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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810662371.4 (22)申请日 2018.06.25 (71)申请人 天津医科大学 地址 300070 天津市和平区气象台路22号 (72)发明人 洪伟 韩涛 章坤 姚庆斌 洪宇桁 韩晓辉 时哲敏 郑丽娜 胡志梅 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 琪琛 (51)Int.Cl. A61K 31/506(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物的 。
2、用途 (57)摘要 本发明公开了ZINC62678696在制备抑制肝 纤维化药物的用途。 本发明提供了能够降低 GPR65活性的物质抑制剂ZINC62678696在制 备能够治疗肝纤维化的产品中的应用。 本发明通 过研究肝纤维化过程中GPR65的作用及机制， 发 现抑制巨噬细胞中GPR65的活性能够减轻肝纤维 化的病情进展。 本发明对于肝纤维化的发病机制 的研究以及未来治疗策略的选择具有重要参考 意义。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 108938638 A 2018.12.07 CN 108938638 A 1.靶向GPR65的抑制剂ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物。
3、的用途， 其特征在于， 其 活性成分为ZINC62678696， 加入药学可接收的辅料按常规方法制成各种剂型， 所述 ZINC62678696化学式为： 。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108938638 A 2 ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物的用途 技术领域 0001 本发明涉及靶向GPR65的抑制剂ZINC62678696用于制备抑制肝纤维化药物的用 途。 背景技术 0002 肝纤维化是多种慢性肝脏疾病向肝硬化发展过程中的必经阶段， 是各种病因如病 毒性肝炎、 酗酒、 寄生虫、 自身免疫性疾病和营养不良等导致炎症、 坏死等组织损伤的修复 反应。 若肝纤维化进程。
4、得不到阻抑或逆转则可能进展为失代偿期肝硬化， 并出现各种终末 期肝病并发症， 严重影响患者生存质量和预后。 相关研究报道肝硬化影响着全球1到2 的人口， 并导致全球每年超过100万人死亡， 而我国是全球肝纤维化及肝硬化发病率、 死亡 率最高的国家之一， 每年有超过10万人死于肝硬化。 但遗憾的是， 目前我们对于肝纤维这个 世界性的医疗堡垒的干预依旧缺乏力量， 寻找能够有效阻止或者逆转肝纤维化的治疗方法 已经成为当务之急。 0003 G蛋白偶联受体(GPCRs)， 又称七个 螺旋跨膜蛋白受体(7TM receptors)， 是目前 已知最大的一类细胞表面受体超家族， 占人类基因组编码的蛋白质总数。
5、的2左右。 它们可 以被细胞外包括激素、 细胞因子、 脂类、 神经递质、 气味、 光线、 离子等在内的各种信号激活， 并将这些信息传送到细胞内， 进而调控一系列的生理进程。 由于其数量庞大、 种类众多且分 布非常广泛， 因此GPCRs与其介导的信号通路的改变会严重影响机体的生命活动。 GPCRs与 糖尿病、 肥胖症、 心血管疾病、 癌症以及炎症有着重大的联系， 这也使得GPCRs成为近几十年 来世界各国公认的极具吸引力的药物治疗靶点。 据统计， 以GPCRs为靶点的药物占整个FDA 批准药物总数的34左右， 且大部分主要的药物公司正在开展基于GPCRs的创新药物研发 项目。 GPCRs中除了趋。
6、化因子受体如CCR2、 CCR5、 CXCR9等在肝纤维化发生、 发展和修复过程 中研究较多外， 其他的GPCRs， 特别是孤儿GPCRs在肝纤维化中的研究并不是非常多， 因此， 进一步寻找在肝纤维化发生过程中起重要作用的GPCRs并探明其作用机理可以为肝纤维化 的治疗提供新靶标。 0004 GPCRs中包括T细胞死亡偶联基因8(TDAG8， 又名GPR65)、 卵巢癌G蛋白偶联受体1 (OGR1， 又名GPR68)、 GPR4和诱导细胞停滞于G2/M期的G蛋白偶联受体G2A(又名GPR132)等能 够感知细胞外质子改变， 统称为OGR1亚家族受体。 其中， GPR65最早被发现在免疫系统中高。
7、 表达， 并影响胸腺细胞凋亡。 GPR65参与了多种疾病的发生， 包括肿瘤、 骨质疏松、 哮喘、 结肠 炎等， 且GPR65在肿瘤中既能发挥促肿瘤作用， 又能发挥抑制肿瘤的作用。 研究发现， 过表达 GPR65能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖以及增强肿瘤细胞对酸性环境的抵抗力， 而敲低 GPR65可逆转此类表型， 体内实验结果也进一步验证了GPR65有促进肿瘤生长的作用。 目前 已在结肠癌、 乳腺癌等多种恶性肿瘤中发现GPR65高表达， 而在恶性血液病中GPR65的表达 量显著减少。 研究表达GPR65在恶性血液病中发挥肿瘤抑制特性主要是通过抑制癌基因c- Myc的表达。 此外， GPR65还被。
8、报道参与MMPs的表达调节。 然而， 有关GPR65在肝纤维化过程中 的表达、 功能及作用机制尚未有报道。 说 明 书 1/6 页 3 CN 108938638 A 3 0005 既往研究表明GPR65在被细胞外H+激活后引起细胞内腺苷酸环化酶(cAMP)的蓄 积。 Im等曾报道神经鞘氨醇半乳糖苷(Psychosine， PSY)可以激活GPR65， 然而他们并没有明 确的证据证明PSY和GPR65特异性结合。 而且后续的多项研究表明GPR65并不参与PSY引起的 多核细胞形成。 为了寻找到GPR65更加特异性的配体， Oda等通过文库筛选发现一种名为 “BTB09089” 的化合物是GPR6。
9、5的特异性激动剂。 Roth及同事最近的研究利用基于酵母的筛 选方法在310万个分子中进一步确定 “BTB09089” 化合物是GPR65的一种强效激动剂， 而且识 别出名为 “ZINC62678696” 的一种新化合物是GPR65的一种强效特异性抑制剂。 然而， 这种新 化合物对肝脏疾病特别是肝纤维化中的作用还未有报道。 发明内容 0006 为了解决现有技术中的问题， 本发明提供ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物 的用途， 解决现有技术中没有特效药物有效阻止或者逆转肝纤维化的问题。 0007 本发明的技术方案是： ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物的用途， 其活性成 。
10、分为ZINC62678696， 加入药学可接收的辅料按常规方法制成各种剂型， 所述ZINC62678696 化学式为： 0008 0009 本发明的有益效果是： 针对GPR65的抑制剂ZINC62678696体内外实验均能显著抑 制小鼠肝纤维化的进展； 而GPCRs成为近几十年来世界各国公认的极具吸引力的药物治疗 靶点。 因此， ZINC62678696在制备抑制肝纤维化药物上具有良好的前景。 附图说明 0010 图1： 基因芯片技术筛选出GPR65在纤维化肝组织中高表达； (A)基因芯片检测对照 小鼠与肝纤维化小鼠mRNAs的热点图； (B)qRT-PCR技术在扩大样本的正常和纤维化Balb。
11、/c 小鼠肝组织中验证mRNAs的差异， *p0.05； 0011 图2： GPR65在小鼠纤维化的肝组织中表达增多； (A)腹腔注射CCl4后第0、 2、 4、 6、 8、 10周后提取肝组织的总RNA， qRT-PCR检测 -SMA和GPR65的表达变化； (B)胆管结扎(BDL)后 第0天、 第3天、 第14天及第21天提取肝组织的总RNA， qRT-PCR检测 -SMA和GPR65的表达改 变， *p0.05； 0012 图3： GPR65在纤维化的肝组织中表达增多； 免疫组织化学染色(IHC)检测正常人和 肝硬化患者肝组织中以及正常小鼠和纤维化小鼠的肝组织中GPR65的表达和定位； 。
12、0013 图4： GPR65的表达分析； (A)从正常小鼠肝脏中分离原代肝星状细胞(HSCs)、 肝细 胞(HCs)和肝巨噬细胞(HMs)， qRT-PCR技术检测GPR65的表达水平； (B)分别提取正常小鼠及 肝纤维化小鼠的肝巨噬细胞， qRT-PCR检测IL-1 、 TNF- 、 MCP1和GPR65的表达水平， *p 0.05； 说 明 书 2/6 页 4 CN 108938638 A 4 0014 图5： 体外实验证实抑制GPR65下调促炎症基因及M1型巨噬细胞marker基因表达； (A)从小鼠骨髓中提取单核细胞， 用100ng/ml M-CSF培养7天后添加30 M GPR65特。
13、异性抑制 剂ZINC62678696处理24小时， 随后qPCR技术检测IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C的表达变 化； (B)30 M GPR65特异性抑制剂ZINC62678696处理RAW264.7细胞24小时后， qPCR技术检测 IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C的表达变化， *p0.05； 0015 图6： 体内实验证实抑制GPR65缓解CCl4诱导的小鼠肝纤维化； (A)四组小鼠(腹腔 注射橄榄油+注射生理盐水组； 腹腔注射CCl4+注射生理盐水组； 腹腔注射橄榄油+注射 GPR65抑制剂组； 腹腔注射CCl4+注射GPR65抑制剂。
14、组)肝组织羟脯氨酸含量测定； (B)四组小 鼠的肝组织切片HE染色、 天狼猩红染色及Masson染色的比较， */#p0.05， *p0.05vs对照.# p0.05vs对照+CCl4。 具体实施方式 0016 实施例1 0017 ZINC62678696加入药学可接收的辅料按常规方法制成各种剂型， 如各种规格的液 体注射剂， 粉针注射剂， 注射用乳剂， 片剂， 丸剂， 胶囊剂， 膏剂， 霜剂， 贴剂， 擦剂， 粉剂， 喷雾 剂， 植入剂， 滴剂， 栓剂， 软膏剂， 糖果剂等。 0018 ZINC62678696的给药途径包括各种给药途径： 口服给药， 注射给药， 植入给药， 腔 内给药， 舌。
15、下给药， 肛门给药， 透皮给药， 内外敷等。 0019 实验例1： 基因芯片筛选与验证 0020 通过基因芯片对纤维化肝组织与正常肝组织中的差异mRNAs进行筛选。 该芯片是 目前最强大的全转录组研究工具， 设计有550万个探针， 其中基本包括所有已知的经典转录 本以及预测出的所有可能基因转录形式。 此外该芯片针对每条序列都设计了多条探针， 增 加了信号的可靠度。 我们提取5个纤维化肝组织和5个正常肝组织的总RNA， 质检合格后通过 高通量芯片筛选， 并按照纤维化肝组织与正常肝组织表达差异在1.6倍以上并且P值小于等 于0.05的标准， 发现在纤维化肝组织与正常肝组织差异表达的mRNAs有15。
16、26个， 其中在纤维 化肝组织中过表达的mRNAs有1007个， 下调表达的mRNAs是有519个。 在扩大样本的正常和纤 维化Balb/c小鼠肝组织中验证芯片筛选的差异GPCRs的表达， 发现GPR65在纤维化的肝组织 中高表达。 0021 如图1所示： (A)基因芯片检测对照小鼠与肝纤维化小鼠mRNAs的热点图； 结果证实 在纤维化肝组织与正常肝组织差异表达的mRNAs有1526个； (B)qRT-PCR技术在扩大样本的 正常和纤维化Balb/c小鼠肝组织中验证mRNAs的差异， 证实芯片结果准确可靠， GPR65在纤 维化的肝组织中高表达。 *p0.05。 0022 实验例2： 构建CC。
17、l4及胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型 0023 CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型： 购买36只balb/c雄性小鼠， 正常喂食一周后， 随机 平均分为6组， 每组6只： 对照组(注射橄榄油)和CCl4 2、 4、 6、 8、 10周组。 CCl4组小鼠为腹腔注 射0.3ml/kg CCl4(5， v/v,溶于橄榄油； )， 共8周每周两次。 处理8周后利用水合氯醛麻醉 处死对照组和CCl4组小鼠， 记录肝脏外观变化及拍照， 并取肝组织分别固定以及冻存用于 后续试验。 0024 胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型： 说 明 书 3/6 页 5 CN 108938638 A 5 00。
18、25 (1)购买24只balb/c雄性小鼠正常喂食一周后， 随机平均分为四组， 每组6只： 对照 组(只开腹缝合不进行手术)和BDL(胆管结扎)3、 14、 21天组。 0026 (2)手术前一晚禁止小鼠饮水吃食， 手术必须在无菌间进行， 术后恢复期注意止 痛、 保暖、 无菌。 所有手术器材均需高压灭菌后使用。 0027 (3)备皮后腹腔注射水合氯醛麻醉； 0028 (4)开腹： 手术部位铺一张洞巾暴露腹部， 依次剪开皮肤和筋膜(开口约2cm)， (手 术剪11.5cm)后放入扩胸器， 沿腹中线剪开腹膜， 然后将缝合线穿入胸骨适当拉升并固定； 0029 (5)往腹腔滴加生理盐水， 用湿棉签轻移。
19、肠道器官以暴露胆总管； 用弯头镊将胆总 管完全游离； 0030 (6)用两道缝合线结扎胆总管， 各打三个结并剪断多余长度； 轻轻撤掉扩胸器； 0031 (7)向腹腔中滴加生理盐水并使器官回位， 依次缝合腹腔及表皮， 间隔适宜； 0032 (8)将小鼠转移至温暖的环境使其自然清醒， 腹部每天用碘伏进行消毒， 密切观察 小鼠状态； 0033 (9)21d后注射过量水合氯醛麻醉处死小鼠， 记录肝脏外观变化及拍照， 取肝组织 分别固定以及冻存用于后续试验。 0034 如图2所示： GPR65在纤维化的肝组织中表达增多。 0035 (A)腹腔注射CCl4后第0、 2、 4、 6、 8、 10周后提取肝组。
20、织的总RNA， qRT-PCR检测 -SMA 和GPR65的表达变化； 结果证实 -SMA和GPR65在纤维化的肝组织中表达量逐渐增多； (B)胆 管结扎(BDL)后第0天、 第3天、 第14天及第21天提取肝组织的总RNA， qRT-PCR检测 -SMA和 GPR65的表达改变； 结果证实 -SMA和GPR65在纤维化的肝组织中表达量逐渐增多。 *p0.05。 0036 实验例3： 免疫组化染色步骤 0037 (1)烤片、 常规脱蜡、 再水合； 0038 (2)1PBS洗3遍， 每次5分钟； 0039 (3)抗原修复： 将需要修复的玻片放入抗原修复液中， 然后置于高压锅， 从常温升 至108。
21、后保持5分钟(不同的抗体修复时间不尽相同)； 0040 (4)取出后自然冷却至室温， 倾倒掉修复液； 0041 (5)1PBS洗3遍， 每次5分钟； 0042 (6)H2O2封闭： 首先用1PBS将30的H2O2稀释至3， 然后用100 l的移液枪滴加 到擦去周围水的组织块上， 湿盒中避光静置15分钟； 0043 (7)1PBS洗3遍， 每次5分钟； 0044 (8)山羊血清封闭： 擦去组织块周围的水， 然后将玻片放入湿盒中， 用100 l的移液 枪滴加山羊血清(1PBS稀释10倍)室温15分钟(不同抗体封闭时间不尽相同)； 0045 (9)滴加一抗GPR65： 弃山羊血清， 将组织块周围擦干。
22、(否则不能形成表面张力， 一 抗容易流到一旁， 导致干片)， 并标记抗体的名称， 然后置于湿盒中， 100 l的移液枪滴加相 应的抗体， 4冰箱避光过夜(约16小时)； 0046 (10)从4冰箱取出湿盒， 室温复温15分钟； 0047 (11)将一抗回收到标记(抗体名称、 稀释比例、 回收日期)好的EP管中； 0048 (12)1PBS洗3遍， 每次5分钟； 0049 (13)滴加二抗： 用100 l的移液枪滴加酶标二抗(无菌1PBS稀释， 1:200)， 置于湿 说 明 书 4/6 页 6 CN 108938638 A 6 盒中37恒温避光孵育1小时； 0050 (14)1PBS洗3遍， 。
23、每次5分钟； 0051 (15)DAB显色： 首先取1ml的A液并滴加2滴B液配制成DAB显色液(现配现用)， 然后 用100 l的移液枪滴加至完全覆盖组织块， 显微镜下控制显色时间， 蒸馏水终止； 0052 (16)复染： 擦干玻片周围的水， 置于装有苏木精的染色缸中， 染色2分钟； 0053 (17)返蓝： 使流水从玻片的一侧缓慢冲洗掉染液， 并在自来水中返蓝20分钟； (18) 脱水、 透明、 封片； 0054 (19)待自然风干后置于电子显微镜下观察； 0055 (20)注意以上操作步骤严禁组织块风干。 0056 如图3所示， GPR65在纤维化的肝组织中表达增多 0057 免疫组织化。
24、学染色(IHC)检测正常人和肝硬化患者肝组织中以及正常小鼠和纤维 化小鼠的肝组织中GPR65的表达和定位； 结果证实GPR65在纤维化或硬化的肝组织中高表 达， 且主要定位在肝巨噬细胞中。 0058 实验例4： GPR65抑制剂ZINC62678696的体外实验： 0059 如图4所示， GPR65的表达分析 0060 (A)从正常小鼠肝脏中分离原代肝星状细胞(HSCs)、 肝细胞(HCs)和肝巨噬细胞 (HMs)， qRT-PCR技术检测GPR65的表达水平； 结果证实GPR65主要存在于肝脏巨噬细胞中； (B)分别提取正常小鼠及肝纤维化小鼠的肝巨噬细胞， qRT-PCR检测IL-1 、 T。
25、NF- 、 MCP1和 GPR65的表达水平； 结果证实GPR65在纤维化的巨噬细胞中高表达。 *p0.05。 0061 如图5所示， 体外实验证实抑制GPR65下调促炎症基因及M1型巨噬细胞marker基因 表达 0062 (A)从小鼠骨髓中提取单核细胞， 用100ng/ml M-CSF培养7天后添加30 M GPR65特 异性抑制剂ZINC62678696处理24小时， 随后qPCR技术检测IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C 的表达变化； 结果证实抑制GPR65显著下调IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C的表达水平； (B) 30 M GPR6。
26、5特异性抑制剂ZINC62678696处理RAW264.7细胞24小时后， qPCR技术检测IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C的表达变化； 结果证实抑制GPR65显著下调IL-1 、 CXCL5、 CCR2、 iNOS和LY6C的表达水平。 *p0.05。 0063 实验例5： GPR65抑制剂ZINC62678696的体内实验： 0064 40只6周龄SPF级雄性Balb/c小鼠正常饲喂一周后， 随机平均分为四组(n10)： 对 照组、 对照+CCl4组、 GPR65抑制剂ZINC62678696组和GPR65抑制剂ZINC62678696+CCl4组。 对 照组为腹。
27、腔注射橄榄油， 同时腹腔注射生理盐水； 对照+CCl4组为腹腔注射5CCl4(v/v， 溶 于橄榄油； 0.3ml/kg， 每周2次)， 同时腹腔注射生理盐水； GPR65抑制剂组为腹腔注射橄榄 油， 同时腹腔注射GPR65抑制剂ZINC62678696； GPR65抑制剂ZINC62678696+CCl4组为腹腔注 射5CCl4， 同时腹腔注射GPR65抑制剂ZINC62678696。 CCl4注射4周后， 各小鼠开始通过腹腔 注射GPR65抑制剂ZINC62678696， 抑制剂ZINC62678696的注射量为10mg/kg， 每2天一次； 抑 制剂ZINC62678696用DMSO溶解。
28、成30mM， 随后缓慢溶解至橄榄油中， 注射体积一般不超过200 l。 抑制剂ZINC62678696开始注射后CCl4再腹腔注射4周， 最后一次注射48小时后所有小鼠 麻醉处死。 如图6所示， 体内实验证实抑制GPR65缓解CCl4诱导的小鼠肝纤维化(A)四组小鼠 (腹腔注射橄榄油+注射生理盐水组； 腹腔注射CCl4+注射生理盐水组； 腹腔注射橄榄油+注 说 明 书 5/6 页 7 CN 108938638 A 7 射GPR65抑制剂组； 腹腔注射CCl4+注射GPR65抑制剂组)肝组织羟脯氨酸含量测定， 结果证 实对照+CCl4组的肝组织羟脯氨酸含量显著高于CCl4+注射GPR65抑制剂组。
29、； (B)四组小鼠的 肝组织切片HE染色、 天狼猩红染色及Masson染色的比较， 结果证实抑制GPR65显著抑制肝纤 维化的进展。 */#p0.05。 *p0.05vs对照.#p0.05vs对照+CCl4。 0065 综合以上全部结果， 可见： 对巨噬细胞靶向使用GPR65的抑制剂来控制肝纤维化的 病情进展会成为一种可能。 抑制巨噬细胞中GPR65的活性能够延缓肝纤维化的病情进展(用 于各种慢性肝病特别是肝纤维化的治疗)。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108938638 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/5 页 9 CN 108938638 A 9 图2 说 明 书 附 图 2/5 页 10 CN 108938638 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 3/5 页 11 CN 108938638 A 11 图5 说 明 书 附 图 4/5 页 12 CN 108938638 A 12 图6 说 明 书 附 图 5/5 页 13 CN 108938638 A 13 。