本申请要求2011年11月7日提交的美国临时申请第61/556,456号；以及 2011年12月2日提交的美国临时申请第61/566,407号的权益。上述申请的全 部内容都参考结合入本文中。
技术领域
本发明涉及抗原和运载体分子的偶联物，以及包括这些偶联物的疫苗。所 述抗原通常是糖类。
发明背景
采用偶联运载体蛋白以增强糖抗原的免疫原性是众所周知的[例如在参考 文献1-9等中综述]，并且特别用于儿科疫苗[10]。在目前的疫苗中3种广泛使 用的运载体蛋白是破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)和白喉类毒素变 体CRM197。这些蛋白已被用作各种糖类的运载体，尤其对于脑膜炎球菌荚膜 糖(参见，例如，在参考文献11中TT用作衍生自脑膜炎奈瑟球菌 (N.meningitidis)血清组A、C、W135和Y的糖类的运载体；分别在参考 文献12和13中的DT和CRM197用作相同糖类的运载体)。这些运载体蛋 白在疫苗中的过度使用已经出现了问题[参见，例如，参考文献14]，提出了各 种替代性的运载体(例如，参考文献15中来自流感嗜血菌(H.influenzae)的 蛋白D)。然而，许多替代性的运载体蛋白不如TT、DT和/或CRM197有效。 因此，仍然存在寻找替代性的和/或更好的运载体蛋白的需求。
因此，本发明的目标是提供其他的和更好的运载体蛋白，尤其是用于脑膜 炎球菌荚膜糖的运载体蛋白。该运载体蛋白可用于偶联物以诱导针对感染或 药物的保护性和/或治疗性免疫应答。
发明内容
发明人已经发现包括两种特定的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) 抗原，spr0096抗原和spr2021抗原的蛋白是有效的运载体。这些运载体是各 种各样的并且可以与各种抗原偶联，尤其是例如来自病原生物体的糖类。所得 的偶联物可能相较于目前使用的运载体蛋白，例如CRM197更有免疫原性。另 外，它们提供了针对糖类所衍生的病原体的较高水平的保护性免疫。
本发明因此提供了包括抗原和运载体分子的偶联物，其中该运载体分子包 括spr0096抗原和spr2021抗原。运载体分子通常以单多肽链形式包括spr0096 抗原和spr2021抗原(“杂交”多肽)。通常，抗原是糖。糖可以是任意的糖， 尤其是来自病原生物体的糖。例如，糖可以是来自脑膜炎奈瑟球菌 (N.meningitidis)的荚膜糖，来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的葡聚糖或 荚膜糖。当糖是来自脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖时，其通常来自以下的脑膜炎 球菌血清组：A、C、W135和Y。当糖是葡聚糖时，其通常是昆布多糖。当 糖是来自肺炎链球菌的荚膜糖时，其通常选自下列肺炎球菌血清组：1、2、3、 4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、 19F、20、22F、23F和33F中的一种。然而，在一些实施方式中，糖不是来自 肺炎链球菌的荚膜糖。
本发明也涉及包括与药学上可接受的运载体组合的本发明的偶联物的药 物组合物。
本发明还涉及在哺乳动物中引起抗体应答的方法，包括将本发明的偶联物 或药物组合物给予所述哺乳动物。
本发明还涉及已经修饰为包含非天然氨基酸的运载体分子。
附图简述
图1提供了本发明使用的代表性细菌糖的重复单元。
图2比较了与各种肺炎球菌蛋白和参比运载体CRM197偶联的昆布多 糖的免疫原性。
图3比较了本发明的昆布多糖偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图4比较了本发明的各种肺炎球菌和脑膜炎球菌糖偶联物与参比 CRM197偶联物的免疫原性。
图5比较了本发明的肺炎球菌偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图6比较了本发明的肺炎球菌偶联物与参比CRM197偶联物在针对肺炎 球菌血清型5感染的保护性免疫的模型中的效果。
图7比较了本发明的肺炎球菌偶联物、参比CRM197偶联物、以及单独 或一起的肺炎球菌糖和运载体在针对肺炎球菌血清型5感染的保护性免疫的模 型中的效果。
图8-10比较了单独和与其他脑膜炎球菌偶联物组合的本发明的脑膜炎球 菌血清组A偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。在图9和10中，在各 柱上提供SBA效价。
图11比较了单独和与其他脑膜炎球菌偶联物组合的本发明的脑膜炎球菌 血清组C偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图12比较了单独和与其他脑膜炎球菌偶联物组合的本发明的脑膜炎球菌 血清组W135偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图13比较了单独和与其他脑膜炎球菌偶联物组合的本发明的脑膜炎球菌 血清组Y偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图14比较了本发明的脑膜炎球菌血清组C偶联物与参比CRM197偶联物 以及spr1416偶联物的免疫原性。
图15比较了针对本发明的脑膜炎球菌血清组C偶联物与参比CRM197偶 联物以及spr1416偶联物的T-细胞应答。
图16显示了本发明的运载体的质谱痕迹，其在宿主细胞中表达使得L-高 烯丙基甘氨酸残基已经在通常包括甲硫氨酸的位置上被引入到蛋白中(SEQ ID NO：20对比SEQ ID NO：9)。
图17比较了单独和与其他脑膜炎球菌偶联物组合的本发明的脑膜炎球菌 血清组A偶联物与参比CRM197偶联物的免疫原性。
图18比较了在图17的研究中其他脑膜炎球菌偶联物的免疫原性。
发明详述
本发明涉及包括抗原和运载体分子的偶联物，其中该运载体分子包括 spr0096抗原和spr2021抗原。该偶联物的特征在下文中详述。
本发明也涉及已经修饰包含非天然氨基酸的运载体分子。示例性的修饰和 运载体蛋白也在下文中详述。
运载体分子
运载体分子包括spr0096抗原和spr2021抗原。运载体分子通常包括作为 单多肽链的spr0096抗原和spr2021抗原(“杂交”多肽)。
spr0096抗原
参考文献16中将原始“spr0096”序列标注为“假拟蛋白”(参见 GI：15902140)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0096的氨基酸序列 在本文中列为SEQ ID NO：1。
本发明的spr0096抗原包括至少一种CD4+T细胞表位。CD4+T细胞辅助 B淋巴细胞产生针对抗原的抗体[17]。可凭经验确定T细胞表位(如利用 PEPSCAN[18，19]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗 原性指数[20]、基于矩阵的方法[21]、T表位(TEPITOPE)[22]、神经网络[23]、 OptiMer和EpiMer[24，25]、ADEPT[26]、T位点(Tsites)[27]、亲水性[28]、 抗原性指数[29]或参考文献30中公开的方法等)。
本发明优选使用的spr0096抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：1有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和 /或(b)包括SEQ ID NO：1的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是 7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更多)。这些spr0096多肽包含SEQ ID NO：1 的变体(如SEQ ID NO：2；见下)。(b)的优选片段包括来自SEQ ID NO：1 的至少一种CD4+T细胞表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：1的C-端的 一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或 更多)和/或N-端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多)，仍然保留SEQ ID NO：1的至少一个CD4+T细胞表 位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：14， 其缺少天然前导肽序列。spr0096抗原可以由来自SEQ ID NO：1的单个CD4+T 细胞表位组成。
相对于SEQ ID NO：1在C-端附近有插入物的spr0096的变体形式是本文 所述的SEQ ID NO：2。参考文献31中报道将此种变体(其中的SEQ ID NO： 150)用于免疫，在其中标注为LysM结构域蛋白。因此，本发明优选使用的 spr0096抗原可以包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：2有50％或更 高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括 SEQ ID NO：2的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例 如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、150、200、250或更多)。这些多肽包含SEQ ID NO：2的变体。(b)的 优选片段包括来自SEQ ID NO：2的至少一种CD4+T细胞表位。其他优选片段 缺少来自SEQ ID NO：2的C-端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N-端的一个或多个氨基酸(例如， 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)，同时保留SEQ ID NO：2 的至少一个CD4+T细胞表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。一个合 适的片段是SEQ ID NO：15，其缺少天然前导肽序列。参考文献31的表1中鉴 定了SEQ ID NO：2的免疫原性片段。spr0096抗原可以由来自SEQ ID NO：2 的单个CD4+T细胞表位组成。
spr0096抗原可以二聚体，例如同源二聚体的形式使用。
spr2021抗原
参考文献16中将原始“spr2021”多肽序列标注为“全身应激蛋白GSP-781” (参见GI：15904062)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr2021的氨基 酸序列在本文中列为SEQ ID NO：3。本发明的spr2021抗原包括至少一种CD4+T细胞表位。本发明优选使用的spr2021抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与 SEQ ID NO：3有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％ 或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：3的至少“n”个连续氨基酸的片段， 其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些spr2021多肽包含 SEQ ID NO：3的变体。(b)的优选片段包括来自SEQ ID NO：3的至少一个CD4+ T细胞表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：3的C-端的一个或多个氨基 酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N- 端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25或更多)，同时保留SEQ ID NO：3的至少一个CD4+T细胞表位。其它片段 省去一个或多个蛋白结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：4，其缺少天然前 导肽序列。spr0096抗原可以由来自SEQ ID NO：3的单个CD4+T细胞表位组 成。
参考文献31将spr2021标注为与GbpB具有同源性的分泌型45kDa蛋白 并且公开了它作为免疫原的应用(其中的SEQ ID NO：243；SP2216)。参考文 献31的表1中鉴定了spr2021的免疫原性片段(第73页)。参考文献32的 SEQ ID NO：1是spr2021的另一有用片段(本文SEQ ID NO：3的氨基酸 28-278)。
杂交多肽
spr0096抗原和spr2021抗原通常以单个多肽链表达(“杂交”多肽)。 杂交多肽可以由通式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH表示，其中：A是任选的N-端 氨基酸序列；B是任选的C-端氨基酸序列；n是2或更大的整数(例如，2、3、 4、5、6等)；各X是spr0096抗原或spr2021抗原的氨基酸序列(如上述)， 其中至少一个X是spr0096抗原并且至少一个X是spr2021抗原；并且L是任 选的接头氨基酸序列。n通常为2。当n为2时，X1通常是spr0096抗原而X2通常是spr2021抗原。当n超过2时，各spr0096抗原(当存在超过一个时) 可以是相同的或不同的并且各spr2021抗原(当存在超过一个时)可以是相同 的或不同的。
各X的氨基酸序列的spr0096抗原或spr2021抗原如上定义。当这些抗原 定义为(a)与给定的序列有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、 99.5％或更高)；和/或(b)包括给定的序列的至少“n”个连续氨基酸的片段， 其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)时，对于各X而言，(a) 中的相同性水平和(b)中“n”的值可以是相同的。
在杂交蛋白中可以包含或缺少各-X-部分的野生型中的前导肽序列。在一 些实施方式中，前导肽可缺失，除了位于杂交蛋白N-端的-X-部分的前导肽， 即保留X1的前导肽，但略去X2...Xn的前导肽。这相当于删除所有前导肽并 使用X1的前导肽作为-A-部分。
就{-X-L-}的各n示例而言，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如， 当n＝2时，杂交体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、 NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短 (如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘 氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，和 组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技 术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：5)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：6)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形 成，因而有助于克隆和操作，并且(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其他 合适接头，尤其用作最后一个Ln的接头是Leu-Glu二肽或SEQ ID NO：7。
-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸， 即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、 5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯 化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或 更多)。其它合适的N-端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X1缺 少其自身的N-端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有 1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
-B-是任选的C-端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸，即 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、 3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序 列(例如，包含组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更 多，如SEQ ID NO：8)，或能提高蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员显然 了解其它合适的C-端氨基酸序列。
杂交体的示例包含包括spr0096-spr2021(例如SEQ ID NO：9)或 spr2021-spr0096(例如，SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的多肽。杂交体也可以 包括与SEQ ID NO：9或10有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、99.5％或更高)的氨基酸序列。杂交体通常包括SEQ ID NO：9的氨基酸 序列。杂交体也可以包括与SEQ ID NO：9有50％或更高相同性(例如，60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列。
在特定的实施方式中，运载体分子包括(a)一个或多个(例如，1、2、3、 4、5个等)来自SEQ ID NO：2的CD4+T细胞表位；以及(b)一个或多个(例 如，1、2、3、4、5个等)来自SEQ ID NO：3的CD4+T细胞表位。
运载体分子被修饰包含非天然氨基酸。
本发明也涉及已经修饰包含非天然氨基酸的运载体分子。可以使用非天然 氨基酸来将运载体分子偶联至另一个分子。
在一些替代物中，运载体分子包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10个等)非天然氨基酸。非天然氨基酸可能具有与由经典氨基酸组 成的蛋白中可以反应的官能团(例如，赖氨酸的氨基或半胱氨酸的巯基)不同 反应形式的官能团。这进而表示化学选择性反应使得能在非天然氨基酸已掺入 蛋白质的预定的位点实施位点-选择性偶联。
在特定的实施方式中，运载体分子包括一个或多个L-高烯丙基甘氨酸 (L-homoallylglycine)(HAG)残基。HAG残基通常取代序列中甲硫氨酸残 基的位置。HAG，化学上称为L-2-氨基-5-己烯酸，是甲硫氨酸的类似物，并 且含有反应性烯烃位点。HAG可以在蛋白合成的起始和延伸步骤中取代甲硫 氨酸。HAG具有拥有与经典氨基酸中发现的官能团不同的反应形式的烯烃 侧链，通过硫-烯(thiyl-ene)机制反应。
在其他实施方式中，运载体分子可以经修饰包含其他非天然氨基酸，其允 许在预定的位点上实施位点特异性偶联。例如，运载体分子可以经修饰，使得 在其序列中包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个等)对乙酰基苯基丙氨 酸残基。该氨基酸具有酮官能团，其不存在于任何经典氨基酸中，而因此该氨 基酸可以在温和的水性条件下与肼、烷氧基胺和氨基脲特异性反应产生腙、 肟和缩氨基脲连接。其他具有酮官能团的氨基酸包含间乙酰基苯基丙氨酸和对 苯甲酰基苯基丙氨酸并且这些残基可以相同的方式使用。
在其他实施方式中，运载体分子可以经修饰包含叠氮基团(其也不在经 典氨基酸中出现)，例如通过包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5个等) 对叠氮基苯基丙氨酸残基。叠氮基可以与偶联伙伴上的乙炔基团通过铜(I) 催化的[2+3]环加成反应进行反应。相反，可能通过包含一个或多个(例如，1、 2、3、4、5个等)对炔丙氧基苯基丙氨酸残基将非天然存在的炔基工程改造 进运载体蛋白中，其然后可以通过相同的机制与偶联伙伴上的叠氮基反应。
在其他实施方式中，运载体分子可以经修饰包含一个或多个(例如，1、2、 3、4、5个等)苯基硒基半胱氨酸残基。用过氧化氢处理该残基使其与巯基偶 联。
在本发明的示例性的经修饰的运载体分子中，spr0096抗原可以包括以下 的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：1有50％或更高相同性(例如，60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：1的至少“n”个 连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)， 其中多肽中的一个或多个甲硫氨酸残基被HAG取代。例如，运载体分子可以 具有SEQ ID NO：16所示的序列。
相对于SEQ ID NO：1在C-端附近有插入物的spr0096的变体形式是本文 所述的SEQ ID NO：2。因此，本发明使用的spr0096抗原可以包括以下的氨基 酸序列：(a)与SEQ ID NO：2有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：2的至少“n”个连续氨 基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、 30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)，其中多肽 中的一个或多个甲硫氨酸残基被HAG取代。例如，运载体分子可以具有SEQ ID NO：17所示的序列。在本发明的经修饰的运载体分子的其他或相同示例中， spr2021抗原可以包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：3有50％或更 高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括 SEQ ID NO：3的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例 如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、 100、150、200、250或更多)，其中多肽中的一个或多个甲硫氨酸残基被HAG 取代。在一些实施方式中，多肽中的两个或更多个、三个或更多个、或四个或 更多个甲硫氨酸残基被HAG取代。例如，运载体分子可以具有SEQ ID NO：18 所示的序列。
spr2021的一个变体形式是SEQ ID NO：4，其缺少天然前导肽序列。因此， 本发明使用的spr2021抗原可以包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO： 4有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和 /或(b)包括SEQ ID NO：4的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是 7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更多)，其中多肽中的一个或多个甲硫氨酸残 基被HAG取代。例如，运载体分子可以具有SEQ ID NO：19所示的序列。
经修饰的运载体分子的其他示例包含上述的杂交多肽，其中多肽中的一个 或多个甲硫氨酸残基被HAG取代。例如，杂交多肽可以包含包括 spr0096-spr2021(例如SEQ ID NO：9)或spr2021-spr0096(例如，SEQ ID NO： 10)的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9或10有50％或更高相同性(例如，60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列，其中多肽中的一个或多个甲 硫氨酸被HAG取代。在一些实施方式中，多肽中的两个或更多个、或三个或 更多个甲硫氨酸残基被HAG取代。例如，运载体分子可以具有SEQ ID NO：20 或21所示的序列。在特定的实施方式中，运载体分子包括(a)一个或多个(例 如，1、2、3、4、5个等)来自SEQ ID NO：2的CD4+T细胞表位；和/或(b) 一个或多个(例如，1、2、3、4、5个等)来自SEQ ID NO：3的CD4+T细胞 表位。
这些技术也可以应用于其他已知的非天然氨基酸，和其他运载体分子中。 因此在上述实施方式中，运载体分子可以是这些其他运载体分子中的任意一 种。优选的运载体分子包含细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、或其类毒素或突 变体。这些常用于偶联疫苗。特别优选CRM197白喉毒素突变体[33]。也可以使 用破伤风类毒素的C片段[34]。其他运载体包含抗原，诸如上述的spr0096或 spr2021。其他合适的运载体分子包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜 蛋白复合物[35]、合成肽[36，37]、热激蛋白[38，39]、百日咳蛋白[40，41]、细胞 因子[42]、淋巴因子[150]、激素[150]、生长因子[150]、包含多种来自各种病原 体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[43]例如N19[44]、来自流感嗜血 杆菌(H.influenzae)的蛋白D[45-47]、肺炎球菌溶血素[48]或其无毒衍生物[49]、 肺炎球菌表面蛋白PspA[50]、摄铁蛋白[51]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒 素A或B[52]、重组绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[53] 等。
抗原
抗原通常是糖。当抗原是糖时，糖可以是任何糖，特别是来自病原生物体 的糖。本发明使用的示例性糖类如下述。具体地，糖可以是细菌糖，例如，细 菌荚膜糖。代表性的细菌糖见述于图1。
可以寡糖形式使用的糖类。通过对经纯化的多糖进行片段化(例如通过水 解)可以方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。可以从天然 来源纯化糖类。作为纯化的替代，可以通过完全或部分合成来得到糖类。
当抗原不是糖时，其可以是任意其他的抗原，例如，任意免疫原或半抗原。 本发明的偶联物可以引发针对与运载体分子偶联的半抗原的免疫应答。半抗原 可以是例如滥用的药物[54]。例子包括但不限于鸦片、大麻、安非他命、可卡 因、巴比妥、苯乙哌啶酮、甲乙啶酮、水化氯醛、甲喹酮、苯二氮类、LSD、 尼古丁、抗胆碱能药、色胺、其它拟精神病药物、镇静剂、苯环己哌啶、西洛 西宾、挥发性亚硝酸盐和其它引起生理和/或心理依赖性的药物。
脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖
糖可以是细菌荚膜糖。示例性的细菌荚膜糖包含来自脑膜炎奈瑟球菌的 那些。基于生物体的荚膜多糖，已经鉴定了脑膜炎奈瑟球菌的各种血清组， 包含A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z。本发明中的糖可以 来自这些血清组中的任意。糖通常来自以下脑膜炎球菌血清组中的一种：A、 C、W135和Y。
通常以寡糖形式使用荚膜糖。通过对纯化荚膜多糖进行片段化(例如通过 水解)可以方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。
通常进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30(例 如，血清组A为10到20，优选约10；血清组W135和Y为15到25，优选约 15-20；血清组C为12到22等)。可通过离子交换层析或比色测定方便地测 定DP[55]。
如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[56]。可用各 种方法如超滤后进行离子交换层析达到此目的。对血清组A来说，优选去除聚 合程度小于或等于约6的寡糖；对血清组W135和Y来说，优选去除聚合程度 小于4左右的寡糖。
糖类的化学水解通常包括在本领域中标准条件下用酸或碱处理。荚膜糖解 聚为它们的单糖组分的条件为本领域已知。一种解聚方法涉及使用过氧化氢 [57]。将过氧化氢加入糖中(例如，H2O2终浓度为1％)，然后孵育混合物(例 如在约55℃下)直到实现所需的链长降低。随着时间降低之后，可以从混合物 中移出样品并然后测量样品中糖的(平均)分子大小。然后一旦达到需要的链 长，可以通过快速冷却停止解聚。
血清组C、W135和Y
用于从脑膜炎球菌制备荚膜多糖的技术多年来已知，并且通常包括包 含多糖沉淀(例如，使用阳离子去污剂)、乙醇分馏、冷苯酚萃取(以去 除蛋白)和超速离心(以去除LPS)的步骤的工艺[例如，参见参考文献58]。
更优选的工艺[59]包括在多糖沉淀之后使用低级醇溶解沉淀的多糖。可以 使用诸如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(例如，氢溴酸盐)，或海美溴铵 (hexadimethrine bromide)和肉豆蔻基三甲基铵盐的阳离子去污剂实现沉淀。 特别优选十六烷基三甲基溴化铵(“CTAB”)[60]。使用诸如甲醇、丙-1-醇、 丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等的低级 醇来实现沉淀物质的溶解，但是乙醇特别适于溶解CTAB多糖复合物。可以向 沉淀的多糖加入乙醇以得到50％-95％的乙醇终浓度(基于乙醇和水的总含量)。
再溶解后，可进一步处理多糖以除去污染物。这在甚至非常微量的污染也 不能接受(例如对于人疫苗生产)的情况下特别重要。这通常会包括一个或两 个过滤步骤，例如深度过滤(可以使用过滤通过活性炭)、尺寸过滤和/或超滤。
一旦经过滤去除污染物，可以沉淀多糖用于进一步处理和/或加工。这通 常可以通过交换阳离子来方便地实现(例如，通过加入钙盐或钠盐)。
在纯化后，荚膜糖如下述与运载体蛋白偶联。
用于脑膜炎球菌糖的纯化和偶联的其他和替代性方法公开于参考文献 57和61。
作为纯化的替代，可以通过完全或部分合成得到本发明的荚膜糖，例如 Hib合成公开于参考文献62，而MenA合成公开于参考文献63。
糖可以经化学修饰，例如，其可以是O-乙酰化的或去-O-乙酰化的。任 意这样的去-O-乙酰化或高度-乙酰化可以在糖中的特定位置。例如，大多数血 清组C株在唾液酸残基的C-7和/或C-8位置上具有O-乙酰基团，但约15％的 临床分离柱缺乏这些O-乙酰基[64，65]。乙酰化似乎并不影响保护功效(例如， 与MeniugateTM产品不同，NeisVac-CTM产品使用去-O-乙酰化的糖，但是两种 疫苗都是有效的)。血清组W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。血清 组Y糖类似于血清组W135糖，除了二糖重复单元包括葡萄糖而非半乳糖。类 似于血清组C糖，MenW135和MenY糖具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7 和9位[66]。任何这样的化学修饰优选在偶联之前发生，但是可以可选地或另 外地在偶联期间发生。
优选单独纯化来自不同血清组的糖，并且然后可以在偶联之前或之后合 并。
血清组A
本发明的偶联物可以包含血清组A荚膜糖抗原。可以与血清组C、W135 和Y(参见上述)相同的方式纯化或偶联糖，虽然其在结构上不同(其中血清 组C、W135和Y的荚膜基于唾液酸(N-乙酰基-神经氨酸，NeuAc)周围，而 血清组A的荚膜基于N-乙酰基-甘露糖胺，其是唾液酸的天然前体)。血清组A 糖特别易于水解，并且在水性基质中的不稳定性表明(a)针对血清组A的液 体疫苗的免疫原性随着时间下降，以及(b)由于向疫苗中释放糖水解产物， 质量控制变得更难。
天然MenA荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯的均 聚物，具有C3和C4位的部分O-乙酰基化。主要糖苷键是包括D-甘露糖胺 的C1的半缩醛基和C6的醇基的1-6磷酸二酯键。平均链长为93个单体。 它具有下式：
已经制备了经修饰的糖抗原，其保留了天然血清组A糖的免疫活性但是 其在水中稳定得多。由保护基团取代在单糖单元的C3和C4上相连的羟基[参 考文献67和68]。
在羟基处具有保护基团的单糖单元的数量可以变化。例如，全部或基本全 部的单糖单元可能具有保护基团。或者，至少10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％或90％的单糖单元可能具有保护基团。至少1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29或30个单糖单元可能具有保护基团。
相似地，单糖单元上的保护基团的数量可以变化。例如，在任意特定的单 糖单元上的保护基团的数量可以是1或2。
末端单糖基团可能有或可能没有取代其天然羟基的保护基团。优选保留末 端单糖单元上的游离异头羟基以提供进一步反应的操作(例如，偶联)。异 头羟基可以通过还原性胺化(使用，例如NaBH3CN/NH4Cl)被转化为氨基 (-NH2或-NH-E，其中E是氮保护基团)，并且然后在其他羟基已被转化为 保护基团之后再生。
取代羟基的保护基团可以通过羟基的衍生反应直接得到，例如通过用另一 种基团取代羟基的氢原子。作用为保护基团的合适的羟基衍生物是，例如，氨 基甲酸酯、磺酸酯、碳酸酯、酯、醚(例如，甲硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。 这样的保护基团的一些具体示例是烯丙基、Aloc、苄基、BOM、叔丁基、三 苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、 THP等。非直接可得并完全取代羟基的其他保护基团包括C1-12烷基、C3-12烷 基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、NR1R2(R1和R2在下图中定义)、H、F、 Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3、CCl3等。
典型的保护基团具有式：-O-X-Y或-OR3，其中X是C(O)、S(O)或SO2； Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基， 其各自任选地由独立选自以下的1、2或3个基团所取代：F、Cl、Br、CO2H、 CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3；或者Y是NR1R2；R1和R2独立选自H、C1-12烷基、C3-12环烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或者R1和R2可以结合形 成C3-12饱和杂环基；R3是C1-12烷基或C3-12环烷基，其各自可以任选地由独立 选自以下的1、2或3个基团所取代：F、Cl、Br、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3；或者R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，其各自可以任选地由选自 以下的1、2、3、4或5个基团所取代：F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、 CN、CF3或CCl3。当R3是C1-12烷基或C3-12环烷基时，其通常由上述定义的1、 2或3个基团所取代。当R1和R2连接形成C3-12饱和的杂环基时，表示R1和 R2与氮原子一起形成含有3到12之间的任意数量(例如，C3、C4、C5、C6、 C7、C8、C9、C10、C11、C12)的碳原子的饱和的杂环基。除了氮原子以外，杂 环基可能含有1或2个杂原子(诸如N、O或S)。C3-12饱和杂环基的示例是 吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁烷基(azetidinyl) 和氮杂环丙烯基。
可以通过标准衍生过程从-OH基团制备保护基团-O-X-Y和-OR3，诸如羟 基与酰卤、烷基卤、磺酰卤等的反应。因此，-O-X-Y中的氧原子通常是羟基 的氧原子，而-O-X-Y中的-X-Y基团通常取代羟基中的氢原子。
或者，保护基团可以通过取代反应得到，诸如Mitsonobu-型取代。从羟 基制备保护基团的这些方法和其他方法是为人熟知的。
本发明使用的具体保护基团是-OC(O)CF3[69]和氨基甲酸酯基团 OC(O)NR1R2，其中R1和R2独立选自C1-6烷基。R1和R2通常都是甲基，例 如保护基团是-OC(O)NMe2。氨基甲酸酯保护基团对糖苷键具有稳定化效果 并且可以在温和条件下制备。
特别优选的保护基团是-OC(O)CH3[68]。在经修饰的脑膜炎奈瑟球菌血 清组A糖中具有该保护基团的4-和/或3-位的比例可以变化。例如，具有保护 基团的4-位的比例可以是约0％，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、95％或约100％，优选至少80％和约100％。相似地，具有 保护基团的3-位的比例可以是约0％，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、95％或约100％，优选至少80％和约100％。具有保护基团 的4-和3-位的比例通常在个位置上大约相同。换而言之，具有保护基团的4- 位与具有保护基团的3-位之比为约1∶1。然而，在一些实施方式中，具有保护 基团的4-位的比例可以相对于具有保护基团的3-位的比例变化。例如，具有保 护基团的4-位与具有保护基团的3-位之比可以是1∶20、1∶19、1∶18、1∶17、1∶16、 1∶15、1∶14、1∶13、1∶12、1∶11、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3或1∶2。 相似地，具有保护基团的3-位与具有保护基团的4-位之比可以是1∶20、1∶19、 1∶18、1∶17、1∶16、1∶15、1∶14、1∶13、1∶12、1∶11、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、 1∶5、1∶4、1∶3或1∶2。
典型的经修饰的MenA糖含有n个单糖单元，其中至少h％的单糖单元在 3位和4位上都没有-OH基团。h的值为24或更高(例如，25、26、27、28、 29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99 或100)并且通常是50或更高。缺失的-OH基团是上述定义的保护基团。
其他典型的经修饰的MenA糖包括单糖单元，其中单糖单元中的至少s 个在3位上没有-OH并且在4位上也没有-OH。s的值至少为7(例如，2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺 失的-OH基团是上述定义的保护基团。
本发明使用的合适的经修饰的MenA糖具有下式：
其中
n是1-100的整数(尤其是5-25的整数，通常15-25)；
T是式(A)或(B)：
各Z基团独立选自OH或上述定义的保护基团；并且
各Q基团独立选自OH或上述定义的保护基团；
Y选自OH或上述定义的保护基团；
E是H或氮保护基团；
并且其中超过约7％(例如，8％、9％、10％或更高)的Q基团是保护基 团。在一些实施方式中，在式(A)中的C1上连接的羟基被上述定义的保护 基团取代。在一些实施方式中，式(B)中的E是本发明的接头或运载体分子。 当E是接头时，该接头可以与本发明的运载体分子共价结合。
各n+2Z基团可以是相同的或互相不同的。相似地，各n+2Q基团可以是 相同的或互相不同的。所有的Z基团可以是OH。或者，至少10％、20、30％、 40％、50％或60％的Z基团可以是OAc。通常，约70％的Z基团是OAc，剩 余的Z基团是OH或上述定义的保护基团。至少约7％的Q基团是保护基团。 通常，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％ 的Q基团是保护基团。
葡聚糖
所述糖可以是葡聚糖。葡聚糖是在不限于真菌细胞壁中发现的含有葡萄糖 的多糖。α-葡聚糖包含葡萄糖亚基之间的一个或多个α-连接，而β-葡聚糖包含 葡萄糖亚基之间的一个或多个β-连接。按照本发明使用的葡聚糖包含β连接， 并且可以仅含有β连接(例如，无α连接)。
葡聚糖可以包括一个或多个β-1，3-连接和/或一个或多个β-1，6-连接。其也 可以包括一个或多个β-1，2-连接和/或β-1，4-连接，但是通常其仅有的β连接是 β-1，3-连接和/或β-1，6-连接。
该葡聚糖可以是支链和/或直链。
全长天然β-葡聚糖是不溶的并且具有兆道尔顿范围的分子量。优选在本发 明的偶联物中使用可溶性的葡聚糖。通过使长不溶葡聚糖片段化来实现溶解。 这可以通过水解，或者更方便地，通过用葡聚糖酶消化(例如，用β-1，3-葡聚 糖酶或β-1，6-葡聚糖酶)来实现。作为替代，可以通过连接单糖构建块来合成 制备短葡聚糖。
优选低分子量葡聚糖，尤其是具有小于100kDa的分子量的那些葡聚糖 (例如，小于80、70、60、50、40、30、25、20或15kDa)。也可能使用寡 糖，例如，含有60或更少(例如，59、58、57、56、55、54、53、52、51、 50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、 33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、 16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4)的葡萄糖单糖单元。在这 个范围内，优选具有10-50或20-40个单糖单元的寡糖。
葡聚糖可以是真菌葡聚糖。“真菌葡聚糖”通常从真菌中得到，但是在特 定的葡聚糖结构在真菌和非真菌(例如，在细菌、低等植物或藻类中)中发现 的情况下，该非真菌生物体可以用作替代性来源。因此，葡聚糖可以衍生自念 珠菌的细胞壁，诸如白色念珠菌(C.albicans)，或来自粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌 (Histoplasma capsulatum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴西副 球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)或苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)。
存在各种真菌β-葡聚糖来源。例如，纯β-葡聚糖是市售可得的，例如石 耳素(卡巴开公司(Calbiochem))是纯化自云南石耳(Umbilicaria papullosa) 的β-1，6-葡聚糖。β-葡聚糖可以各种方式纯化自真菌细胞壁。例如，参考文献 70公开了用于从念珠菌中制备水溶性β-葡聚糖提取物的2-步骤过程，不含甘 露聚糖，其包括NaClO氧化和DMSO萃取。所得的产物(“念珠菌可溶性β-D- 葡聚糖”或“CSBG”)主要由直链β-1，3-葡聚糖和直链β-1，6-葡聚糖部分组成。 相似地，参考文献71公开了从念珠菌生产GG-zym。来自白色念珠菌的这样的 葡聚糖包含(a)带β-1，3-侧链的β-1，6-葡聚糖并且平均聚合度为约30，和(b) 带β-1，6-侧链的β-1，3-葡聚糖并且平均聚合度为约4。
在本发明的一些实施方式中，葡聚糖是具有一些β-1，6分支的β-1，3葡聚 糖，如在例如昆布多糖中所见。昆布多糖发现于褐藻和海藻。昆布多糖的 β(1-3)∶β(1-6)之比在不同来源之间变化，例如低至褐藻类(Eisenia bicyclis)昆 布多糖中的3∶2，但是高至掌状海带(Laminaria digititata)昆布多糖中的7∶1 [72]。因此，本发明使用的葡聚糖可能具有1.5∶1-7.5∶1，例如，约2∶1、3∶1、4∶1、 5∶1、6∶1或7∶1的β(1-3)∶β(1-6)比率。任选地，葡聚糖可能具有末端甘露糖醇亚 基，例如，1，1-α-连接的甘露糖醇残基[73]。葡聚糖也可以包含甘露糖亚基。
在其他实施方式中，葡聚糖只是或主要是β-1，3连接，如参见凝乳聚糖。 相比包括其他连接的葡聚糖，这些葡聚糖可以引发更好的保护，尤其是包括 β-1，3连接的葡聚糖和β-1，6连接的更强保护。因此葡聚糖可以仅由β-1，3连接 的葡萄糖残基组成(例如，只有1，3连接的直链β-D-吡喃葡萄糖)。任选地， 虽然，葡聚糖可以包含非β-1，3-连接的葡萄糖残基的单糖残基，例如其可以包 含β-1，6-连接的葡萄糖残基。β-1，3-连接的葡萄糖残基与这些其他的残基之比应 该为至少8∶1(例如，≥9∶1、≥10∶1、≥11∶1、≥12∶1、≥13∶1、≥14∶1、≥15∶1、≥16∶1、 ≥17∶1、≥18∶1、≥19∶1、≥20∶1、≥25∶1、≥30∶1、≥35∶1、≥40∶1、≥45∶1、≥50∶1、≥75∶1、 ≥100∶1等)和/或存在一个或多个(例如，≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、 ≥9、≥10、≥11、≥12等)序列的至少5个(例如，≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10、 ≥11、≥12、≥13、≥14、≥15、≥16、≥17、≥18、≥19、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60 等)相邻的非-末端残基仅通过β-1，3连接与其他残基相连。“非-末端”表示该 残基并不存在于葡聚糖的游离末端。在一些实施方式中，相邻的非-末端残基 可以不包含与下面所述的运载体分子、接头或其他间隔子偶联的任意残基。5 个相邻的非-末端残基仅通过β-1，3连接与其他残基相连的存在会提供保护性抗 体应答，例如，针对白色念珠菌(C.albicans)。
在其他实施方式中，偶联物可以包含两种不同的葡聚糖，例如具有 1.5∶1-7.5∶1的β(1-3)∶β(1-6)比率的第一葡聚糖，和只有或主要具有β-1，3连接的 第二葡聚糖。例如，偶联物可以同时含有昆布多糖葡聚糖和凝乳聚糖葡聚糖。
在β-葡聚糖以需要的比率和/或序列同时包含β-1，3和β-1，6连接的情况下， 可以在自然中发现该葡聚糖(例如，昆布多糖)，或其可以是人工制备的。例 如，可以全部或部分有化学合成制备。化学合成β-1，3/β-1，6葡聚糖的方法是已 知的，例如来自参考文献74-84的实施例。以需要的比率同时包含β-1，3和β-1，6 连接的β-葡聚糖也可以从购得的葡聚糖开始制备，并且用β-1，6-葡聚糖酶(也 称为葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶、1，6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶等；EC3.2.1.75) 或β-1，3-葡聚糖酶(诸如外切-1，3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)或内切-1，3-葡聚糖 酶(EC3.2.1.39)处理购得的葡聚糖直至达到需要的比率和/或序列。
当需要仅含有β-1，3-连接的葡萄糖的葡聚糖时，寻求完成β-1，6-葡聚糖酶 处理，由于β-1，6-葡聚糖酶会最终产生纯β-1，3葡聚糖。然而，更方便地，可以 使用纯β-1，3-葡聚糖。这些可以通过化学和/或酶合成来合成制备，例如使用(1 →3)-β-D-葡聚糖合成酶，其中的几个已知来自许多生物体(包含细菌、酵母、 植物和真菌)。化学合成β-1，3葡聚糖的方法是已知的，例如来自参考文献85-88 的实施例。作为合成的有用替代，可以使用天然β-1，3-葡聚糖，诸如凝乳聚糖 (来自之前称为粪产碱菌粘变种(Alcaligenes faecalis var.myxogenes)的农 杆菌(Agrobacterium)的直链β-1，3-葡聚糖，购自例如西格玛-艾尔德里奇公 司(Sigma-Aldrich)目录号C7821)或副淀粉(来自眼虫(Euglena)的β-1，3- 葡聚糖)。产生高水平β-1，3-葡聚糖的生物体为本领域已知，例如参考文献89 和90的农杆菌(Agrobacterium)，或参考文献91的小眼虫(Euglena gracilis)。
昆布多糖和凝乳聚糖通常在自然中发现为高分子量聚合物，例如具有 至少100kDa的分子量。它们通常不溶于水性介质。因此，以其天然形式并不 适于免疫。因此，本发明可以使用较短的葡聚糖，例如，含有60或更少(例 如，59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、 43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、 26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、 9、8、7、6、5、4)的葡萄糖单糖单元的那些。可使用具有2-60范围内数量 的葡萄糖残基，例如10-50或20-40个葡萄糖单元的葡聚糖。具有25-30个葡 萄糖残基的葡聚糖是特别有用的。合适的葡聚糖可以，例如通过天然葡聚糖的 酸水解，或通过例如用诸如β-1，3-葡聚糖酶的葡聚糖酶的酶消化形成。也可用 具有11-19，例如13-19并且尤其是15或17个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。具 体地，专门考虑到具有下面的结构(A)或(B)的葡聚糖用于本发明：
其中n+2在2-60的范围内，例如10-50或2-40。优选地，n+2在25-30或 11-19，例如13-17的范围内。发明人已经发现n+2＝15是合适的。
其中n在0-9的范围内，例如1-7或2-6。优选地，n在3-4或1-3的范围 内。发明人已经发现n＝2是合适的。
在一些实施方式中，葡聚糖是单分子物质。在这些实施方式中，全部的葡 聚糖分子在序列上是相同的。因此，全部的葡聚糖分子在它们的结构性质上， 包括分子量等是相同的。这种形式的葡聚糖通常通过化学合成得到，例如使用 上述的方法。例如，参考文献86描述了单β-1，3连接的物质的合成。或者，在 其他实施方式中，葡聚糖可以从天然葡聚糖得到，例如来自上述的掌状海带 (L.digitata)、农杆菌(Agrobacterium)或眼虫(Euglena)的葡聚糖，纯化 葡聚糖直至得到需要的单分子物质。已经以这种方式纯化的天然葡聚糖是市售 可得的。可以通过测量葡聚糖样品的多分散性(Mw/Mn)来鉴定单分子物质 的葡聚糖。可以方便地通过SEC-MALLS测量该参数，例如参考文献92中所 述。适用于本发明的这个实施例中的葡聚糖具有约1，例如1.01或更低的多分 散性。
可以通过引入离子基团来增加诸如凝乳聚糖的天然葡聚糖的溶解性(例 如，通过硫酸化，尤其是在凝乳聚糖中的O-6处)。本发明可以使用这样的 修饰，但是其被理想地避免，由于它们可能改变葡聚糖的免疫原性。
当糖是葡聚糖时，其通常是昆布多糖。
肺炎链球菌荚膜糖
如上述，糖也可以是细菌荚膜糖。其他示例性的细菌荚膜糖包含来自肺炎 链球菌(S.pneumoniae)的那些。然而，在一些实施方式中，糖不是来自肺炎 链球菌的荚膜糖。
当糖是来自肺炎链球菌的荚膜糖时，其通常选自以下肺炎球菌血清型：1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F和33F中的一种，并且优选选自1、5、6B、 14、19F和23F。来自肺炎链球菌的荚膜糖包括可以含有高达8个糖残基的重 复寡糖单元。主要肺炎链球菌血清型的寡糖单元描述于图1以及参考文献93 和94。
无乳链球菌荚膜糖
其他示例性的细菌荚膜糖包含来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) (“GBS”)的那些。所述荚膜糖共价连接到GBS的肽聚糖骨架上，并且与B 组抗原不同，B组抗原是连接到肽聚糖骨架上的另一种糖。
所述GBS荚膜糖在化学上相关，但是抗原性上非常不同。所有GBS荚膜 糖共有以下三糖核心：
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
各种GBS血清型的区别在于修饰其核心的方式。例如，血清型Ia和III 的区别在于，核心中采用GlcNAc(Ia)或Gal(III)来连接连续的三糖核心。血清 型Ia和Ib的核心中都具有连接GlcNAc的[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→] 二糖，但连接是1→4(Ia)或1→3(Ib)。
GBS-相关疾病主要是由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII 引起，超过85％是由以下五种血清型引起的：Ia、Ib、III和V。本发明可以使 用来自这4种血清型中的一种的糖。这4中血清型中每种的荚膜糖包含：(a) 末端N-乙酰基-神经氨酸(NeuNAc)残基(一般称为唾液酸)，在所有情 况下2→3连接至半乳糖残基；和(b)三糖核心内的N-乙酰基-葡糖胺残基 (GlcNAc)。
所有四种糖包含所述三糖核心中的半乳糖残基，但是血清型Ia、Ib、II和 III也包含各重复单位中的其他半乳糖残基。
根据本发明使用的糖可为天然形式，或也可经修饰。例如，糖可以比天然 荚膜糖短，或可被化学修饰。特别地，本发明使用的所述血清型V荚膜糖可以 如参考文献95和96所述进行修饰。例如，已经基本上脱唾液酸化的血清型V 荚膜糖。脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜糖可通过以下方式制备：在温和酸 性条件下(例如0.1M硫酸，80℃持续60分钟)处理纯化的GBS血清型V荚 膜糖或者用神经氨酸酶处理，如参考文献95所述。因此，本发明所用的糖可 以是如天然发现的基本全长荚膜多糖，或可短于天然长度。可解聚全长多糖以 提供用于本发明的较短片段，例如，通过在温和酸中水解、通过加热、通过尺 寸层析等。特别地，本发明使用的所述血清型II和/或III荚膜糖可以如参考文 献97和98所述进行解聚。
相对于与天然情况下发现的荚膜糖，可对该糖进行化学修饰。例如，糖可 被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全 部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。根 据具体的糖，去乙酰化可影响或不影响免疫原性。参考文献99讨论了各种血 清型中GBS糖上O-乙酰化的关联，且在一些实施方式中，位置7、8和/或9 处唾液酸残基的O-乙酰化在偶联前、期间和之后都保留，例如通过保护/去保 护、通过再乙酰化等。然而，本发明所用的GBS糖通常在位置7、8和/或9 处基本没有唾液酸残基的O-乙酰化。具体地，当所述GBS糖通过下文所述的 碱提取纯化时，通常会丧失O-乙酰化。可通过常规试验评价去乙酰化等的效 果。
可用已知技术纯化荚膜糖，如参考文献100所述。典型的方法包括碱提取、 离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处理、浓缩、尺寸排阻层析、超滤、 阴离子交换层析和进一步超滤。也使用酶变溶菌素处理GBS细胞，酶变溶菌 素剪切细菌细胞壁以释放所述细胞壁的成分。
作为替代，可使用参考文献101所述的纯化过程。这涉及碱提取、乙醇 /CaCl2处理、CTAB沉淀和再溶。参考文献102中记载了另一种替代方法。
金黄色葡萄球菌荚膜糖
其他示例性的细菌荚膜糖包含来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)，尤其是 金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜糖的那些。5型和8型荚膜多糖的结构参见 参考文献103和104，例如：
5型
→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
近期的NMR谱图数据[16]导致将这些结构修改为：
5型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
可以相对于天然情况下发现的荚膜多糖对该多糖进行化学修饰。
例如，多糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、 N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但通 常在偶联前进行。根据具体的多糖，去-乙酰化可能影响或不影响其免疫原性， 如NeisVac-CTM疫苗采用去-O-乙酰化的多糖，而MeniugateTM是乙酰化的，但 这两种疫苗都是有效的。可通过常规试验评价去乙酰化等的效果。例如，金黄 色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖上O-乙酰化的相关性可参见参考文献106。据 该文献称，天然多糖具有75％O-乙酰化。这些多糖将抗体诱导至多糖主链和 O-乙酰基上。具有0％O-乙酰化的多糖仍然引发针对该多糖主链的抗体。两种 抗体类型对O-乙酰基含量不同的金黄色葡萄球菌菌株有调理活性。因此，本 发明所用的5型或8型荚膜多糖可具有0至100％O-乙酰化。
多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定，例如质子NMR (如参考文献107、108、109或110所述)。参考文献111中记载了另一种方 法。可采用类似方法测定多糖的N-乙酰化程度。可通过水解去除O-乙酰基， 例如用碱如无水肼[112]或NaOH[106]处理。可使用类似方法去除N-乙酰基。 为了维持5型和/或8荚膜多糖上的高水平O-乙酰化，最大程度减少导致O-乙 酰基水解的处理，例如在极端pH下的处理。
可通过已知技术纯化荚膜多糖，如本文引用的参考文献所述。典型方法包 括用苯酚-乙醇灭活金黄色葡萄球菌细胞、离心、溶葡萄球菌素处理、RNA酶 /DNA酶处理、离心、渗析、蛋白酶处理、进一步渗析、过滤、用乙醇/CaCl2沉淀、渗析、冻干、阴离子交换层析、渗析、冻干、尺寸排阻层析、渗析和冻 干[113]。另一方法包括高压灭菌金黄色葡萄球菌细胞、超滤含多糖的上清液、 浓缩、冻干、用偏高碘酸钠处理以除去磷壁酸、进一步超滤、渗滤、高效尺寸 排阻液相层析、渗滤和冻干[114]。
然而本发明不限于纯化自天然来源的多糖，可通过其它方法如全合成或部 分合成获得所述多糖。
其他细菌荚膜糖
其他示例性的细菌荚膜糖包含来自B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)Typhi Vi血清型和艰难梭菌 (Clostridium difficile)的那些。
无乳链球菌糖
本发明也可以使用非-荚膜细菌糖。示例性的非-荚膜细菌糖是酿脓链球菌 (S.pyogenes)GAS糖(也被称为GAS细胞壁多糖，或GASP)。这些糖 表征为具有由交替的α-(1→2)和α-(1→3)接头以及β-(1→3)-连接到交替的鼠李 糖环的D-N-乙酰基葡糖胺(GlcpNAc)残基组成的L-鼠李吡喃糖(Rhap) 主链的分支结构([115])。
GAS糖通常会以其天然形式存在，但是其可能已经被修饰。例如，糖可 以比天然GAS糖短，或可被化学修饰。
因此，本发明所用的糖可以是如自然中发现的基本全长的GAS碳水化合 物，或可短于天然长度。可解聚全长多糖以提供用于本发明的较短片段，例如， 通过在温和酸中水解、通过加热、通过尺寸层析等。已经提出将对应于GAS 糖末端单元的短片段用于疫苗[116]。因此，本发明中也考虑短片段。然而，优 选采用基本全长的糖。GAS糖通常具有约10，尤其是约7.5-8.5kDa的分子量。 可通过HPLC，例如SEC-HPLC，使用TSK Gel G3000SW柱(西格玛(Sigma)) 参考支链淀粉标准，例如购自聚合物标准服务公司(Polymer Standard Service) 的那些来测定分子量[117]。
可相对于天然情况下发现的GAS碳水化合物所述糖进行化学修饰。例如， 可对所述糖进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。 可通过常规鉴定评价例如，去乙酰化等对免疫原性的作用。
偶联物
本发明涉及包括抗原和运载体分子的偶联物，其中该运载体分子包括 spr0096抗原和spr2021抗原。
运载体分子可直接与抗原共价偶联，或通过接头偶联。可采用任何合适的 偶联反应，必要时采用任何合适的接头。
优选通过-NH2基团，例如运载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧 链中的-NH2基团连接抗原与运载体。当抗原具有游离醛基时，醛基可与运载体 中的氨基反应，通过还原胺化形成偶联物。也可通过例如半胱氨酸残基侧链中 的-SH基团连接运载体。或者，抗原可通过接头分子与运载体连接。
一般在偶联前活化或官能化所述抗原。活化可包括例如：用氰化试剂如 CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[118，119等])。其它合适技术采 用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、 S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献7的引言)。
直接连接蛋白质可包括氧化抗原，然后与蛋白进行还原性胺化，如参考文 献120和121所述。
可用任何已知方法，如参考文献122和123所述的过程通过接头基团进行 连接。接头通常通过糖抗原的异头碳连接。优选的连接类型是己二酸接头，这 种连接可通过以下方式形成：将游离-NH2基团(如通过胺化引入糖中)与己二 酸偶联(例如，利用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质与所得的抗原-己二酸中 间体偶联[5，124，125]。相似的优选类型的连接是戊二酸接头，其可以通过以相 同的方式将游离的-NH2基团与戊二酸偶联形成。也可以通过直接与抗原偶 联，例如，不先向抗原引入例如游离-NH2基团的游离基团来形成己二酸和戊 二酸接头，再将蛋白与所得的抗原-己二酸/戊二酸中间体偶联。另一种优选 的连接类型是羰基接头，其可通过以下方式形成：使经修饰的抗原的游离羟基 与CDI发生反应[126，127]，之后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接。其它接头 包括β-丙酰胺基[128]、硝基苯基-乙胺[129]、卤代酰卤[130]、配糖键[131]、6- 氨基己酸[132]、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)[133]、己二 酸二酰肼ADH[134]、C4-C12部分[135]等。也可采用碳二亚胺缩合反应[136]。
可采用双官能接头提供偶联抗原中氨基(例如，通过胺化引入到抗原中) 的第一基团和偶联运载体(一般偶联于运载体的氨基)的第二基团。或者，第 一基团能够与抗原直接偶联，例如，没有之前向抗原引入基团，例如氨基。
在一些实施方式中，双官能接头中的第一基团因此能够与抗原的氨基 (-NH2)反应。此反应一般包括氨基氢原子的亲电子取代。在其他实施方式中， 双官能接头中的第一基团能够与抗原直接反应。在两组实施方式中，所述双官 能接头中的第二基团通常能与运载体上的氨基反应。该反应通常也包括氨基的 亲电取代。
当与抗原和运载体的反应包含胺时，优选使用双官能接头。例如，可使用 式X-L-X的同双官能接头，其中：两个X基团相同，并可与胺发生反应；并 且其中L是接头中的连接部分。相似地，可使用式X-L-X的异双官能接头， 其中：两个X基团不同，并可与胺发生反应；并且其中L是接头中的连接部 分。优选X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L优选具有式L′-L2-L′，其中L′是羰基。 优选的L2基团是含1-10个碳原子(如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、 C10)的直链烷基，如-(CH2)4-或-(CH2)3-。
相似地，在与抗原的反应包括直接偶联并且与运载体的反应包括胺的情况 中，也优选使用双官能接头。例如，可使用式X-L-X的同双官能接头，其中： 两个X基团相同，并可与抗原/胺发生反应；并且其中L是接头中的连接部分。 相似地，可使用式X-L-X的异双官能接头，其中：两个X基团不同，并可一 个可与抗原发生反应而另一个可与胺发生反应；并且其中L是接头中的连接部 分。优选X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L优选具有式L′-L2-L′，其中L′是羰基。 优选的L2基团是含1-10个碳原子(如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、 C10)的直链烷基，如-(CH2)4-或-(CH2)3-。
在前两段中描述的双官能接头中使用的其它X基团是当与HO-L-OH结合 时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。
用于本发明的其它双功能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)和卤代酰卤。
在与抗原的偶联中，通常会加入对于抗原摩尔过量的接头。
当抗原具有单个与运载体分子相连的基团(任选地通过接头)，并且运载 体具有与不同抗原/接头分子相连的多个基团时，所得的偶联物可以形成“星” 结构。该结构包括具有中心运载体分子，上有多个从运载体辐射开的抗原分子 (任选地通过接头)。当抗原具有超过一个的与运载体分子相连的基团(优选 通过接头)，并且运载体具有超过一个的与不同抗原/接头分子相连的基团时， 所得的偶联物可以形成“网”结构。该结构包括运载体分子与抗原分子相连接 的网(任选地通过接头)。
偶联物可具有过量运载体(w/w)或过量抗原(w/w)，例如比率范围为 1∶5-5∶1。具有过量运载体蛋白的偶联物通常，例如在0.2∶1-0.9∶1，或等重量的 范围内。该偶联物可包含少量游离(即未偶联)的运载体。当本发明组合物中 给定运载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式优选不多于组合物中运载 体蛋白总量的5％，更优选少于2％(以重量计)。
当在本发明的药物组合物中包括偶联物时，该组合物可以包括游离的运载 体蛋白作为免疫原[137]。
偶联后，可分离游离和偶联的抗原。有许多合适的方法，例如，疏水层析、 切向超滤、透析等[也可参见参考文献138和139等]。优选切向流超滤。
偶联物中的糖部分优选如上定义的低分子量的糖或寡糖。通常在偶联前对 寡糖进行筛分。
所述偶联物优选可溶于水和/或生理缓冲液。
经修饰包含非天然氨基酸的运载体分子的产生和偶联
对于一个或多个非-天然氨基酸残基包含于运载体分子的情况，可以使用 标准过程来实施。一个这样的方法包括使用经修饰的宿主细胞，其中针对特定 密码子的氨酰tRNA合成酶已经被工程改造为将tRNA与非-天然氨基酸偶联， 该非-天然氨基酸然后在翻译中被引入到运载体中[参见对这类技术的综述的参 考文献140]。或者，一些过程利用以下事实，即当天然关联的氨基酸不存在时， 一些非-天然氨基酸通过天然细胞机理引入到蛋白中。在引入HAG中观察到这 第二类型过程的示例。在此，在一些细胞中，如果具有低量或没有甲硫氨酸， 那么天然细胞立即会在蛋白合成的起始和延伸步骤中在甲硫氨酸的位置上引 入HAG。许多用于蛋白表达的宿主细胞是甲硫氨酸原养型的，例如，细胞可 以从头合成该氨基酸。因此，通过使用甲硫氨酸营养缺陷型的细胞，可能降 低甲硫氨酸的水平至HAG在甲硫氨酸的位置上被引入到蛋白中。示例性的 甲硫氨酸营养缺陷型宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)菌株B834(DE3) (Merck)和T7Express Crystal(NEB)，虽然其他合适的菌株对于技术人员 马上是显见的。
用于偶联运载体分子的偶联技术/反应应该对非-天然氨基酸中的官能团是 合适的。例如，在非-天然氨基酸是HAG的情况中，使用硫-烯(thiyl-ene) 偶联[参见，例如参考文献141]。
包括偶联物的混合物
本发明的偶联物可以与其他抗原混合。这些其他的抗原可以是本发明的其 他偶联物或它们可以是其他抗原。
例如，考虑了偶联物的混合物。这些混合物中的至少一种偶联物是本发明 的偶联物，例如，包括spr0096抗原和spr2021抗原的运载体分子。这些混合 物中的其他偶联物通常也会是本发明的偶联物。然而，当其他偶联物不是本发 明的偶联物时，运载体分子可以是任意合适的运载体蛋白(如下所述)，通常 是在各偶联物中相同的运载体分子。
例如，考虑了来自一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清型的偶联物的混合物，例 如包括来自血清型A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、 A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖的组合物。混合物通常是包括来 自血清组A、C、W135和Y的糖的偶联物的混合物。这些混合物中的至少一 种偶联物是本发明的偶联物，例如，包括spr0096抗原和spr2021抗原的运载 体分子。这些混合物中的其他偶联物通常也会是本发明的偶联物。然而，当其 他偶联物不是本发明的偶联物时，运载体分子可以是任意合适的运载体蛋白 (如下所述)，通常是在各偶联物中相同的运载体分子。
合适的运载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或者其类毒素或突 变体。本发明人发现CRM197白喉毒素突变体[142]是特别合适的。其他合适 的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[143]、合 成肽[144，145]、热激蛋白[146，147]、百日咳蛋白[148，149]、细胞因子[150]、淋 巴因子[150]、激素[150]、生长因子[150]、人血清白蛋白(通常是重组的)、 包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[17]例如 N19[151]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[152-154]、肺炎球菌 表面蛋白PspA[155]、肺炎球菌溶血素[156]或其无毒衍生物[157]、摄铁蛋白 [158]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[159]、GBS蛋白[160]、GAS 蛋白[161]等。
一种运载体蛋白可携带一种以上多糖抗原[162，163]。为了实现这一目的， 可以在偶联过程之前混合不同的糖。然而，通常各糖形成不同的偶联物，偶联 后混合不同的糖。单独的偶联物可以基于相同的运载体，尤其是包括spr0096 抗原和spr2021抗原的相同运载体。
例如，本发明的混合物可以是来自血清组A、C、W135和Y的各糖的单 独偶联物的混合物，其中血清组A偶联物是本发明的偶联物，例如，包括 spr0096抗原和spr2021抗原的运载体分子，并且血清组C、W135和Y偶联物 不是本发明的偶联物。在这个实施方式中，血清组C、W135和Y偶联物中的 运载体分子通常是CRM197。
在混合物包括来自血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖与MenC糖之比 (w/w)优选大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。
在混合物包含来自血清组Y与血清组C和W135中一组或两组的荚膜糖 时，MenY糖与MenW135糖之比(w/w)优选大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、 5∶1、10∶1或更高)，和/或MenY糖与MenC糖之比(w/w)优选小于1(例如， 1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。
来自血清组A∶C∶W135∶Y的糖的优选比(w/w)为：1∶1∶1∶1、1∶1∶1∶2、2∶1∶1∶1、 4∶2∶1∶1、8∶4∶2∶1、4∶2∶1∶2、8∶4∶1∶2、4∶2∶2∶1、2∶2∶1∶1、4∶4∶2∶1、2∶2∶1∶2、4∶4∶1∶2 和2∶2∶2∶1。比通常为2∶1∶1∶1。混合物也可以包括蛋白。例如，混合物可以包含 来自脑膜炎奈瑟球菌的血清组B的蛋白[例如，参考文献164-169]或OMV制 剂[例如，参考文献170-173等]。
额外的抗原可包括来自非脑膜炎奈瑟球菌病原体的抗原。因此，本发明 的组合物还可包含一种或多种非脑膜炎奈瑟球菌抗原，包括其它细菌、病毒或 寄生虫抗原。这些抗原可选自下列：
-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，参考文献 174-176；参考文献183的第22和23章]。
-来自甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[例如，参考文献177，178；参考 文献183的第15章]。
-来自乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如，参考文献 178，179；参考文献183的第16章]。
-来自丙型肝炎病毒的抗原[例如，参考文献180]。
-来自百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如百日咳博德特 菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附 素(pertactin)和/或凝集原2和3组合使用[例如，参考文献181和182；参考 文献183的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献183的第13章]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献183的第27章]。
-来自B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的糖抗原[例如，参考 文献183的第14章]。
-来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)的抗原[例如，参考文献164-167]。
-来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如，参考文献184、 185、186、187、188、189、190]。
-来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原[例如，参考文献191]。
-来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[例如，参考文 献192]。
-脊髓灰质炎抗原[例如，参考文献193，194；参考文献183的第24章]诸如 IPV。
-狂犬病抗原[例如，参考文献195]诸如冻干的失活病毒[例如，参考文献 196，RabAvertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[例如，参考文献183的第19、20和26章]。
-流感抗原[例如，参考文献183的第17和18章]，诸如血细胞凝集素和/ 或神经氨酸酶表面蛋白。
-来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如，参考文献197]。
-来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[例如， 参考文献198，199，200]。
-来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的抗原[例如 参考文献160，201-203]。
-来自表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的抗原[例如，可由菌株ATCC-31432、 SE-360和SE-10获得的I、II和/或III型荚膜多糖，如参考文献204，205和206 所述]。
在采用糖或碳水化合物抗原时，通常与运载体偶联以增强免疫原性。运载 体分子可以是本发明的运载体，例如，包括spr0096抗原和spr2021抗原的运 载体。或者，运载体分子可以是任意合适的运载体蛋白，例如上述。熟知B型 流感嗜血菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌的糖抗原的偶联。
必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日 咳毒素脱毒[182])。
在所述组合物中包含白喉抗原时，通常还包含破伤风抗原和百日咳抗原。 相似地，在包含破伤风抗原时，通常还包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包 含百日咳抗原时，通常还包含白喉和破伤风抗原。
抗原可以吸附于铝盐。
所述组合物中抗原存在的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原 的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。
作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的一种替代方式，可使用编码该抗原 的核酸[例如，参考文献207-215]。本发明的组合物的蛋白质组分可被编码该蛋 白的核酸(通常是DNA，如质粒形式的DNA)取代。
在实践层面上，本发明组合物中包含的抗原数可能有上限。本发明的组合 物中抗原(包括本发明的偶联物)的数量可以少于20、少于19、少于18、少 于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少 于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3种。在组合物中本 发明的偶联物的数量可能少于6、少于5或少于4种。
包括偶联物的药物组合物
本发明提供包括(a)本发明偶联物，和(b)药学上可接受的运载体的药 物组合物。对这类运载体的充分讨论参见参考文献216。
微生物感染会影响身体的各个部分，因此可将本发明的组合物制备为各种 形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制 备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式。可制备所述组合物用于 局部给药，例如作为油膏、乳膏或粉剂。可将所述组合物制备为用于口服的制 剂，例如，片剂、胶囊或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备为采用细粉 或喷雾进行肺部给药，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或子宫帽。 可将所述组合物制备为用于鼻、耳或眼部给药的制剂，例如，滴剂、喷雾剂、 或粉剂[例如参考文献217]。所述组合物可包含于漱口剂中。所述组合物可经 冻干。
所述组合物优选无菌。其优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如 pH6-pH8，通常为约pH7。
本发明还提供包含本发明药物组合物的递送装置。所述装置可以是例如注 射器或吸入器。
本发明的药物组合物优选是免疫原性组合物，其包括免疫有效量的抗原。 免疫学有效量是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防 有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类 组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、 所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变 化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。剂量治疗可以 是单剂量方案或多剂量方案(例如包括加强剂量)。所述组合物可与其它免疫 调节剂联合给药。
一旦配制好，可将本发明组合物直接给予对象。所述待治疗对象可以是动 物；具体而言，可治疗人类对象。
本发明免疫原性组合物的使用可以是治疗性(即治疗已有的感染)或预防 性(即防止将来的感染)的。治疗性免疫特别用于治疗免疫削弱的对象中的 念珠菌感染。
免疫原性组合物还可包含佐剂，其可发挥增强在接受所述组合物的患者中 引发的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)的作用。可用于本发明的佐剂包括 但不限于：
·含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙 (如参考文献218公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸 盐等，所述盐可采用任何合适形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附 于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[219]。可采用称为氢 氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为使用方便，因为其均不 是出现的实际化合物的精确描述(例如参见参考文献302的第9章)。本发明 可采用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝” 的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为“磷酸铝”的佐剂 一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过 沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。 本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化 铝，例如重量比为至少2∶1，例如，≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。给予患 者的组合物中Al+++浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、 ≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值0.85mg/剂量。
·皂苷[参考文献302的第22章]是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根 甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得 自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可市售获自丽花菝 葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱 花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂 如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。已采用HPLC 和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定纯化组分，包 括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。 制备QS21的方法公开于参考文献220。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇 [221]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独 特颗粒[参考文献302的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺 或磷脂酰胆碱。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、 QHA和QHC中的一种或多种。参考文献221-223中进一步描述了ISCOM。任 选地，ISCOM可不含其它去污剂[224]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参 考文献225和226。
·细菌ADP-核糖基化毒素(例如，大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素“LT”、 霍乱毒素“CT”或百日咳毒素“PT”)及其脱毒衍生物，诸如称为LT-K63 和LT-R72的突变毒素[227]。参考文献228中描述了脱毒的ADP-核糖基化毒 素作为粘膜佐剂的应用，参考文献229中描述了其作为胃肠外佐剂的应用。
·生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[230]或壳聚糖及其衍生 物[231]。
·由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、 聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(例如，直径约100nm- 约150μm，更优选约200nm-约30μm，或最优选约500nm-约10μm的颗粒)， 任选处理以具有带负电表面(例如，用SDS处理)或带正电表面(例如，用 诸如CTAB的阳离子去污剂处理)。
·脂质体(参考文献302的第13和14章)。适用作佐剂的脂质体制剂的 例子见参考文献232-234所述。
·胞壁酰肽，诸如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲-MDP)、N-乙酰葡萄糖胺 酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(“DTP-DPP”或 “TheramideTM”)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸 -2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(“MTP-PE”)。
·聚氧(polyoxidonium)聚合物[235，236]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生 物。
·甲基肌苷5′-单磷酸酯(“MIMP”)[237]。
·多聚羟化吡咯双烷类化合物[238]，如下式化合物：
式中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、 烷基(例如，环烷基)、烯基、炔基和芳基。示例包括但不限于：木麻黄(casuarine)、 木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。
·CD1配体，如α-糖基神经酰胺[239-246](例如，α-半乳糖基神经酰胺)、 含植物鞘氨醇的α-葡萄糖糖神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D- 吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇、CRONY-101、3″-O- 硫代-半乳糖基神经酰胺等。
·γ菊糖[247]或其衍生物，如阿尔加穆林(algammulin)。
·水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表 面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液 中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种 小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭 菌。
·免疫刺激性寡核苷酸，如包含CpG基序(包含通过磷酸键与鸟苷残基连 接的未甲基化的胞嘧啶残基的二核苷酸序列)或CpI基序(包含与肌苷连接的 胞嘧啶的二核苷酸序列)的寡核苷酸、双链RNA、含有回文序列的寡核苷酸 或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物 如硫代磷酸修饰，可以是双链或(除RNA外的)单链。参考文献248、249和 250公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文 献251-256中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可导向TLR9， 如基序GTCGTT或TTCGTT[257]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例 如CpG-A ODN(寡脱氧核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献258-260中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡 核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献257和261-263。 有用的CpG佐剂是CPG7909，也称为ProMuneTM(科雷制药集团公司(Coley Pharmaceutical Group，Inc.))。另一种是CpG1826。或者或此外，为了使用 CpG序列，可使用TpG序列[264]，这些寡核苷酸可不含非甲基化CpG基序。 免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上的连续胸腺嘧 啶核苷酸(例如，参考文献264所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可 能含有＞25％胸腺嘧啶(例如＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％等)。例如， 它可能含有一个以上的连续胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献264所公开的 CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有＞25％胞嘧啶(例如＞35％、＞40％、 ＞50％、＞60％、＞80％等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫 刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。其可包含少于100个核苷酸。
基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC31TM[265]。因此， 本发明使用的佐剂可包含以下的混合物：(i)包含至少一个(优选多个)CpI基 序的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如包含至少一 个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20个氨基酸)。所述寡 核苷酸可以是包含26聚体序列5′-(IC)13-3′(SEQ ID NO：1)的脱氧核苷酸。聚 阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：2) 的肽。
·3-O-脱酰化单磷酰脂质A(“3dMPL”，也称为“MPLTM”)[266-269]。 在水性条件下，3dMPL可形成不同大小如直径＜150nm或＞500nm的胶束聚集 体或颗粒。胶束聚集体或颗粒中的一种或两种可用于本发明，可通过常规试验 选择较好的颗粒。本发明优选使用较小的颗粒(例如小到足以产生澄清的 3dMPL水性悬液)，因为其具有优良的活性[270]。优选颗粒的平均直径小于 220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，甚至平均直径小 于100nm。然而，在大多数情况下，所述平均直径不小于50nm。
·咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特(Imiquimod)(“R-837”)[271，272]、雷 西莫特(Resiquimod)(“R-848”)[273]及其类似物和盐(例如，盐酸盐)。 有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献274-278。
·缩氨基硫脲化合物，如参考文献279公开的化合物。参考文献279中还 描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核 细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·色胺酮化合物，如参考文献280所述的化合物。参考文献280中还描述 了配制、制备和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞 产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·核苷类似物，如(a)埃索他宾(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧 代鸟苷)：
及其前药；(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考 文献281-167公开的化合物；(f)洛索立宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧鸟 苷)[284]。
·参考文献285所述的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、 四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、 氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[286，287]、水合酞酰胺(hydrapthalamide) 化合物、苯并苯基酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮 (quinazilinone)化合物、吡咯化合物[288]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三 嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[289]。
·氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[290，291]。
·磷腈，如参考文献292和293中所述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈] (poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])(“PCPP”)。
·取代的脲或式I、II或III的化合物，或其盐：
如参考文献103所述，例如“ER803058”、“ER803732”、“ER804053”、 “ER804058”、“ER804059”、“ER804442”、“ER804680”、“ER804764”、 ER803022或“ER804057”，如：
·诸如OM-174的来自大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物(如 参考文献295和296所述)。
·含有与含磷酸非环主链相连的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564 [297，298]：
参考文献302和303中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。
组合物中的抗原和佐剂通常相混。
组合物可包含两种或多种所述佐剂。例如，其可有利地同时包含水包油乳 液和3dMPL等。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约 5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％ 鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[299-301]，参 考文献302的第10章和参考文献303的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59 乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。其还 可包含司盘85(例如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％的鲨烯、2-10％ 的生育酚和0.3-3％的吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这可提供更 稳定的乳液。鲨烯和吐温80的体积比可约为5∶2。可通过下述方法制备一种这 样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-a- 生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含 有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液也可 包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(例如，聚山梨酯80)、曲通去污剂(例如，曲通X-100) 和生育酚(例如，琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质 量比约为75∶11∶10(例如，750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100 μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。 所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含 磷酸盐缓冲液。
·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克(Pluronic)TM L121”) 的乳液。所述乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞 壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[304](0.05-1％ Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)一起使用。 也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[305](5％鲨烯、1.25％普流 罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如 参考文献306所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴 尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温 80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固 醇、皂苷-亲脂体偶联物(诸如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷 上而产生的GPI-0100，如参考文献307所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/ 或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳 液[308]。
医学治疗和应用
本发明还提供用于医学，例如用于在哺乳动物中引发抗体应答的本发明的 偶联物。
本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括将本发明的偶联物 或药物组合物给予所述哺乳动物。
本发明还提供将本发明的偶联物用于制备在哺乳动物中预防或治疗微生 物感染的药物。
这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应 答。评价抗原免疫后抗体应答的方法为本领域熟知。所述抗体应答优选IgA或 IgG应答。所述免疫应答可以是预防性和/或治疗性的。所述哺乳动物优选人。
可以通过在给予本发明中的组合物后对微生物感染进行监测来测试治疗 性措施的功效。可通过监测在施用组合物后针对抗原的免疫应答(例如，抗- 抗原的抗体)来测试预防性治疗的效力。
本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹 膜内、静脉内、肌内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、局部、 透皮、皮内、眼部、鼻部、耳部或肺部给药完成直接递送。优选注射或鼻内给 药。
本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，对象可小于1岁、 1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。优选接受疫苗的对象是长者(例如，≥50 岁，≥60岁并且优选≥65岁)，或幼者(例如，≤5岁)。然而所述疫苗不仅适 用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初次免疫方案和 /或加强的免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量，例 如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。 对于首次免疫(immunologically)患者，给予超过一个剂量(一般是两个 剂量)是特别有效的。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6 周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
本发明的用途和方法特别用于治疗/保护免受由衍生出抗原的生物体引起 的感染。下面描述了示例性的用途/方法。
脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖
所述用途和方法可以用于预防和/或治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病， 例如脑膜炎、败血症等。
葡聚糖
因为葡聚糖(并且尤其是β-葡聚糖)是几乎所有真菌，尤其是与免疫削 弱的对象中的感染相关的那些真菌，以及细菌病原体和原生动物的基本和主要 多糖组分，抗葡聚糖免疫可能针对广泛的病原体和疾病有功效。例如，在用酿 酒酵母(S.cerevisiae)免疫后出现的抗-葡聚糖血清与白色念珠菌(C.albicans) 交叉反应。广谱免疫是特别有用的，因为，对于这些人类感染性真菌试剂，化 疗是勉强的，抗真菌耐药性正在出现并且越来越多地认识到对预防性和治疗性 疫苗的需求。
本发明的用途和方法特别用于治疗针对以下引起的感染：念珠菌属，诸如 白色念珠菌(C.albicans)；隐球菌属，诸如新生隐球菌(C.neoformans)；肠 球菌属，诸如粪肠球菌(E.faecalis)；链球菌属，诸如肺炎链球菌 (S.pneumoniae)、变异链球菌(S.mutans)、无乳链球菌(S.agalactiae)和 化脓链球菌(S.pyogenes)；利什曼原虫属(Leishmania species)，诸如硕大 利什曼原虫(L.major)；棘阿米巴属(Acanthamoeba species)，诸如卡氏棘 阿米巴(A.castellani)；曲霉属(Aspergillus species)，诸如烟曲霉(A.fumigatus) 和黄曲霉(A.flavus)；肺囊虫属(Pneumocystis species)，诸如卡氏肺囊虫 (P.carinii)；分枝杆菌属，诸如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；假单胞 菌属，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌属，诸如金黄色葡萄球 菌(S.aureus)；沙门氏菌属，诸如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；孢子 菌属，诸如粗球孢子菌(C.immitis)；毛癣菌属(Trichophyton species)，诸 如疣状毛癣菌(T.verrucosum)；芽生菌属(Blastomyces species)，诸如皮炎 芽生菌(B.dermatidis)；组织胞浆菌属(Histoplasma species)，诸如夹膜组 织胞浆菌(H.capsulatum)；副球孢子菌属(Paracoccidioides species)，诸如 巴西副球孢子菌(P.brasiliensis)；腐霉属，诸如隐居腐霉(P.insidiosum)； 和埃希氏菌属(Escherichia species)，诸如大肠杆菌(E.coli)。
所述用途和方法特别用于预防/治疗以下疾病，包含但不限于：念珠菌病 (包含肝脾性念珠菌病、侵入性念珠菌病、慢性粘膜皮肤念珠菌病和弥散性 念珠菌病)；念珠菌血症；曲霉病，隐球菌病，皮肤真菌病，孢子丝菌病和 其他皮下霉菌病，芽生菌病，组织胞浆菌病，球孢子菌病，副球孢子菌病， 肺囊虫病，鹅口疮，结核病，分枝杆菌病，呼吸道感染，猩红热，肺炎， 脓疱病，风湿热，败血症，败血症，皮肤和内脏利什曼病；角膜棘阿米巴 病，囊性纤维化，伤寒，胃肠炎和溶血尿毒症综合征。抗-白色念珠菌活性 对于治疗AIDS患者中的感染是特别有用的。
本发明的偶联物可与非-葡聚糖抗原结合形成对多种病原体同时免疫的单 个组合物。作为制备联合疫苗的替代方法，可与其它疫苗基本同时(例如在向 健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一次医疗咨询或就诊期间)将偶联物给 予患者。用于这些联合疫苗或伴随给药的抗原包括例如，来自无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或 铜绿假单胞菌、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、脑膜炎奈瑟球菌(如血清组A、 C、W135和/或Y的糖或偶联糖)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) (如糖或偶联糖)等。
本发明的偶联物可以与抗真菌剂联合使用，尤其是在患者已经被感染的情 况中。抗真菌剂提供了当下的治疗效果而偶联物提供了较长持续的效果。合适 的抗真菌剂包含，但不限于唑类(例如，氟康唑、伊曲康唑)、多烯类(例 如，两性霉素B)、氟胞嘧啶和鲨烯环氧酶抑制剂(例如，特比萘芬)[也参 见参考文献309]。抗真菌剂和偶联物可以单独或组合给药。当单独给药时，它 们通常在各自给药的7天内给药。在偶联物的第一次给药之后，可以给予抗真 菌剂一次以上。
肺炎球菌荚膜糖
所述用途和方法可以用于预防和/或治疗由肺炎球菌引起的疾病，例如脑 膜炎、败血症、肺炎等。
定义
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫 学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已 有充分描述。参见，例如参考文献216和310-316等。
上文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier) 是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI 编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信 息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。
当抗原“结构域”被省略时，可以包括省略信号肽、胞质结构域、跨膜结 构域、胞外结构域等。
术语“包括”涵盖“包含”以及“由......组成”，例如，“包括”X的组 合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全 不含Y。必要时，可以从本发明定义中略去词语“基本上”。
与氨基酸相关的术语“经典”是指氨基酸是由通用遗传密码编码的20种 氨基酸之一，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨 酰胺、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、 甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸、色氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何 特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组 分相互合并，然后可将该组合与第三种组分混合等。
将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑 病(TSE)，具体是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不 含动物来源材料的情况下培养细胞。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物或可由合适的前药替 代。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序 列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献317的 7.7.18部分所述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百 分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用 仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵 计62分。参考文献318中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
具体实施方式
A.偶联物的产生和纯化
如下述，昆布多糖、来自血清型5的肺炎球菌荚膜糖以及来自血清组 A、C、W135和Y的脑膜炎球菌荚膜寡糖与各种已知的和实验的运载体蛋 白偶联并纯化。
Lam-96/2021：昆布多糖按照参考文献319的方法在磷酸盐缓冲的盐水 中以多糖酯基与蛋白的摩尔比30和蛋白浓度2-10mg/ml与SEQ ID NO：9偶 联。利用运载体蛋白上的组氨酸标签，通过固定金属离子亲和层析(IMAC) 纯化偶联物。用His MultiTrap HP platesTM(通用电气医疗集团(GE Healthcare))来实施纯化，预填充的96-孔滤板用于组氨酸标记的蛋白的小 规模纯化，其需要使用真空源。纯化的偶联物由SDS-Page表征；MicroBCA 用于蛋白定量；HPAEC-PAD用于糖定量。两个批号具有以下性质：
批号 糖(μg/ml) 蛋白(μg/ml) 糖：蛋白 “旧” 141.0 275.0 0.5 “新” 191.4 333.0 0.6
昆布多糖通过相同的方法与SEQ ID NO：10(Lam-2021/96)偶联。为了比 较，相似地，昆布多糖与以下的运载体蛋白偶联：CRM197、spr0565B(SEQ ID NO：11)、spr1416(SEQ ID NO：12)、spr1418(SEQ ID NO：13)、spr2021 (SEQ ID NO：3)和spr0096(SEQ ID NO：1)。
MenA-、C-、W-和Y-96/2021：来自血清组A、C、W135和Y的脑膜炎 球菌荚膜寡糖使用参考文献320所述的方法与SEQ ID NO：9偶联。通过上述 的IMAC来纯化偶联物。纯化的偶联物由SDS-Page、MicroBCA和HPAEC-PAD 来表征。代表性的偶联物具有以下性质：
为了比较，相似度，这些糖使用参考文献320所述的方法与CRM197偶 联。也使用该方法制备具有较高糖∶蛋白(下文称为“高糖基化”)的 MenA-CRM197偶联物。来自血清组C的脑膜炎球菌荚膜寡糖也与spr1416 (SEQ ID NO：12)偶联。
Pneumo5型-96/2021：来自血清型5的肺炎球菌荚膜糖在Sephacryl S300 柱中进行筛分并且在pH7.2的NaPi10mM，NaCl500mM，含NaIO4(PS重 复单元mol的30％mol)的溶液中室温过夜氧化。通过用6-8kDa截留膜透析 从水中纯化该物质。在37℃下，通过使用在pH8.4的Na284O7100mM，NaCl 100mM(5mg/ml)中氧化的糖以1∶1(w/w)的糖∶蛋白之比和1∶1(w/w)的蛋 白：NaBH3CN之比的还原性胺化来进行偶联48小时。通过向粗偶联物的溶液 中加入固态硫酸铵(500g/l)，将混合物保持在0℃下30分钟以使偶联物沉淀， 然后离心并在pH7.2的NaPi10mM中溶解团块来纯化偶联物。
纯化的偶联物由SDS-Page、MicroBCA和HPAEC-PAD来表征。代表性 的偶联物具有以下性质：
为了比较，相似地，该糖与CRM197偶联。
B.与其他昆布多糖-肺炎球菌蛋白偶联物相比，Lam-96/2021的免疫原性
Lam-96/2021偶联物的免疫原性与和其他衍生自肺炎球菌蛋白抗原的运载 体蛋白偶联的昆布多糖相比较。简单地，含有或不含铝佐剂的糖偶联物(以5μg 糖剂量)在第1、14和28天皮下给予Balb/C小鼠。在第42天对小鼠采血， 并且通过ELISA测量特异性的抗-昆布多糖抗体(使用由未偶联的昆布多糖包 被的平板[321])。
结果示于图2，垂直点状虚线表示单独的研究。在第一个研究中， Lam-96/2021偶联物相比基于spr0565B、spr1416和spr1418肺炎球菌蛋白抗原 的昆布多糖欧偶联物更有免疫原性。偶联物相比基于CRM197的参比昆布多糖 偶联物也更有免疫原性(参见图3，其中合并了来自图2中的第一个研究和第 三个研究的数据)。在第二个研究中，单独基于spr2021的昆布多糖偶联物的 免疫原性低于参比偶联物。在第三个研究中，Lam-96/2021偶联物相比单独基 于spr0096的昆布多糖偶联物更有免疫原性。在存在或缺少铝佐剂的情况下， 该偶联物也都通常相比基于CRM197的参比偶联物更有免疫原性。
C.其他基于96/2021的糖偶联物的免疫原性
使用与昆布多糖偶联物相同的方案测试MenA-、C-、W-和Y-96/2021以 及pneumo5型-96/2021偶联物的免疫原性并且与基于CRM197的参比偶联物 相比较。用每剂量2μg MenA糖、1μg MenC糖、1μg MenW糖和1μg MenY 糖来免疫Balb/C小鼠。通过ELISA试验来测定特异性抗-多糖抗体(使用由天 然未偶联的多糖包被的平板)。
结果示于图4，垂直水平线表示单独的研究。在第一个研究中，pneumo5 型-96/2021偶联物显示为免疫原性。在铝佐剂(alum)存在下，该偶联物相比 基于CRM197的参比偶联物更有免疫原性(含有铝佐剂的相似结果在图5中报 道的相关免疫原性研究中发现)。在第二个研究中，MenA-、C-、W-和Y-96/2021 显示是免疫原性的，其免疫原性相当于或好于参比偶联物的免疫原性。
D.Pneumo5型-96/2021偶联物提供保护性免疫
在针对肺炎链球菌血清型5感染的保护性免疫的小鼠模型中Pneumo5 型-96/2021偶联物与参比Pneumo5型-CRM197偶联物相比较。在这个实验中， 在第0、14和28天用不同的免疫原(含或不含铝作为佐剂)腹膜内免疫各组 10只小鼠。两组小鼠分别仅用PBS和PBS/铝免疫，用作阴性对照。在最后一 次免疫2周后，用致死剂量的肺炎链球菌5型菌株(STREP-5)腹膜内感染 全部的组。使用细菌减少和死亡率的测量值来评价保护性功效。在感染24小 时后，在各免疫组中细菌的水平升高并且与对照组的水平相当。在感染后持续 10天跟踪死亡率。
结果如图6所示。在铝佐剂存在下，在1μg和0.25μg的剂量下，两种偶 联物都赋予完全的保护。然而，只有pneumo5型-96/2021偶联物能够在没有 佐剂的情况下赋予针对死亡的保护。
在相关的研究中，这些偶联物与单独或一起的糖或96/2021运载体蛋白相 比较。两种偶联物给予完全(pneumo5型-96/2021偶联物)或几乎完全(pneumo 5型-CRM197)的保护。相反，糖和运载体(单独或一起)是无效的(图7)。
E.MenA-96/2021偶联物的免疫原性
从给予以下的小鼠中收集第二次免疫后的血清：a)与CRM197或96/2021 偶联的MenA寡糖；b)MenA-、C-、W-和Y-96/2021的组合，含或不含铝。 通过ELISA测试这些收集组的抗血清组A抗体效价。在使用兔补体(rSBA) 的血清细菌试验中评价引发的针对荚膜多糖的抗体的功能性。
图8显示了合并的血清的结果。MenA-96/2021偶联物相比MenA-CRM197 偶联物更有免疫原性。当与相应的MenC、MenW135和MenY偶联物组合时， MenA-96/2021偶联物保持免疫原性。当测试来自单独小鼠的第二次免疫后的 血清时，得到相似的观察结果(图9，柱之上的SBA效价)。
在另一个研究中，从给予以下的小鼠中收集第二次免疫后的血清：a)与 CRM197或96/2021偶联的MenA寡糖；b)MenA-96/2021偶联物与MenA-、 C-、W-和Y-96/2021偶联物的组合，含或不含铝。通过ELISA测试这些收集 组的抗血清组A抗体效价。MenA-96/2021偶联物再次相比MenA-CRM197偶 联物更有免疫原性(图10，柱上的SBA效价)。当与MenC-、W-和Y-CRM197 偶联物组合时，MenA-96/2021偶联物保持免疫原性。
F.MenC-96/2021偶联物的免疫原性
从给予以下的小鼠中合并收集第二次免疫后的血清：a)与CRM197或 96/2021偶联的MenC寡糖；b)MenA-、C-、W-和Y-96/2021的组合，含或不 含铝。通过ELISA测试这些收集组的抗血清组C抗体效价。在使用兔补体 (rSBA)的血清细菌试验中评价引发的针对荚膜多糖的抗体的功能。
图11显示合并的血清的结果，柱上是SBA效价。MenC-96/2021偶联物 的免疫原性似乎高于或相当于MenC-CRM197偶联物。当与相应的MenC、 MenW135和MenY偶联物组合时，MenC-96/2021偶联物保持免疫原性。
G.MenW-96/2021偶联物的免疫原性
从给予以下的小鼠中合并收集第二次免疫后的血清：a)与CRM197或 96/2021偶联的MenW寡糖；b)MenA-、C-、W-和Y-96/2021的组合，含或 不含铝。通过ELISA测试这些收集组的抗血清组W抗体效价。
图12显示了合并的血清的结果。MenW-96/2021偶联物的免疫原性似乎 高于(不含铝)或相当于(含铝)MenW-CRM197偶联物。当与相应的MenC、 MenW135和MenY偶联物组合时，MenW-96/2021偶联物保持免疫原性。
H.MenY-96/2021偶联物的免疫原性
从给予以下的小鼠中合并收集第二次免疫后的血清：a)与CRM197或 96/2021偶联的MenY寡糖；b)MenA-、C-、W-和Y-96/2021的组合，含或不 含铝。通过ELISA测试这些收集组的抗血清组Y抗体效价。
如图13所示，MenY-96/2021偶联物的免疫原性似乎与MenY-CRM197 偶联物的免疫原性相当，并且当与相应的MenC、MenW135和MenY偶联物 组合时保持免疫原性。
I.对MenC-96/2021偶联物的T-细胞应答
比较了针对与CRM197、96/2021或spr1416偶联的MenC寡糖的T-细胞 应答。在这个实验中，在第0、14和28天用不同的免疫原(不含铝的1μg糖) 腹膜内免疫各组8只CD1小鼠。两组小鼠分别仅用PBS和未偶联的MenC寡 糖(1μg糖剂量)免疫，用作阴性对照。在最后一次免疫21天后，通过ELISA 测试来自各小鼠的血清的抗-多糖抗体。从各组中的3只小鼠中分离脾用于通 过在体外抗原特异性再刺激之后的胞内染色多色FACS分析T-细胞细胞因子 概况。
ELISA结果如图14所示。MenC-96/2021偶联物的免疫原性似乎高于或相 当于MenC-CRM197偶联物和MenC-spr1416偶联物的免疫原性。CRM197和 96/2021，但不是spr1416，诱导T细胞应答(图15)。
J.包括HAG的96/2021的制备
使用标准过程将编码SEQ ID NO：9的96/2021杂交体的核酸(在载体 pET21+或pET24+(Merck)中)转化到甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌菌株B834 (DE3)(Merck)和T7Express Crystal(NEB)的感受态细胞中。
为了产生包括HAG的蛋白，细胞被接种到限定的培养基中使得可以控制 甲硫氨酸的精确浓度。使用不含甲硫氨酸的AB4复合培养基或M9基线培养基 作为基本培养基，适当补充抗生素用于维持宿主和/或表达质粒。各培养基的组 成如下：
不含甲硫氨酸的AB4：
AB4基本2x：丙氨酸1g/L、精氨酸0.858g/L、天冬酰胺0.65g/L、天冬 氨酸0.656g/L、半胱氨酸0.202g/L、谷氨酰胺0.806g/L、谷氨酸0.812g/L、 甘氨酸1.036g/L、组氨酸0.26g/L、异亮氨酸0.594g/L、亮氨酸1.176g/L、赖 氨酸0.806g/L、苯丙氨酸0.554g/L、脯氨酸0.476g/L、丝氨酸4.108g/L、苏 氨酸0.622g/L、色氨酸0.222g/L、酪氨酸0.5g/L、缬氨酸0.83g/L、腺嘌呤 1g/L、鸟苷0.858g/L、胞嘧啶0.65g/L、尿嘧啶0.656g/L、水1000ml。
维生素混合物(Vit Mix)1000x：核黄素1g/L、烟酰胺1g/L、氯化吡多 醇(Piridoxinchloride)1g/L、硫胺素Thiamine1g/L、水1000ml。
微量元素2000x：FeSO4.7H2O5.6g/L、MnCl4.4H2O4.0g/L、CoCl2.6H2O 5.6g/L、CaCl2.2H2O3.0g/L、CuSO40.4g/L、ZnSO4.7H2O0.6g/L、水1000ml。
葡萄糖(25％)：葡萄糖250g/L，水1000ml。
最终AB4培养基(1x)：AB4base2.0x500ml、水386.5ml、PBS20x100 ml、维生素混合物1ml、微量元素0.5ml、葡萄糖(25％)12ml。
M9：
溶液I：葡萄糖200g/L、MgSO4.7H2O4.9g/L、CaCl2.2H2O0.28g/L、 水1000ml。
溶液II(pH7.4)：K2HPO4 70g/L、KH2PO4 30g/L、NaCl5g/L、(NH4)2SO46g/L、水1000ml。
为了制备最终培养基，以85∶5∶10(H2O：溶液I：溶液II)的比率混合溶液 I/II。
携带96/2021表达载体的B834(DE3)或T7express crystal菌株接种在补 充甲硫氨酸至0.176g/L的AB4或M9基本培养基中。细胞在25℃下180rpm 摇晃下生长至达到1.6的OD600，如DU530分光光度计(贝克曼公司 (Beckman))所测。在这个时间点上通过在4℃下10000g下离心30分钟压 制细胞并且在不含甲硫氨酸的新鲜基本培养基中洗涤2次，来从细胞团块中去 除甲硫氨酸。在这之后，重悬团块并接种到新鲜的基本培养基中，这次用HAG 补充至与在初始生长阶段存在的甲硫氨酸相同的浓度(不向该培养基中加入甲 硫氨酸)。用IPTG补充培养基至1mM以诱导96/2021杂交蛋白的表达并且 在25℃下在180rpm摇晃下另外孵育3-6小时。
裂解所得的细胞并且用IMAC柱纯化蛋白，通过透析去除任意残留的咪 唑。然后通过质谱测量纯化的蛋白的质量(参见图16)，并且确定具有大约对 应于SEQ ID NO：20的蛋白的预测重量的质量(例如，SEQ ID NO：9中各甲硫 氨酸已经被取代为L-高烯丙基甘氨酸)。这表示蛋白在HAG存在下的表达并 且在96/2021的表达期间缺少甲硫氨酸导致HAG取代甲硫氨酸的位置。
免疫研究(1)
总试验方案：通过按照下述的方案的皮下注射来免疫Balb/c小鼠。注射体 积为200μl并且注射含有磷酸铝佐剂。
MenCWY＝按照参考文献320制备的MenC-、W-和Y-CRM197的组合。
该偶联物具有以下性质：
第三次免疫后针对血清组A荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组A菌 株F8238的血清细菌抗体效价示于图17。血清组A偶联物是免疫原性的并且 诱导细菌抗体。当任意CRM197偶联物与其他衍生自血清组C、W135和Y的 CRM197偶联物组合时，应答轻微降低，但是仍然明显高于对照。相反，当 MenA-96/2021偶联物与这些偶联物组合时，几乎没有或没有看到减少。因此， 使用96/2021作为运载体可能有助于减少血清组A偶联物和这些偶联物之间的 任意免疫干扰。
第三次免疫后针对血清组C、W135和Y荚膜多糖的IgG抗体效价和针对 来自这些血清组的某些菌株的血清细菌抗体效价示于图18。使用96/2021作为 运载体并不影响针对这些其他多糖的免疫应答。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之 进行修改。
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