰胺衍生物A、 C 为SGC-790。

13、1细胞中miR-17表达水平的有效抑制剂。 0043 2、 药物孵育处理对SGC-7901细胞增殖的影响 0044 细胞增殖抑制试验结果显示， 磺酰胺衍生物A、 C以剂量依赖方式抑制SGC-7901胃 癌细胞的增殖， 各剂量组SGC-7901细胞的存活率与对照组存在显著性差异(P0.05)； 磺酰 胺衍生物B各剂量组对SGC-7901细胞的增殖抑制作用不明显， SGC-7901细胞的存活率与对 照组的差异不显著(P0.05)。 磺酰胺衍生物A、 C的IC50值如表2和图2。 0045 表2磺酰胺衍生物A、 C对SGC-7901细胞的半数抑制浓度IC50值( M) 说 明 书 3/4 页 5 C。

14、N 107625771 B 5 0046 磺酰胺衍生物A磺酰胺衍生物C IC50值( M)5.64.9 0047 上述实施例证明， 磺酰胺衍生物A、 C能有效抑制miR-17表达， 可以制备成miR-17表 达抑制剂； 该衍生物通过抑制miR-17表达可以有效抑制胃癌细胞增殖， 可以开发成抑制胃 癌生长的药物。 现有技术未见该磺酰胺衍生物在抑制miR-17表达和抑制胃癌生长方面的报 道。 0048 实施例2： 0049 发明人研究发现， 磺酰胺衍生物A、 C在光照条件下会发生下述降解反应： 0050 0051 其中， R为(CH2)n， n为1或3。 0052 发明人发现， 羧基麦芽糖铁可以抑。

15、制磺酰胺衍生物A、 C光降解。 0053 NO.1注射液： 取磺酰胺衍生物A用灭菌水配制成磺酰胺衍生物A浓度为20mg/mL的 注射液， 盐酸调节pH至4.6； 0054 NO.2注射液： 取磺酰胺衍生物A、 羧基麦芽糖铁用灭菌水配制成磺酰胺衍生物A浓 度为20mg/mL、 羧基麦芽糖铁浓度为5mg/mL的注射液， 盐酸调节pH至4.6； 0055 NO.3注射液： 取磺酰胺衍生物B用灭菌水配制成磺酰胺衍生物B浓度为20mg/mL的 注射液， 盐酸调节pH至4.6； 0056 NO.4注射液： 取磺酰胺衍生物B、 羧基麦芽糖铁用灭菌水配制成磺酰胺衍生物B浓 度为20mg/mL、 羧基麦芽糖铁浓度为5mg/mL的注射液， 盐酸调节pH至4.6。 0057 将上述注射液分别置于光照箱中于4500500Lx光照强度下光照10天(温度为25 2)， 分别测定光照前后磺酰胺衍生物A、 C降解百分比， 结果如表3： 0058 表3光照对磺酰胺衍生物A或C降解的影响 0059 0060 本领域技术人员应当知道， 上述具体实施方式仅用于解释本发明， 本发明的保护 范围并不局限于上述具体实施方式。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107625771 B 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 107625771 B 7 。