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1、(10)授权公告号 CN 102218047 B (45)授权公告日 2013.04.24 CN 102218047 B *CN102218047B* (21)申请号 201110094394.8 (22)申请日 2011.04.14 A61K 31/05(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (73)专利权人 成都军区昆明总医院 地址 650032 云南省昆明市西山区大观路 212 号 (72)发明人 左国营 韩宗其 王根春 张云玲 尹玉琴 (74)专利代理机构 昆明正原专利商标代理有限 公司 53100 代理人 陈左 WO 9624684 A1,1996.08.15,2。
2、5 页 . WO 9624684 A1,1996.08.15,25 页 . 赵焕新等 . 苏木研究进展 .齐鲁药 事 .2007, 第 26 卷 ( 第 2 期 ),102-105 页 . 赵焕新等 . 苏木研究进展 .齐鲁药 事 .2007, 第 26 卷 ( 第 2 期 ),102-105 页 . (54) 发明名称 治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药 中的应用 (57) 摘要 一种治疗耐药菌感染的药物及其活性成分 在制药中的应用， 含有治疗有效量的如下结构式 (I) 的巴西苏木素或包含巴西苏木素结构的植物 提取物和药学上可接受的载体 ； 其在制备抗耐药 菌(含非耐药菌)药物中的应用，。
3、 以及作为抗生素 中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的应用， 所 述的巴西苏木素经药理试验， 结果证实除了对临 床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 具有显著的直接抑制作用外， 还能增强现有抗生 素的抗耐药菌作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张婷 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102218047 B CN 102218047 B *CN102218047B* 1/1 页 2 1. 巴西苏木素作为活性成分或包含巴西苏木素结构。
4、的植物提取物在制备抗耐甲氧西 林金黄色葡萄球菌药物中的应用， 其中含有治疗有效量的如下结构式 （I） 化合物所示的巴 西苏木素和药学上可接受的载体， 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物 为单独的药物， 或为与庆大霉素或链霉素或依替米星抗生素联合使用的药物， 或为与庆大 霉素或链霉素或依替米星抗生素抗生素混合制备而成的药物。 权 利 要 求 书 CN 102218047 B 1/7 页 3 治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 具体地， 涉及治疗耐药菌感染的药物及其在活性成分在制 药中的应用。
5、。 背景技术 0002 随 着 抗 生 素 的 广 泛 应 用， 越 来 越 多 的 细 菌 对 常 用 抗 生 素 产 生 耐 药 性， 且耐药程度日益加重。自从 1961 年英国首先报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus) 以来， 至今世界各地相继发现， 且 MRSA感染呈上升趋势， 甚至引起医院内爆发流行。 目前MRSA与爱滋病、 肝炎、 癌症并列为当 今世界上的四大顽症。 MRSA对多种抗生素耐药， 致病力强且治疗效果差， 为引起医院感染的 主要病原菌之一。 由于其多重耐药性， 即除了对万古霉素等少数。
6、几种抗生素有效外， 几乎对 现有各类抗生素如 - 内酰胺类、 氟喹诺酮类、 大环内酯类、 氨基糖苷类等抗生素都耐药， 而且感染多发生于免疫缺陷者、 老弱患者及烧伤、 手术患者， 故治疗难度大、 病死率高， 引起 医务工作者的高度重视。建国以来， 我国虽然对中草药抗金葡菌等感染的作用进行过筛选 研究， 但这些研究多限于药材提取物， 对耐药菌的作用也只是在近年来才得到关注， 国内迄 今罕见针对 MRSA 感染的单体化合物的研究报道。 0003 迄今， 现有技术中未见巴西苏木素在治疗耐药菌 MRSA 感染的作用时， 具有对氨基 糖苷类抗生素的增敏作用的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供治。
7、疗耐药菌感染的药物， 其中含有治疗有效量的巴西苏木素 (Brazilin) 或包含巴西苏木素结构的植物提取物和药学上可接受的载体 ； 本发明的另一 方面目的是提供巴西苏木素 (Brazilin) 或包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗耐 药菌 ( 含非耐药菌 ) 药物中的应用时， 作为抗生素中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的 应用。 0005 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的 ： 0006 一种治疗耐药菌感染的药物， 其中含有治疗有效量的如下结构式 (I) 所示的巴西 苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物和药学上可接受的载体， 0007 说 明 书 CN 102218047 。
8、B 2/7 页 4 0008 结构式 (I) 所示的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗耐 药菌药物增敏剂中的应用， 0009 结构式 (I) 所示的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗非 耐药菌药物增敏剂中的应用。 0010 所说耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 0011 所说非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。 0012 本发明还提供了结构式 (I) 的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物 作为抗生素中增敏活性成分的应用。 0013 以及， 结构式 (I) 的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物用于制备抗 生素的增敏剂。 0014 上面提到的抗生素为氨基。
9、糖苷类抗生素， 具体为庆大霉素或链霉素或阿米卡星或 依替米星。 0015 本发明上述技术方案的提出是基于当前临床耐药菌感染的实际， 结合植物药抗菌 药敏筛选和有效成分分离纯化方法， 从豆科云实属植物如苏木 (Caesalpinia sappan L.) 中提取分离巴西苏木素 (Brazilin) 并证实其抗耐药菌活性。本发明对传统中药苏木进行 提取分离纯化得到巴西苏木素， 并首次发现其与氨基糖苷类抗生素联合作用时， 对抗生素 具有增敏作用， 能够增强甚至逆转氨基糖苷类抗生素的抗 MRSA 作用。所述的巴西苏木素经 药理试验， 结果证实除了对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 具。
10、有显著的 直接抑制作用外， 还能增强现有抗生素的抗耐药菌作用。 0016 本发明的化合物巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物可经口或不经 过口给药， 给药量因药物不同而各有不同， 对成人来说， 每天 1-1000mg 比较合适。 0017 经口服给药时， 首先使化合物或提取物与常规的药用辅剂如赋形剂、 崩解剂、 黏合 剂、 润滑剂、 抗氧化剂、 包衣剂、 着色剂、 芳香剂、 表面活性剂等混合， 将其制成颗粒剂、 胶囊、 片剂等形式给药 ； 非经口给药时可以注射液、 输液剂或栓剂等外用形式给药。 制备上述制剂 时， 可使用常规的制剂技术。 附图说明 0018 图 1 为巴西苏木素与庆大霉素。
11、联合抗 MRSA144# 时间 - 杀菌曲线。 说 明 书 CN 102218047 B 3/7 页 5 0019 图 2 为巴西苏木素与阿米卡星联合抗 MRSA144# 时间 - 杀菌曲线。 0020 图 3 为巴西苏木素与链霉素联合抗 MRSA144# 时间 - 杀菌曲线。 0021 图 4 为巴西苏木素与依替米星联合抗 MRSA144# 时间 - 杀菌曲线。 具体实施方式 0022 下面结合附图， 通过本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不 以此来限定本发明。 0023 实施例 1 ： 0024 从苏木干燥心材中提取分离单体巴西苏木素 (Brazilin) ： 0025 。
12、取苏木心材 5kg， 干燥、 粉碎， 得粗粉， 用 80乙醇冷浸提取得浸膏 685g， 依次用石 油醚， 乙酸乙酯， 正丁醇萃取， 乙酸乙酯部位经 200-300 目硅胶柱色谱， 石油醚乙酸乙酯 梯度洗脱 (1.5 1 1 1.5)， 以 TLC 检测合并， 再经过反复硅胶、 Sephadex LH-20 柱色 谱分离得到单体巴西苏木素 858mg。 0026 巴西苏木素 (Brazilin) 的波谱数据 ： 0027 浅黄色针晶 (MeOH)， ESI-MS m/z ： 287M+1+。 1H-NMR(CH 3OH， 400MHz) ： 7.18(1H， d， J 6.7Hz， H-1)， 。
13、6.46(1H， dd， J 4.7， 2.0Hz， H-2)， 6.28(1H， d， J 1.9， H-4)， 3.92(1H， d， J 8.3Hz， H-6)， 3.68(1H， d， J 8.3Hz， H-6 )， 2.76(1H， d， J 12.5Hz， H-7)， 3.0(1H， d， J 12.5Hz， H-7 )， 6.69(1H， s， H-8)， 6.58(1H， s， H-11)， 3.95(1H， s， H-12) ； 13C-NMR(CH 3OH， 100MHz) ： 132.2(C-1)， 115.5(C-1a)， 109.9(C-2)， 155.7(C-3)，。
14、 104.2(C-4)， 157.9(C-4a)， 70.8(C-6)， 78.1(C-6a)， 42.8(C-7)， 131.3(C-7a)， 112.8(C-8)， 145.6(C-9)， 145.3(C-10)， 112.8(C-11)， 137.4(C-11a)， 51.0(C-12)。 0028 实施例 2 ： 0029 按照实施例 1 的操作步骤， 得到含巴西苏木素的浸膏 685g。将浸膏用蒸馏水制成 悬浮液后依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇分配萃取。 得到乙酸乙酯部分为富含巴西苏木素 的植物提取物 400g。 0030 实施例 3 ： 0031 用 作 药 敏 试 验 的 临 。
15、床 耐 药 菌 株 MRSA 即 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 的筛选 ： 0032 1. 试验材料 0033 抗菌素药敏纸片 ( 中国药品生物制品检定所 )， MH 琼脂 ( 杭州天和微生物试剂有 限公司 )。 0034 2. 标本来源 0035 从本申请人临床标本中分离筛选细菌 MRSA 菌株， 编号为 MRSA8#、 82#、 92#、 98#、 111#、 135#、 144#、 189#、 321#、 328#， 冰箱 -20下保存备用。 0036 3. 细菌鉴别 0。
16、037 依据 全国临床检验操作规程 及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标 本细菌进行分离、 培养， 经鉴定为金黄色葡萄球菌 (SA)， 并按公知的抗菌素药敏常规测试方 法(K-B纸片法)， 参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定， 头 孢西丁对所有菌株的抑菌圈均19mm， 故视为耐药SA菌株(MRSA)。 质控菌株为标准SA， 即 说 明 书 CN 102218047 B 4/7 页 6 ATCC25923。 0038 4. 药敏试验 0039 进一步用 K-B 纸片法， 按照我国卫生部于 2000 年 5 月 1 日颁布实施的 纸片法抗 菌药物敏感试验标。
17、准 (SAST) 常规操作， 用 MH 琼脂培养基于 35培养 24 小时， 测定 10 株 MRSA 对常用抗菌素的敏感性， 结果见表 1。 0040 表 1 MRSA 菌株对抗生素的药敏试验结果 0041 0042 实施例 4 ： 0043 巴西苏木素对耐药菌株 MRSA 的抗生素增敏作用测定 ： 0044 1. 试验材料 0045 培养基 ： MH 肉汤 ( 杭州天和微生物试剂有限公司 ) ； 受试药 ： 巴西苏木素 ( 由苏木 心材中提取分离得到 )， 硫酸庆大霉素注射液 (2mL ： 8 万单位， 广州白云山天心制药股份有 限公司， 批号 100305) ； 注射用硫酸阿米卡星 (2。
18、0 万单位， 江苏吴中医药集团有限公司苏州 第六制药厂， 批号 400509)， 溶剂 ： DMSO( 分析纯 )， 蒸馏水 ； MRSA8#、 82#、 92#、 98#、 111#、 135#、 144#、 189#、 321#、 328#。 0046 2. 药液制备 0047 无菌 DMSO 将巴西苏木素、 庆大霉素及阿米卡星配成配成 4096g/mL 溶液作为原 说 明 书 CN 102218047 B 5/7 页 7 药溶液。 0048 3. 菌液的制备 0049 用接种环把菌株接种在 MH 琼脂平板上， 置于 35恒温箱中培养 24h， 再用接种环 把菌株转移至试管中， 用无菌生理。
19、盐水配成浓度为 1.0106CFU/mL 控制菌悬液。 0050 4. 测定药物抑制 MRSA 的最小抑菌浓度 (MIC) 0051 采用公知的二倍稀释法， 取无菌 96 孔板， 于每横排 1 号孔加 200L MH 肉汤培养 基作空白对照， 12 号孔加 MH 肉汤培养基和菌液各 100L 作阳性对照。每横排 2-11 号孔先 各加入 50L MH 肉汤培养基， 取原药液 50L 与 2 号孔混匀， 继而吸取 50L 加入 3 号孔 中， 依次类推稀释至第 11 号孔， 弃去 50L， 2-11 号孔各都加 100L 稀释为 1.0106CFU/ mL菌液摇匀， 置培养箱中于35培养24小时。
20、， 按本领域技术人员公知方法进行受试药物活 性评价。 0052 5. 巴西苏木素 (Brazilin) 与抗生素联合抑菌实验 ： 0053 5.1 棋盘式微量稀释法 (checkerboard microdilution assay) 0054 棋盘法能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。 合用的 两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2-11)两方向分别进行二倍的倍比稀释， 测定联合用药的 MIC。FICI 是评价药物体外联合用药的两药相互作用方式的主要参数。部 分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration， FIC)为。
21、每一种药物联合抑菌时 所需最低抑菌浓度 (MICc) 与单独时 MICa的比值， 而 FICI 则等于两种药物 FIC 之和。计算 的公式为 ： FICI FIC1+FIC2 MIC1a/MIC1c+MIC2a/MIC2c。当 FICI 0.5 时， 为协同作用 ； 当 1 FICI 0.5 时， 为相加作用 ； 当 2 FICI 1 时， 药物体外的相互作用方式为无关 ； 当 FIC 指数 2 时， 为拮抗作用。结果见表 2 3。 0055 表 2 Brazilin 与注射用硫酸庆大霉素棋盘法联合抗 MRSA 的抑菌效果 0056 0057 表 3 Brazilin 与注射用硫酸阿米卡星棋盘。
22、法联合抗 MRSA 的抑菌效果 0058 说 明 书 CN 102218047 B 6/7 页 8 0059 表 4 Brazilin 与注射用硫酸链霉素棋盘法联合抗 MRSA 的抑菌效果 0060 0061 表 5 Brazilin 与硫酸依替米星注射用棋盘法联合抗 MRSA 的抑菌效果 0062 0063 5.2 时间杀菌曲线测定 (Time-kill curve) ： 说 明 书 CN 102218047 B 7/7 页 9 0064 在含有定量抗菌药物的试管和无药试管内接种同种定量菌悬液， 放入 35恒温箱 中培养， 分别于 0、 4.、 8、 12、 24h 进行菌落计数， 以菌落对。
23、数值 log10CFU/mL 对时间作曲线。 各管药液终浓度分别为1/4MIC、 1/2MIC和MIC。 时间杀菌曲线结果判定 ： 联合用药组菌落计 数较最有效的单药组减少 2log10cfu/ml 时为协同， 2log10cfu/ml 减少 1log10cfu/ ml时为相加作用， 减少或增加1log10cfu/ml时为无关作用， 联合后增加1log10cfu/ml 时定义为拮抗作用 (Chin， J.N.et al.J.Antimicrob.Chemoth.2008， 61， 365-370)。巴西苏 木素与硫酸庆大霉素联合选用 MRSA8#菌株， 与硫酸阿米卡星联合选用 MRSA144#。
24、菌株。结果 见图 1、 图 2， 在 MIC 浓度 24h 联用时， 巴西苏木素与庆大霉素联合活菌菌落计数下降最大为 2.15log10CFU/mL， 巴西苏木素与阿米卡星联合活菌菌落计数下降最大为 2.62log10CFU/ mL， 均表现出较好协同作用。 0065 实施例 5 ： 0066 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 按常规加注射用水， 精滤， 灌封灭菌制成注射液。 0067 实施例 6 ： 0068 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物，。
25、 将其溶于无菌注射用水中， 搅拌使溶， 用无菌抽滤漏斗过滤， 再无菌精滤， 分 装于 2 安瓿中， 低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。 0069 实施例 7 ： 0070 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 与赋形剂重量比为 9 1 的比例加入赋形剂， 制成粉剂。 0071 实施例 8 ： 0072 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 按其与赋形剂重量比为 1 5-1 10 的比例加入赋形剂， 制粒压片。 0073 实施例 9 ： 0074 按实施例。
26、 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 按常规口服液制法制成口服液。 0075 实施例 10 ： 0076 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 按其与赋形剂重量比为 5 1 的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂。 0077 实施例 11 ： 0078 按实施例 1 和 2 的方法先制得巴西苏木素 (Brazilin)， 以及包含巴西苏木素结构 的植物提取物， 按其与赋形剂重量比为 3 1 的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂。 说 明 书 CN 102218047 B 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102218047 B 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102218047 B 。