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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810700648.8 (22)申请日 2018.06.29 (71)申请人 佛山科学技术学院 地址 528000 广东省佛山市南海区狮山镇 仙溪水库西路佛山科学技术学院 (72)发明人 刘连 李亚君 刘腾 彭咏波 崔亮 李雄 刘武昆 刘靖 谢国健 (74)专利代理机构 广东广信君达律师事务所 44329 代理人 张燕玲 杨晓松 (51)Int.Cl. A61K 31/519(2006.01) A61K 31/4375(2006.01) A61P 35/00(2006.01。
2、) (54)发明名称 一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物及 其用途 (57)摘要 本发明属于天然药物领域， 公开了一种甲氨 喋呤和小檗碱复方药物组合物及其用途。 该复方 药物组合物的活性成分是由摩尔比为1:11: 100的甲氨喋呤和小檗碱组成。 两者联合用药具 有较强的协同治疗淋巴瘤的用途。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 108938640 A 2018.12.07 CN 108938640 A 1.一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 其特征在于： 该复方药物组合物的活性成 分是由甲氨喋呤和小檗碱组成。 2.根据权利要求1所述的一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 其特征在于：。
3、 所述甲 氨喋呤和小檗碱的摩尔比为1:11:100。 3.根据权利要求1所述的一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 其特征在于： 所述甲 氨喋呤和小檗碱的摩尔比为1:51:50。 4.根据权利要求1所述的一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 其特征在于： 所述甲 氨喋呤和小檗碱的摩尔比为1:50。 5.根据权利要求1所述的一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 其特征在于： 该复方 药物组合物还含有药物上可接受的载体。 6.根据权利要求15任一项所述的甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物在制备抗淋巴 瘤药物中的用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108938640 A 2 一种甲氨喋呤和。
4、小檗碱复方药物组合物及其用途 技术领域 0001 本发明属于天然药物领域， 特别涉及一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物及其 用途。 背景技术 0002 癌症是严重危害人类健康的一大顽症， 现已成为仅次于心血管病的第二大杀手。 进入21世纪以来， 由于现代工业化的快速进程， 环境污染等诸多因素导致淋巴细胞系统免 疫被破坏而引起淋巴瘤发病率呈逐年上升的趋势， 使我们意识到研发出一种能够用于防治 淋巴瘤的药物系统显得非常迫切。 0003 甲氨蝶呤(Methotrexate， MTX)， 属于抗叶酸代谢肿瘤药物。 化学结构与叶酸类似， 通过竞争性抑制细胞中二氢叶酸还原酶(DHPR)的活性， 使二氢叶酸。
5、(FH2)还原为四氢叶酸 (FH4)受阻， 使5,10-甲酰四氢叶酸产生不足， 从而使脱氧胸苷酸(dTMP)合成受阻， DNA合成 障碍。 MTX也可阻止嘌呤核苷酸的合成， 因其环上的第2位和第8位碳原子是由四氢叶酸携带 的一碳基团所供给， 故能干扰蛋白质的合成。 0004 MTX在恶性淋巴瘤治疗中起着举足轻重的作用， 因而虽然其已有60多年的使用史， 目前仍被临床广为应用。 大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX， 指MTX剂量大于1g.m-2)是治疗淋巴瘤及 预防淋巴瘤中枢转移的主要药物之一。 MTX在恶性淋巴瘤临床治疗中， 长期给药均需要大剂 量使用， 由于个体差异大， 需要在血药浓度监测下使用，。
6、 以保证用药安全。 MTX主要作用于快 速增殖的肿瘤细胞和更新快的细胞， 故其常见毒副反应有皮肤粘膜损伤、 骨髓抑制， 还可见 胃肠道反应和肝肾毒性。 如何口服MTX的副作用， 同时更好发挥抗癌效应是一个非常值得关 注和研究的医学问题。 0005 小檗碱又名黄连素(berberine， BER)， 是我国历史悠久的传统药物， 是从黄连根茎 中提取出来的一种异喹啉类生物碱。 小檗碱药理作用广泛， 最开始被作为一种清热解毒药 和抗菌药应用在临床治疗上， 并且得到了普遍认同； 主要用于治疗心血管疾病， 如抗心律失 常、 抗心衰、 降血压、 调节血脂等， 另外对胃肠炎、 细菌性痢疾等肠道感染、 眼结膜。
7、炎、 化脓性 中耳炎等也有效。 近年来， 随着对小檗碱的更进一步的研究， 发现其在抗肿瘤发面疗效也很 显著。 可以通过调节细胞周期阻滞在G2期， 抑制肿瘤细胞增殖和扩散， 诱导线粒体损伤从而 抑制ATP生成， 或诱导肿瘤细胞凋亡和分化等途径抑制肿瘤的形成、 增殖及转移等途径发挥 对多种肿瘤的抗肿瘤作用。 此外， BER价格低， 毒副作用小， 安全性高。 这些为复合MTX和BER 给药治疗恶性肿瘤淋巴瘤提供了全新的机会。 0006 将甲氨喋呤的优越抗癌疗效与具有明确靶标的临床药物联合协同治疗淋巴瘤等 恶性肿瘤， 是一个值得关注而又很有潜力的抗肿瘤复合药物方向。 组合甲氨喋呤和小檗碱 用于恶性肿瘤。
8、淋巴瘤的预防和治疗作用尚未见相关文献报道几乎没有。 发明内容 0007 为了克服现有技术中存在的缺点和不足， 本发明的首要目的在于提供一种甲氨喋 说 明 书 1/5 页 3 CN 108938640 A 3 呤和小檗碱复方药物组合物； 该复方药物组合物的活性成分是由甲氨喋呤和小檗碱组成。 0008 本发明的另一目的在于提供一种上述复方药物组合物的用途； 药理试验证明该复 方药物组合物具有协同抗淋巴瘤作用。 0009 本发明的目的通过下述技术方案实现： 0010 一种甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物， 该复方药物组合物的活性成分是由甲氨 喋呤和小檗碱组成。 0011 优选的， 所述甲氨喋呤和小檗碱。
9、的摩尔比为1:11:100。 0012 更加优选的， 所述甲氨喋呤和小檗碱的摩尔比为1:51:50。 0013 更加优选的， 所述甲氨喋呤和小檗碱的摩尔比为1:50。 0014 该复方药物组合物还含有药物上可接受的载体。 0015 所述复方药物组合物按照常规制备工艺制备得到。 0016 上述的甲氨喋呤和小檗碱复方药物组合物在制备抗淋巴瘤药物中的用途。 0017 上述药物可用于包括人在内的哺乳动物的淋巴瘤的治疗。 0018 本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果： 0019 本发明人在对甲氨喋呤(MTX)和小檗碱(BER)配伍药理活性的研究中发现， 将甲氨 喋呤和小檗碱组合给药， 特别。
10、是当两者摩尔比为1:5-1:50配伍时具有很好抗癌细胞的协同 作用； 发明人分别对Daudi， Raji和BC-3为模型进行体外MTT筛选， 发现其具有很强的抗增殖 活性并呈良好的时效与量效关系， 结合经典联合给药分析原理(Median-effect Principle)和统计分析， 结果表明其具有协同作用， 尤其是在fa0.5时可明显产生协同效 应抑制三种癌细胞增殖， 这说明MTX和小檗碱组合物可在低剂量配伍时产生MTX或BER单药 高剂量的生物学效应， 从而可以大大降低药物的毒副作用产生， 具有良好的临床用药开发 前景； 同时， 等效应剂量评价表明， 复合药物对正常肝细胞L-O2的毒性尚未。
11、增加。 附图说明 0020 图1为MTX和BER及优化配伍组合作用PBMC细胞72小时的安全性评价(细胞凋亡 率)。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0022 实施例1： 采用Daudi细胞、 Raji细胞和BC-3细胞筛选优化甲氨喋呤(MTX)和小檗碱 (BER)复方药物组合物 0023 取对数生长期的细胞， 分别接种3104个细胞/孔于96孔板上， 待生长6小时后， 离 心弃上清， 然后按以下分组给药： 肿瘤细胞设不加药组和加药组， 其中加药组设MTX和BER单 药组、 MTX和BER联合用药不同摩尔比例组， 每组设4-6个。
12、复孔， 培养24小时， 弃上清， 加入100 l含0.5mg/ml的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4小时， 加入100 l DMSO(二甲亚砜)， 放 置于微型振荡仪上振荡10min， 再置于酶标仪上570nm处检测OD值。 结果按照以下抑制率公 式计算每种情况下肿瘤细胞生长的抑制率， 具体结果见表1。 0024 抑制率(1-加药组OD值/对照组OD值) 0025 表1为MTX和BER单独和联合给药作用细胞72小时后不同浓度的IC50抑制率。 说 明 书 2/5 页 4 CN 108938640 A 4 0026 当MTX和BER按摩尔比1:1-1:100配伍组合时的抑制情况。 从其中我们。
13、可以获得随 着配伍浓度的增加， 其抑制率呈浓度依赖性。 其中我们发现随着配伍浓度的增加， 其抑制率 呈浓度依赖性。 0027 表1 MTX和BER单药作用72小时IC50( M) 0028 0029 0030 实施例2： MTX和BER联合给药效应分析 0031 以Median-effect Principle(中效原理或Chou-Talalay联合指数法)为评价基 础， 应用CombiDrug统计软件绘制剂量-效应曲线及不同效应下的合用指数曲线(fa-C曲 线)， 从两药合用的效应与合用指数的关系定量评价两药之间是协同、 拮抗或相加关系。 具 体步骤如下： 0032 药物作用效应即抑制率(f。
14、a)1-(试验组平均OD570值/肿瘤细胞空白对照组平均 OD570)根据中效方程式fa/fu(D/Dm)m， 两边取对数logfa/fumlogDmlogDm， 设a- mlogDm， bm， xlogD， ylogfa/fu,代入中效方程式得ybxa； 其中fa为药物作用效应， fu1fa， D为药物浓度， m为斜率， Dm为中效浓度， 即50效应时的药物浓度。 依上述公式， 计算出两种抗癌药单用及合用时各自的中效浓度Dm(logDm-a/m)， 再计算出单用及两药 合用时在各种效应时所需药物浓度 DDm(fa/f u)1/m ， 可计算出两药合用时在各种效应 时的合用指数 CID1/DX。
15、1+D2/DX2+ (D1D2)/(DX1DX2)， D1、 D2为两药合用时产生X效应时 两药各自所需浓度， DX1、 DX2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度 。 0为两种相 互排斥性药物， 1为两种相互非排斥性药物。 因MTX与小檗碱作用机制不同， 故本实验中 取 0。 当CI1， 两药合用效应拮 抗。 0033 经过软件分析， 本发明的复方药物组合物具有良好的协同作用， 具体效应见表2， 根据Median-effect Principle评价效应的原则， 即CI指数1.10及以上时具有拮抗效 应。 0034 表2可见， MTX和BER配伍具有协同效应； 尤其是当两者摩尔比为1-5。
16、:50配伍时具有 良好的协同效应， 当两者摩尔比为1:50时协同效应最强。 0035 表2 MTX和BER不同配伍组合作用72小时的联合指数CI比较 说 明 书 3/5 页 5 CN 108938640 A 5 0036 0037 实施例3： MTX和BER对外周血单核淋巴细胞的安全性 0038 将健康志愿者单核淋巴细胞PBMC进行分离和加药培养后评价MTX和小檗碱对PBMC 细胞的安全性(图1)： 抽取健康志愿者的新鲜血液到肝素抗凝管中(无菌)； 然后用等体积 量PBS(或无血清的D-Hank缓冲液)重悬细胞(无菌)； 将悬浮细胞加入预先铺好的人淋巴 细胞分离液(预热37)， 淋巴分离液与细。
17、胞悬液的体积比不低于1： 1； 500g(或 2000rpm)水平离心机离心20-30min， 室温(20-30)慢速； 丢弃上层血浆， 把中间白色雾 层小心吸出加入到5ml(或1-2倍体积)的PBS(或无血清细胞培养缓冲液)中， 200g或 1000rpm离心10min， 室温(20-30)， 慢速， 弃上清， 所得沉淀即为外周血单核淋巴细胞 (PBMC)； 再按上述操作洗涤2次， 每次500g水平离心10min， 室温(20-30)慢速， 收集细 胞沉淀； 采用活细胞拒染法(如台盼蓝)等检测细胞活力； 按加药设计方案放入细胞培 养箱孵育72小时(MTX 5 M， BER 50 M， MTX。
18、/BER1/5(5 M/50 M)， 加药及对照进行流式检 测细胞凋亡率。 D1-D6为志愿者1-6号的血液样本。 0039 实施例4： 甲氨喋呤(MTX)和小檗碱(BER)复方药物组合物按照以下处方制成片剂： 0040 处方如下： 0041 0042 制备工艺如下： 说 明 书 4/5 页 6 CN 108938640 A 6 0043 将药物和辅料分别过80目筛， 将小檗碱与48克微晶纤维素和12克羧甲基淀粉钠充 分混合， 10淀粉浆制软材， 18目筛制粒， 60下干燥， 得颗粒1。 将甲氨喋呤与24克微晶纤 维素、 15克淀粉和8克羧甲基淀粉钠充分混合， 10淀粉浆制软材， 18目筛制粒， 60下干 燥， 得颗粒2。 按等量递增原则， 将颗粒1和颗粒2充分混合， 16目筛整粒， 加入硬脂酸镁， 混 匀， 压片， 片重500mg。 0044 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108938640 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 108938640 A 8 。