技术领域
本发明涉及一种复合纳米材料。具体地，本发明提供了一种可实现恶性肿 瘤的治疗或诊断，特别是光热与化学药物协同的肿瘤治疗的复合纳米材料，及 其制备方法。
背景技术
光热治疗(Photothermal Therapy,PTT)是一种新的肿瘤治疗模式。其基 本原理是将光热试剂积累在肿瘤部位，通过局部近红外激光照射，光热试剂将 光能转换为热能，通过高温将肿瘤杀死。该方法具有高选择性与微创性，且可 以避免传统肿瘤治疗方法所带来的副作用，因此是肿瘤治疗的热点研究领域。 基于肿瘤光热治疗的原理，寻找生物相容性好、近红外吸收强、光热转化效率 高、热稳定性好的光热治疗材料是肿瘤光热治疗的重点研究方向，而发展多功 能、多模式肿瘤光热治疗材料则是该领域的发展趋势。光热治疗是一种非侵入 式肿瘤局部治疗技术，借助医学成像手段，对肿瘤进行精确的成像定位，是光 热有效治疗肿瘤的重要因素之一。因此，发展一种具有增强肿瘤组织医学成像 信号功能的光热治疗材料，提高肿瘤部位的成像灵敏度，必然能够提高光热治 疗恶性肿瘤的效果。此外，以光热治疗材料为载体，搭载抗肿瘤化疗药物形成 的多模式治疗试剂，不仅能够实现化疗药物的靶向递送与光控释放、降低药物 副作用，而且由于热消融作用，肿瘤细胞对化疗药物愈加敏感，表现出化疗与 光热治疗的协同增敏效应，克服了近红外光穿透深度有限而造成的肿瘤消融不 完全，从而极大地提高恶性肿瘤的治疗效果。
因此，本领域迫切需要一种在生物环境下稳定性好，不易团聚，具有生物 应用价值的光热治疗材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种在生物环境下稳定性好，不易团聚，具有生物应 用价值的光热治疗材料。
本发明的第一方面，提供了一种复合纳米材料，所述的复合纳米材料包括核 心材料A-稳定剂B复合物：其中，
所述的核心材料A为氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料，或氢化处理 的金属氧化物半导体纳米材料和选自下组的材料进行复合形成的复合材料：磁 性纳米材料、上转换发光纳米材料、贵金属纳米材料、量子点、荧光材料，或 其组合；
所述的稳定剂B选自下组：有机高分子聚合物、脂质体、微泡、白蛋白纳 米球，或其组合，其中，所述的有机高分子聚合物的聚合单体选自下组：C2-C10 的不饱和醇、酸或胺、C2-C12的多羟基化合物、乳酸、羟基乙酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的复合为物理负载和/或化学修饰。
在另一优选例中，所述的稳定剂B基本包覆核心材料A，或所述的稳定剂 B包埋核心材料A。
在另一优选例中，所述稳定剂B含有用于进行进一步修饰或反应的官能团。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料粒径为5-50nm，较佳地为10-40nm。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料的平均水合粒径为10-500nm，较佳 地为50-200nm。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料在水溶液或生理溶液(如磷酸盐缓冲 液、血清、生理盐水)中稳定，其中，所述的稳定指所述的复合纳米材料在水溶 液中不发生明显的团聚。
在另一优选例中，所述的“不发生明显的团聚”指所述的复合纳米材料在 水溶液中不发生透射电镜可检测到的团聚。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料在水溶液或生理溶液(如磷酸盐缓冲 液、血清、生理盐水)中的平均水合粒径为≤1μm，较佳地为≤500nm，更佳地 为≤300nm。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料在可见光与近红外区具有光吸收。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料能够将吸收的光能转换为热能；较 佳地，所述的复合纳米材料的光热转换效率为≥20％，较佳地为≥30％，更佳 地为≥35％。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料具有低的细胞毒性。
在另一优选例中，在浓度为≥200μg/mL，较佳地为≥300μg/mL，更佳地为≥ 500μg/mL的情况下，所述的复合纳米材料对细胞活性没有明显抑制。
在另一优选例中，所述的“没有明显抑制”指抑制率为≤20％，较佳地为≤15％。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料具有较好的生物相容性。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料具有以下特征：对生物体进行静脉给药 24小时后，对该生物体器官功能和/或身体指标无明显影响。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料还包括：与核心材料A-稳定剂B复 合物偶联的肿瘤靶向分子C。
在另一优选例中，所述的复合纳米材料还包括：负载于核心材料A-稳定剂 B复合物的活性药物成分D。
在另一优选例中，
所述氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料选自下组：氢化的TiO2纳米材 料、氢化的ZrO2纳米材料、氢化的ZnO纳米材料，或其组合；和/或
所述磁性纳米材料选自下组：Fe3O4纳米材料、CoFe2O4纳米材料、ZnFe2O4纳米材料、NiFe2O4纳米材料、MnFe2O4纳米材料、Gd2O3纳米材料，或其组合； 和/或
所述上转换发光纳米材料选自下组：NaYF4:Er3+/Yb3+纳米材料、NaYF4:Yb 3+/Tm3+纳米材料、NaYF4:Tm3+/Er3+纳米材料、NaYF4:Yb3+/Tm3+/Er3+、NaGdF4: Yb3+/Tm3+/Er3+纳米材料，或其组合；和/或
所述贵金属纳米材料选自下组：Au纳米材料、Ag纳米材料、Pt纳米材料、 Pd纳米材料，或其组合；和/或
所述量子点选自下组：量子点CdSe、CdS、CdTe、ZnS、ZnSe，或其组合； 和/或
所述荧光材料选自下组：有机荧光染料分子(如茜素红、罗丹明、吲哚菁绿、 花青素Cy5.5、Cy7)、无机荧光介孔材料、贵金属荧光纳米材料(如小粒径金、 小粒径银)，或其组合。
在另一优选例中，所述的稳定剂B选自下组：聚乙二醇、聚丙烯酸、葡聚 糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、聚马来酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基 葡聚糖、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、脂质体、白蛋白纳米球，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤靶向分子C选自下组：叶酸、氨甲蝶呤、氨 基蝶呤、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经 多肽(NPY)、肿瘤特异性抗体，或其组合。
在另一优选例中，所述活性药物成分D选自下组：阿霉素、紫杉醇中的一 种或多种。
本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的复合纳米材料的 制备方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料A；
(2)用所述的氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料A与稳定剂B反应，得 到核心材料A-稳定剂B复合物。
在另一优选例中，所述的制备方法还包括步骤：用所述的核心材料A-稳定 剂B复合物与肿瘤靶向分子C进行偶联反应，得到核心材料A-稳定剂B-肿瘤靶向 分子C复合物。
在另一优选例中，所述的制备方法还包括步骤：用所述的核心材料A-稳定 剂B复合物与活性药物成分D进行负载，得到核心材料A-稳定剂B-活性药物成分 D复合物。
在另一优选例中，所述的制备方法还包括步骤：用所述的核心材料A-稳定 剂B肿瘤靶向分子C复合物与活性药物成分D进行偶联反应，得到核心材料A-稳 定剂B-肿瘤靶向分子C-活性药物成分D复合物。
本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的复合纳米材料的 用途，所述材料用于：
(a)制备肿瘤光热治疗药物组合物；
(b)用于制备肿瘤成像造影剂；
(c)用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞活性；
(d)用于体外非治疗性地诱导肿瘤细胞凋亡。
在另一优选例中，当用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞活性时，将所述的 复合纳米材料施用于待抑制的肿瘤细胞后，对所述待抑制的肿瘤细胞进行红外 光照射。
在另一优选例中，当用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞活性时，所述复合纳 米材料的作用时间为2～96h，较佳地为5-48h。
在另一优选例中，当用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞活性时，所述复合纳 米材料的作用浓度为20-500μg/mL，较佳地为50-300μg/mL。
本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括治疗 有效量的如本发明第一方面所述的复合纳米材料；和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤；较佳地，所述的治疗 是光热治疗或光热/药物协同治疗。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂；较佳地，所述的药物注射 剂为静脉注射剂。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体是生理盐水。
在另一优选例中，所述的肿瘤为肝脏肿瘤或脾脏肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤为乳腺肿瘤。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他肿瘤治疗药物；较佳地，所 述的其他肿瘤治疗药物选自下组：阿霉素、紫杉醇。
在另一优选例中，当所述的药物组合物包括其他肿瘤治疗药物时，所述的 其他肿瘤治疗药物在酸性环境下释放；较佳地，在pH＝1-6的酸性环境下释放。
在另一优选例中，在pH＝1-6的酸性环境下，所述的其他肿瘤治疗药物的48 小时释放量为≥60，较佳地为≥70％，更佳地为≥80％。
本发明的第五方面，提供了一种肿瘤治疗方法，所述方法包括：对治疗对 象施用治疗有效量的如本发明第一方面所述的复合纳米材料。
在另一优选例中，所述方法还包括：对治疗对象的肿瘤部位进行红外光照 射。
在另一优选例中，所述方法还包括：对治疗对象施用其他肿瘤治疗药物； 较佳地，所述的其他肿瘤治疗药物选自下组：阿霉素、紫杉醇。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是实施例1、2所制备的黑TiO2、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳 米材料的透射电镜结果(实施例19)。
图2是实施例1、2所制备的黑TiO2、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA在水中 的动态光散射水合粒径分布。
图3是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料以 及白TiO2的紫外-可见吸收光谱(实施例19)。
图4是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料及 其中间体黑TiO2-PEG-NH2的Zeta电势(实施例19)。
图5是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料在 808nm、2W/cm2的近红外光照射下的升温曲线(实施例19)。
图6是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料对 人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性(实施例20)。
图7是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料在 808nm、2W/cm2的近红外光照射下，对人乳腺癌细胞MCF-7的光热治疗效果(实 施例21，MTT结果)。
图8是实施例1制备的黑TiO2-PEG复合纳米材料在808nm、2W/cm2的近红 外光照射下，对人乳腺癌细胞MCF-7的光热治疗效果(实施例21，钙黄绿素/碘 化丙啶染色)。
图9是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料对 健康小鼠肝、肾相关的血清生化指标的影响(实施例22)。
图10是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料 经尾静脉注射人乳腺癌细胞荷瘤小鼠后，在其心、肝、脾、肾、肺以及肿瘤内 的分布情况(实施例23)。
图11是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料在 808nm、2W/cm2的近红外光照射下，对人乳腺癌细胞荷瘤小鼠的光热治疗效果(实 施例23)。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，在现有的产能材料(光催化 降解水产氢领域)经过氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料表面，用稳定剂进 行修饰，居然能够得到一种新颖的肿瘤光热治疗药物(或材料)。所述药物(或材 料)的生物利用度高，且在水中的稳定性与分散性非常好，适合应用于肿瘤光热 治疗领域，制成肿瘤治疗药物或辅助治疗药物。基于上述发现，发明人完成了 本发明。
术语
如本文所用，术语“复合”指两种材料以任意本领域已知的方法进行结合， 例如物理负载(或搭载)，或者化学偶联等形式。
术语“核心材料A-稳定剂B复合材料”、“核心材料-稳定剂复合材料”或 “A-B复合材料”可以互换使用，均指具有稳定剂(B)修饰的核心材料(A)。其中， 核心材料如本文所定义。在优选的情况下，上述术语指不带有其他复合材料(例 如本发明的肿瘤靶向分子及活性药物成分)的核心材料-稳定剂复合材料。
术语“C2-C10的不饱和醇、酸或胺”指具有2-10个碳原子，且结构中存在 C-C双键的醇、酸或胺类，如丙烯酸、乙烯亚胺、乙烯胺、马来酸，或类似化 合物。
术语“C2-C12的多羟基化合物”指具有2-12个碳原子，且结构中存在一个 以上羟基的化合物，如乙二醇、丙三醇、糖类等。
经过广泛的文献调研，本发明提出以氢化处理的金属氧化物半导体纳米材 料为核心材料、或复合具有增强医学成像信号功能的纳米材料、搭载肿瘤化疗 药物，形成复合纳米材料，用于恶性肿瘤的光热治疗或光热与化学药物协同治 疗。此外，本发明所制备的复合纳米材料还可用于恶性肿瘤的诊断与可视化治 疗。
核心材料
氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料(Scientific Reports2014, doi:10.1038/srep03986.)，如经过高温、高压氢化处理的黑色TiO2纳米粒子 (Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,12410-12412.；Science2011,331, 746-750.)，与传统的白色TiO2纳米材料相比，其材料表面无序、内部具有大量 氧缺陷、在近红外区域具有强烈的吸收、光热转化效率优异，具有待进一步开 发成肿瘤光热治疗材料的潜力。然而，氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料 在生理盐水等仿生环境中极易发生团聚，这阻碍了其在肿瘤治疗中的应用。
本发明的复合材料包括核心材料A和稳定剂B，其中，所述的核心材料A是 经过氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料，或含有经过氢化处理的金属氧化 物半导体纳米材料的复合材料。
与传统的白色TiO2纳米材料相比，经过氢化处理的金属氧化物半导体纳米 材料表面无序、内部具有大量氧缺陷、在近红外区域具有强烈的吸收、光热转 化效率优异，具有待进一步开发的潜力。然而，氢化处理的金属氧化物半导体 纳米材料的生物应用性能较差，这阻碍了其在肿瘤治疗中的应用。
在另一优选例中，所述氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料选自下组： 氢化的TiO2纳米材料(即黑TiO2)、氢化的ZrO2纳米材料(即黑ZrO2)、氢化的 ZnO纳米材料(即黑ZnO)，或其组合。
在本发明中，所述的经过氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料可与其他 的纳米材料进行复合，组成含有经过氢化处理的金属氧化物半导体纳米材料的 复合材料。其中，优选的进行复合的纳米材料选自下组：磁性纳米材料、上转 换发光纳米材料、贵金属纳米材料、量子点、荧光材料，或其组合。
在本发明的优选例中，所述磁性纳米材料选自下组：Fe3O4纳米材料、 CoFe2O4纳米材料、ZnFe2O4纳米材料、NiFe2O4纳米材料、MnFe2O4纳米材料、 Gd2O3纳米材料，或其组合。
在本发明的优选例中，所述上转换发光纳米材料选自下组：NaYF4:Er3+/Yb3+纳米材料、NaYF4:Yb3+/Tm3+纳米材料、NaYF4:Tm3+/Er3+纳米材料、NaYF4:Yb 3+/Tm3+/Er3+、NaGdF4:Yb3+/Tm3+/Er3+纳米材料，或其组合。
在本发明的优选例中，所述贵金属纳米材料选自下组：Au纳米材料、Ag 纳米材料、Pt纳米材料、Pd纳米材料，或其组合。
在本发明的优选例中，所述量子点选自下组：量子点CdSe、CdS、CdTe、 ZnS、ZnSe，或其组合。
在本发明的优选例中，所述荧光材料选自下组：有机荧光染料分子(如茜素 红、罗丹明、吲哚菁绿(ICG)、花青素Cy5.5、Cy7)、无机荧光介孔材料、贵金 属荧光纳米材料(如小粒径金、小粒径银)，或其组合。
稳定剂
本发明中，用稳定剂B对核心材料A进行修饰，以改善其生物应用性能。
所述的稳定剂B可以是选自下组的稳定剂：有机高分子聚合物、脂质体、 微泡、白蛋白纳米球，或其组合，优选为上述四种中的一种。
其中，所述的有机高分子聚合物的聚合单体选自下组：C2-C10的不饱和醇、 酸或胺、C2-C12的多羟基化合物、乳酸、羟基乙酸，或其组合，优选的所述有 机高分子聚合物可以是聚乙二醇、聚丙烯酸、葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯胺、 聚马来酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖中的一种或多种。
其中，所述的微泡指微米级球状空心结构。在本发明的优选例中，所述微 泡的壳体材料可以是聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸中的一种或多种。
肿瘤靶向分子及活性药物成分
本发明中，核心材料A-稳定剂B复合材料可以任选地和其他肿瘤治疗相关 的材料，例如肿瘤靶向分子，或者活性药物成分进行复合，以改善其靶向性或 疗效。其中，所述的复合形式没有特别限制，可以是物理负载(或搭载)，或者 化学偶联等形式。
在本发明中，所述的肿瘤靶向分子没有特别的限制，可以为任意本领域已 知的具有肿瘤靶向性，且可以偶联于A-B的分子。在一个优选例中，所述的肿 瘤靶向分子C选自下组：叶酸、氨甲蝶呤、氨基蝶呤、RGD肽(精氨酰-甘氨酰 -天冬氨酸)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经多肽(NPY)、肿瘤特异性抗体， 或其组合。
所述的活性药物成分没有特别限制，可以为任意本领域已知的能够用于肿 瘤治疗，或者辅助肿瘤治疗的药物。在本发明的一个优选例中，所述的活性药 物成分D选自下组：阿霉素、紫杉醇中的一种或多种。
肿瘤光热治疗药物组合物
光热治疗(Photothermal Therapy,PTT)是一种新的肿瘤治疗模式。其基 本原理是将光热试剂积累在肿瘤部位，通过局部近红外激光照射，光热试剂将 光能转换为热能，通过高温将肿瘤杀死。借助医学成像手段，对肿瘤进行精确 的成像定位，是光热有效治疗肿瘤的重要因素之一。因此，发展一种具有增强 肿瘤组织医学成像信号功能的光热治疗材料，提高肿瘤部位的成像灵敏度，必 然能够提高光热治疗恶性肿瘤的效果。
基于此，本发明提供了一种肿瘤光热治疗药物组合物。所述的组合物包括 治疗有效量的本发明复合材料，即核心材料A-稳定剂B复合材料，或核心材料 A-稳定剂B与肿瘤靶向分子C和/或活性药物成分D复合形成的复合材料。
所述的用稳定剂B修饰的复合材料具有一系列适合进行生物应用的特性， 例如，具有稳定剂B修饰的核心材料A-稳定剂B复合材料在水中具有较好的稳定 性；在可见光与近红外区有光吸收，且具有很高的光热转换效率，因而适用于肿瘤 光热治疗；细胞毒性低，生物相容性好，等等。
较佳地，所述的复合材料还包括药学上可接受的载体。所述的药学上可接 受的载体包括：注射剂载体，如蒸馏水，生理盐水，丙三醇等。
本发明的主要有益效果包括：
(1)本发明提供了一种治疗恶性肿瘤的复合纳米材的制备方法，该方法简 单易行，成本低廉，利于工业化生产和市场推广。
(2)将本发明提供的复合纳米材料给予肿瘤部位，可实现近红外光激发的 肿瘤光热治疗，还可以实现近红外光激发的光热与化疗药物协同治疗肿瘤。
(3)本发明提供的复合纳米材料，能够增强磁共振成像、超声成像、光声 成像、荧光成像等医学造影信号，可以用于恶性肿瘤的诊断与可视化治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。
实施例1：黑TiO2-PEG复合纳米材料的制备
取0.2mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解5小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每两小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，240℃加热10小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取上述制备 的TiO2纳米粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，设定如下反应条件：压力 20.0bar、温度200℃、氢化时间5天。反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米粒 子。取黑TiO2纳米粒子100mg分散于200mL乙醇中，200W超声波分散30分 钟。取聚乙二醇(PEG，分子量为2000)7500mg，溶于300mL乙醇中。将含有黑 TiO2纳米材料的乙醇逐滴加入到PEG乙醇溶液中，搅拌反应24小时，使PEG 充分包裹于黑TiO2纳米材料表面。反应结束后，12000转/分钟离心30分钟， 去除上清液中多余的PEG，获得黑TiO2-PEG复合纳米材料。
实施例2：黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料的制备
取实施例1制备的黑TiO2-PEG复合纳米材料50mg，分散于100mL乙醇 中。取3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)600μL，溶于200mL乙醇中。将APTES 的乙醇溶液逐滴加入到含黑TiO2-PEG复合纳米材料的乙醇中，搅拌反应24小 时，使黑TiO2-PEG复合纳米材料表面的PEG末端修饰上氨基。反应结束后， 12000转/分钟离心30分钟，去除上清液中多余的反应副产物，获得黑 TiO2-PEG-NH2复合纳米材料中间体，并将其分散于100mL纯水中。取20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，加入到100mL的0.1mg/mL叶酸 (FA)溶液中活化叶酸的羧基，迅速将EDC与FA的混合溶液加入到含黑 TiO2-PEG-NH2复合纳米材料的纯水中，搅拌反应24小时。反应结束后，12000 转/分钟离心30分钟，去除上清液中多余的副产物，获得黑TiO2-PEG-FA复合 纳米材料。
实施例3：黑TiO2-PEG-DOX复合纳米材料的制备
取实施例1制备的黑TiO2-PEG复合纳米材料50mg，分散于250mL纯水， 高温灭菌后待用。取4mg抗肿瘤药物阿霉素(DOX)，溶于250mL纯水中，0.22μm 滤膜过滤除菌。在无菌条件下，将DOX溶液逐滴加入到经高温灭菌后的黑 TiO2-PEG复合纳米材料分散液中，搅拌反应24小时。反应结束后，10000转/ 分钟离心30分钟，去除上清液中多余的DOX，获得黑TiO2-PEG-DOX复合纳 米材料。
实施例4：黑TiO2-PEG-FA-DOX复合纳米材料的制备
取实施例2制备的黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料100mg，分散于200mL 纯水。取5mg DOX，溶于200mL纯水中。将DOX溶液逐滴加入到黑 TiO2-PEG-FA复合纳米材料分散液中，搅拌反应18小时。反应结束后，10000 转/分钟离心30分钟，去除上清液中多余的DOX，获得黑TiO2-PEG-FA-DOX 复合纳米材料。
实施例5：氢化ZrO2-PAA复合纳米材料的制备
取6mL锆酸四丁酯溶于40mL异丙醇中，得到溶于A。取2mL超纯水、 2mL浓硝酸溶于40mL异丙醇中，得到溶液B。将A溶液逐滴加入到B溶液中， 搅拌1小时后将反应液置于反应釜中，180℃反应24小时。反应结束后，60℃ 将反应物加热烘干，获得ZrO2前驱体。将ZrO2前驱体研磨成粉末后，在600℃ 下煅烧5小时，获得ZrO2纳米粒子。取上述ZrO2纳米粒子粉末，置于高压氢 气系统，压力20.0bar、温度220℃下氢化5天，获得氢化ZrO2纳米粒子。取上 述制备的氢化ZrO2纳米粒子50mg，分散于200mL乙醇中，超声波分散0.5小 时。取聚丙烯酸(PAA,分子量为2000)2000mg，溶于300mL乙醇中。将含有氢 化ZrO2纳米材料的乙醇逐滴加入到PAA乙醇溶液中，搅拌反应24小时，使 PAA充分包裹于氢化ZrO2纳米材料表面。反应结束后，12000转/分钟离心30 分钟，去除上清液中多余的PAA，获得氢化ZrO2-PAA复合纳米材料。
实施例6：氢化ZnO-PEI复合纳米材料的制备
取2mol/L的碳酸钠溶液(Na2CO3)20mL，搅拌加热至80℃。取1mol/L的硫 酸锌(ZnSO4)溶液10mL，逐滴加入到Na2CO3溶液中，搅拌反应1小时后，冷 却抽滤。将反应物在80℃下烘干后，置于反应釜中400℃反应3小时后，获得 ZnO纳米粒子粉末。取上述ZnO纳米粒子，置于高压氢气系统，压力20.0bar、 温度200℃下氢化4天，获得氢化ZnO纳米粒子。取上述氢化ZnO纳米粒子 20mg，分散于200mL乙醇中，超声波分散0.5小时。取聚乙烯亚胺(PEI,分子 量为5000)400mg，溶于100mL乙醇中。将含有氢化ZnO纳米材料的乙醇逐滴 加入到PEI乙醇溶液中，搅拌反应24小时，使PEI充分包裹于氢化ZnO纳米 材料表面。反应结束后，12000转/分钟离心30分钟，去除上清液中多余的PEI， 获得氢化ZnO-PEI复合纳米材料。
实施例7：黑TiO2-Fe3O4-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解4小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每3小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，180℃加热12小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末100mg，置于高压氢气系统，压力22.0bar、温度220℃、氢化3天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取黑TiO2纳米材料100mg，分散 于200mL乙醇中，超声分撒0.5小时后，逐滴加入到100mL正己烷中，搅拌 均匀。将200mg乙酰丙酮铁[Fe(acac)3]溶于40mL油胺和120mL正辛醇的混合 溶液中。将黑TiO2分散液加入到上述混合溶液中、搅拌，加热到80℃，使乙 醇与正己烷蒸发。之后将上述溶液置于反应釜中，240℃反应2小时。反应结 束后离心去除油胺和正辛醇，并用乙醇清洗多次，获得黑TiO2-Fe3O4复合纳米 材料。将上述黑TiO2-Fe3O4复合纳米材料分散于200mL乙醇中，超声波分散 30分钟。取PEG(分子量为1500)5000mg，溶于300mL乙醇中。将含有黑 TiO2-Fe3O4复合纳米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中，搅拌反应 18小时，使PEG充分包裹于黑TiO2-Fe3O4复合纳米材料表面。反应结束后， 12000转/分钟离心30分钟，除去上清液中多余的PEG，获得黑TiO2-Fe3O4-PEG 复合纳米材料。
实施例8：黑TiO2-Gd2O3-PEG复合纳米材料的制备
取六水硝酸钆[Gd(NO3)3·6H2O]100mg、氢氧化钠1mg溶于200mL一缩 二乙二醇中，180℃下磁力搅拌反应5小时，将反应液进行透析后获得透析液。 取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液7mL，缓慢滴加于93mL超纯水中，冰 浴条件下搅拌、水解3小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于超纯水 中透析，每3小时换一次新水，共换水4次，获得TiO2前驱体溶液。将TiO2前驱体置于反应釜中，180℃加热10小时，得到TiO2纳米粒子。TiO2纳米粒子 经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米粒子粉末100mg， 置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化5天。反应结束后，获得 氢化的黑TiO2纳米材料。取黑TiO2纳米材料100mg，分散于200mL乙醇中， 超声分撒30分钟后，逐滴加入上述六水硝酸钆透析液，搅拌；反应8小时后， 室温陈化24小时；12000转/分钟离心30分钟，去除多余反应物，得到黑 TiO2-Gd2O3复合纳米材料。将黑TiO2-Gd2O3复合纳米材料分散于200mL乙醇 中，超声处理30分钟，取PEG(分子量为1500)4000mg，溶于300mL乙醇中。 将含有黑TiO2-Gd2O3复合纳米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中， 搅拌反应24小时，使PEG充分包裹于黑TiO2-Gd2O3复合纳米材料表面。反应 结束后，12000转/分钟离心30分钟，除去上清液中多余的PEG，获得黑 TiO2-Gd2O3-PEG复合纳米材料。
实施例9：黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG复合纳米材料的制备
取0.2mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解5小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每3小时换一次新水，共换水4次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，180℃加热10小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末100mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化3天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取黑TiO2纳米材料50mg分散到 100mL的水中，超声波分散30分钟。然后依次加入20mg/mL的氯化钇(YCl3) 8.9mL、氯化镱(YbCl3)1mL、氯化铥(TmCl3)0.1mL。再加入20mg/mL的柠檬 酸钠水溶液10mL和10mg/mL的氟化钠(NaF)水溶液40mL，并搅拌1小时。之 后将混合溶液放入反应釜，在120℃下，水热反应2小时。反应结束后，将产 物离心水洗数次，获得黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+复合纳米材料。将制备的黑 TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+复合纳米材料50mg，分散于100mL乙醇中。取PEG(分 子量为1500)2000mg，溶于300mL乙醇中。将含有黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+复合纳米材料的乙醇分散液逐滴加入到PEG乙醇溶液中，搅拌反应24小时， 使PEG充分包裹于黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+复合纳米材料表面。反应结束后， 12000转/分钟离心30分钟，除去多余的PEG，获得黑 TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG复合纳米材料。
实施例10：黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF复合纳米材料的制备
取实施例9制备的黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG复合纳米材料10mg，分 散于100mL乙醇中。取3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)50μL，溶于100mL 乙醇中。将APTES的乙醇溶液逐滴加入到含黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG复 合纳米材料的乙醇中，搅拌反应24小时，使黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG复 合纳米材料表面的PEG末端修饰上氨基。反应结束后，13000转/分钟离心30 分钟，去除多余的3-氨丙基三乙氧基硅烷，收集制备的黑 TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-NH2复合纳米材料，并将其分散于100mL纯水中。 取经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化的0.1mg/mL血管内皮生长 因子(VEGF)溶液1mL加入到含黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-NH2复合纳米材 料的纯水中，搅拌反应18小时。反应结束后，12000转/分钟离心30分钟，去 除多余的VEGF，获得黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF复合纳米材料。
实施例11：黑TiO2-Au-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液5mL，缓慢滴加于95mL超纯水中， 冰浴条件下搅拌、水解3小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于超纯 水中透析，每2小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，180℃加热10小时，得到TiO2纳米粒子。 TiO2纳米粒子经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米粒子 粉末100mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化3天。反应 结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取黑TiO2纳米材料50mg，分散于100mL 乙醇中，超声波分散30分钟。将上述溶液加入到100mL葡萄糖(10mmol/mL) 水溶液中搅拌，使葡萄糖吸附在黑TiO2粒子表面。然后再加入1mL浓度为 1mmol/mL氯金酸(AuCl4)溶液、10mg柠檬酸钠并加热搅拌16小时，获得黑 TiO2-Au复合纳米材料。将上述获得的黑TiO2-Au复合纳米材料分散于100mL 纯水中，超声波分散30分钟。取PEG(分子量为1500)1000mg，溶于300mL纯 水中。将含有黑TiO2-Au纳米材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，搅拌反 应24小时，使PEG充分包裹于黑TiO2-Au复合纳米材料表面。反应结束后， 12000转/分钟离心30分钟，去除多余的PEG，获得黑TiO2-Au-PEG复合纳米 材料。
实施例12：黑TiO2-CdSe-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解3小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每2小时换一次新水，共换水4次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，180℃加热12小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化5天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取黑TiO2纳米材料50mg，分散于 100mL纯水中，超声波分散30分钟。然后用0.1mol/L的盐酸水溶液调节溶液 的pH值到3.0，加入100μL浓度为10mmol/L硒代硫酸钠(Na2SeSO3)水溶液， 再加入1mL浓度为5mmol/L的氯化镉(CdCl2)水溶液，搅拌反应24小时，通过 高速离心获得黑TiO2-CdSe复合纳米材料。将获得的黑TiO2-CdSe复合纳米材 料分散于300mL纯水中，超声波分散30分钟。取PEG(分子量为2000)2000mg， 溶于200mL纯水中。将含有黑TiO2-CdSe纳米材料的纯水逐滴加入到PEG水 溶液中，搅拌反应24小时，使PEG充分包裹于黑TiO2-CdSe复合纳米材料表 面。反应结束后，12000转/分钟离心30分钟，去除多余的PEG，获得黑 TiO2-CdSe-PEG复合纳米材料。
实施例13：黑TiO2-ICG-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解5小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每2小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，220℃加热12小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经60℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化5天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO2纳米材料50mg， 分散于90mL纯水中，超声波分散30分钟。然后加入0.1mg/mL的吲哚菁绿(ICG) 溶液10ml避光搅拌反应16小时。反应结束后，通过离心去除多余的ICG，获 得黑TiO2-ICG复合纳米材料。将上述复合纳米材料分散于100mL超纯水中。 取PEG(分子量为1500)1000mg，溶于200mL纯水中。将含有黑TiO2-ICG纳米 材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，避光搅拌反应24小时，使PEG充分 包裹于黑TiO2-ICG复合纳米材料表面。反应结束后，12000转/分钟离心30分 钟，去除多余的PEG，获得黑TiO2-ICG-PEG复合纳米材料。
实施例14：黑TiO2-荧光介孔硅-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解3小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每1小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，200℃加热10小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度200℃、氢化6天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO2纳米材料50mg， 溶于100mL乙醇中，超声分散30分钟后，加入100mL纯水并搅拌均匀，获得 溶液A。向溶液A中加入300mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、1mL氨水 (NH3·H2O)，40℃搅拌加热30分钟溶解CTAB。待CTAB溶解后，向反应液中 加入400μL正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌反应8小时，多次离心水洗后，得到黑 TiO2-介孔硅复合材料。取黑TiO2-介孔硅复合材料50mg分散到100mL的水中， 然后依次加入20mg/mL的氯化钇(YCl3)8.9mL、氯化镱(YbCl3)1mL、氯化铥 (TmCl3)0.1mL。再加入20mg/mL的柠檬酸钠水溶液10mL和20mg/mL的氟化 钠水溶液20mL，并搅拌1小时。之后将混合溶液放入反应釜，在130℃下， 进行水热反应2小时。反应结束后，将产物离心水洗数次，获得黑TiO2-荧光 介孔硅复合材料。将制备的黑TiO2/荧光介孔硅复合材料50mg，分散于200mL 水中。取PEG(分子量为2000)3000mg，溶于300mL水中。将含有黑TiO2/荧光 介孔硅复合材料的分散液逐滴加入到PEG水溶液中，搅拌反应24小时，使PEG 充分包裹于黑TiO2-荧光介孔硅复合材料表面。反应结束后，通过离心除去多 余的PEG，获得黑TiO2-荧光介孔硅-PEG复合纳米材料。
实施例15：黑TiO2-荧光Au-PEG复合纳米材料的制备
取0.2mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解6小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每1小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，240℃加热12小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度220℃、氢化3天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO2纳米粒子5mg， 分散于5mL超纯水中，超声分散30分钟。将5mL的4mg/mL氯金酸(HAuCl4)、 5mL的20mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液分别加入到搅拌状态下的黑TiO2纳 米粒子分散液中。37℃下，加入50μL的0.3mg/mL抗坏血酸溶液，使用氢氧化 钠溶液调节溶液pH至11，搅拌反应5小时，获得黑TiO2-荧光Au复合纳米簇。 将获得的黑TiO2-荧光Au复合纳米簇分散于50mL水中。取PEG(分子量为 2000)500mg，溶于200mL水中。将含有黑TiO2-荧光Au复合纳米簇的水溶液 逐滴加入到PEG水溶液中，搅拌反应24小时，使PEG充分包裹于黑TiO2-荧 光Au复合纳米簇表面。反应结束后，通过离心除去多余的PEG，获得黑TiO2- 荧光Au-PEG复合纳米材料。
实施例16：黑TiO2-脂质体-PEG复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液5mL，缓慢滴加于95mL超纯水中， 冰浴条件下搅拌、水解2小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于超纯 水中透析，每1小时换一次新水，共换水6次，获得TiO2前驱体溶液。取TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，200℃加热16小时，得到TiO2纳米粒子。 TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米粒子 粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度200℃、氢化4天。反应 结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO2纳米材料10mg、氢化 大豆磷脂40mg、胆固醇20mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000单甲氧 醚50mg，将上述材料分散于或溶于10mL氯仿-正己烷(1:1,体积比)中，超声 分散成乳后，经减压旋转蒸发至约2mL浓乳，获得A乳液。取氢化大豆磷脂 40mg、胆固醇20mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000单甲氧醚50mg， 溶于5mL氯仿-正己烷(1:1,体积比)，获得B乳液。将B乳液加入到A浓乳中， 混匀后，加入10mL赖氨酸缓冲液(0.02mol/L)，充分振荡后，乳液经减压蒸发 至不再产生气泡，吹氮气蒸发有机溶剂，室温超声5分钟，获得黑TiO2-脂质 体-PEG复合纳米材料。
实施例17：黑TiO2-BSA复合纳米材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液10mL，缓慢滴加于90mL超纯水 中，冰浴条件下搅拌、水解3小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于 超纯水中透析，每2小时换一次新水，共换水5次，获得TiO2前驱体溶液。取 TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，220℃加热10小时，得到TiO2纳米粒 子。TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米 粒子粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度200℃、氢化4天。 反应结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO2纳米材料50mg， 溶于100mL超纯水中，超声分散30分钟。取50mg牛血清白蛋白(BSA)，溶 于50mL pH为10的氯化钠溶液(0.8mg/mL)中。将黑TiO2分散液逐滴加入到 BSA溶液中，边加边搅拌，并逐滴加入5mL乙醇，再逐滴加入10％的戊二醛 溶液50μL，搅拌反应24小时，再加入50mg/mL的赖氨酸溶液1mL，搅拌2 小时。将反应溶液于超纯水中透析5次后，获得黑TiO2-BSA复合纳米材料。
实施例18：黑TiO2-PLA复合材料的制备
取0.1mol/L四氯化钛(TiCl4)的盐酸溶液5mL，缓慢滴加于95mL超纯水中， 冰浴条件下搅拌、水解4小时。水解结束后，将反应液置于透析袋中，于超纯 水中透析，每2小时换一次新水，共换水4次，获得TiO2前驱体溶液。取TiO2前驱体溶液100mL置于反应釜中，240℃加热12小时，得到TiO2纳米粒子。 TiO2纳米粒子经80℃高温烘干后，获得TiO2纳米粒子粉末。取TiO2纳米粒子 粉末50mg，置于高压氢气系统，压力20.0bar、温度200℃、氢化5天。反应 结束后，获得氢化的黑TiO2纳米材料。取制备的黑TiO25mg，加入到含有0.1g 聚乳酸(PLA)、0.05g司盘80(Span80)的2mL三氯甲烷中，超声处理1分钟得到 均匀的初乳。将上述初乳加入到20mL的聚乙烯醇溶液(30mg/mL)中，剧烈搅 拌6小时，获得微泡，待二氯甲烷挥发完全。将微泡离心水洗3次，重新分散 在纯水中，冷冻干燥后获得黑TiO2-PLA复合材料。
实施例19：复合纳米材料的表征
综合物理性能：取实施例1-18制备的复合纳米材料，通过透射电子显微镜 (TEM)、X射线衍射仪(XRD)、动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)、傅立叶变换 红外光谱仪(FT-IR)、紫外-可见分光光谱仪(UV-VIS)等仪器对复合纳米材料的 微观形貌、晶型、水合粒径、化学键、近红外吸收等进行表征。
以实施例1、2所制备的复合纳米材料的表征结果为例，实施例1、2所制 备的黑TiO2、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料的透射电镜结果如图1 所示，表征结果显示，制备的黑TiO2基复合纳米材料粒径在20nm左右，但是， 黑TiO2发生了明显的团聚，而黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料的分 散性良好。
实施例1、2所制备的黑TiO2、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料 的动态光散射水合粒径分布如图2所示，实验结果显示，黑TiO2在水中极易团 聚，团聚的平均水合粒径为3μm左右，而黑TiO2经过稳定剂PEG包裹后(黑 TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA)，在水中的稳定性得到显著的提高，其平均水合粒 径为200nm左右。
实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料以及白TiO2的紫外-可见吸收光谱结果如图3所示，表征结果显示，制备的黑TiO2基复合 纳米材料在可见光与近红外区具有明显的光吸收，具备了肿瘤光热治疗试剂的 基本特征。而同等浓度的白TiO2在近红外区的光吸收非常弱。
实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料及其中间 体黑TiO2-PEG-NH2的Zeta电势结果如图4所示，表征结果显示，在pH＝7的中 性水溶液中，黑TiO2-PEG表面带负电荷(-33.9)，经过APTES对其表面进行 氨基修饰后，黑TiO2-PEG-NH2表面带正电荷(7.16)，将叶酸偶联于黑 TiO2-PEG-NH2表面后，形成的黑TiO2-PEG-FA带负电荷(-20.77)，说明叶酸被 成功地偶联于复合纳米材料表面。
光热转换性能：取实施例1-18制备的复合纳米材料1mg、另取1mg白TiO2作为对照，分别分散于10mL纯水中。使用808nm激光器系统辐照含有复合纳 米材料的分散液10分钟，激光功率密度为2W/cm2。测量每分钟时间点的液体 温度，绘制升温曲线，计算材料的光热转换效率。以实施例1、2所制备的黑 TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料为例。实验结果如图5显示，复合纳 米材料具有优异的光热转换效率，能够将吸收的光能迅速转化为热能，其中黑 TiO2-PEG的光热转换效率达到了38％。该结果表明，制备的复合纳米材料具备 了肿瘤光热治疗纳米材料的基本特征。
生理条件下稳定性：取实施例1-18制备的复合纳米材料1mg，分别分散于 10mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)、10％胎牛血清(FBS)、0.9％生理盐水(NaCl) 中，在37℃恒温箱中放置30天，每天通过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS) 对复合纳米材料的粒径进行测量。实验结果显示，制备的复合纳米材料在PBS、 10％FBS、0.9％NaCl等溶液中粒径稳定保持在10-300nm之间。该结果表明， 制备的复合纳米材料在生理溶液中具有良好地稳定性与分散性，具备了体内注 射的基本条件。
pH控制的药物释放性能：取实施例3、4制备的黑TiO2-PEG-DOX、黑 TiO2-PEG-FA-DOX复合纳米材料10mg，分散于pH为3、5、7的缓冲液10mL 中，将上述缓冲液装入透析袋中，置于pH相同的90mL同种缓冲液中透析2 天，每隔2小时取1mL透析液(同时补足1mL新的缓冲液)，使用高效液相色谱 (HPLC)对透析液中的DOX进行定量分析，绘制药物释放曲线。实验结果显示， 在pH＝3的酸性环境下，DOX更容易释放，48小时的释放量为80％，而pH＝7 的中性环境下，DOX释放量为20％。该结果说明，制备的复合纳米材料具备了 肿瘤给药体系的基本特征，可用于抗肿瘤化疗药物的递送。
磁共振成像(MRI)性能：取实施例7、8制备的黑TiO2-Fe3O4-PEG、黑 TiO2-Gd2O3-PEG复合纳米材料，分散于超纯水中，配制成浓度为0.01mg/mL、 0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL的溶液各2mL。 通过核磁共振仪(NMR)表征复合纳米材料的T2或T1加权的MRI信号。实验 结果显示，制备的复合纳米材料具有良好的T2(黑TiO2-Fe3O4-PEG)或T1(黑 TiO2-Gd2O3-PEG)加权的MRI信号，可用于肿瘤的MRI诊断以及治疗效果评价。
电子计算机X射线断层扫描(CT)成像：性能取实施例11制备的黑 TiO2-Au-PEG复合纳米材料，分散于超纯水中，配制成浓度为0.01mg/mL、0.02 mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL的溶液各2mL。通过电子计算 机X射线断层扫描仪表征复合纳米材料的X-射线成像性能。实验结果显示， 制备的复合纳米材料具有良好的CT信号，可用于肿瘤的CT诊断以及治疗效 果评价。
荧光发光性能：取实施例9、10、12、13、14制备的黑TiO2-NaYF4: Yb3+/Tm3+-PEG、黑TiO2-NaYF4:Yb3+/Tm3+-PEG-VEGF、黑TiO2-CdSe-PEG、 黑TiO2-ICG-PEG、黑TiO2-荧光介孔硅-PEG复合纳米材料各1mg，分散于10mL 纯水中，配制成0.1mg/mL。通过荧光光谱仪测试上述复合纳米材料的荧光发光 性能。实验结果显示，上述复合纳米材料具有良好的荧光发光性能，可用于肿 瘤的诊断以及可视化治疗。
双光子发光性能：取实施例15制备的黑TiO2-荧光Au-PEG复合纳米材料 1mg分散于10mL超纯水中。通过双光子显微镜观察复合纳米材料的发光性能。 结果显示，制备的黑TiO2-荧光Au-PEG复合纳米材料具有良好的双光子激发荧 光性能，可用于肿瘤的诊断以及可视化治疗。
超声成像性能：取实施例18制备的黑TiO2-PLA复合材料2mg，分散于 20mL超纯水中。将复合材料注入琼脂糖模拟超声成像软管中，通过超声波成 像仪，检测复合材料的超声信号。实验结果显示，该复合材料具有良好的超声 信号，可用于肿瘤的诊断以及可视化治疗。
实施例20：复合纳米材料的细胞毒性
取实施例1-18制得的复合纳米材料，高温灭菌后，分散于培养液中，分别 配制成50、100、200、300、400、500μg/mL待用。取对数生长期的人乳腺癌 细胞MCF-7，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中， 每孔100μL，在5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时。24小 时后，弃掉培养板中的培养基，在培养板中分别加入新鲜培养液、含有复合纳 米材料的培养液，在5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育24小时。 24小时后，在培养孔中加入10μL噻唑蓝(MTT,5mg/mL)，孵育细胞4小时。4 小时后将培养液吸弃，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，溶解10分钟后， 于酶标仪上550nm测量每孔OD值，计算复合纳米材料的细胞毒性。以实施例 1、2所制备的复合纳米材料的表征结果为例，实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、 黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性如图6所示， 结果显示，浓度高达500μg/mL的复合纳米材料作用细胞24小时后，细胞活 性没有发生明显地降低，说明制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材 料细胞毒性低、生物相容性良好。
实施例21：复合纳米材料对肿瘤细胞的光热治疗
取实施例1-18制得的复合纳米材料，高温灭菌后，分散于培养液中，配制 成100μg/mL待用。取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7，调整细胞浓度为 1×105个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，在5％CO2、37℃、 饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时。24小时过后，弃掉培养孔板中的培养 基，在培养板中分别加入新鲜培养液、含有复合纳米材料的培养液，在5％CO2、 37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育4小时。弃去原液，加入培养液。使用808nm 激光器系统对细胞进行照射、激光功率密度为2W/cm2。照射结束后，取其中 一部分细胞，用钙黄绿素/溴化丙啶染色后，于荧光显微镜下观察；另一部分细 胞在5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中继续孵育24小时。24小时后， 在培养孔中加入10μL噻唑蓝(MTT,5mg/mL)，孵育细胞4小时。4小时后将培 养液吸弃，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，溶解10分钟后，于酶标仪上 550nm测量每孔OD值，计算复合纳米材料对乳腺癌细胞的光热治疗效果。
以实施例1、2所制备的复合纳米材料的表征结果为例，实施例1、2所制 备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料在808nm、2W/cm2的近红外光照 射下，对人乳腺癌细胞MCF-7的光热治疗效果的MTT结果如图7所示，结果显 示，100μg/mL复合纳米材料作用细胞4小时后、使用2W/cm2的808nm近红外 光照射细胞5分钟后，细胞继续培养24小时，被照射的肿瘤细胞全部死亡。
图8是实施例1制备的黑TiO2-PEG复合纳米材料在808nm、2W/cm2的近红 外光照射下，对人乳腺癌细胞MCF-7的光热治疗效果的钙黄绿素/溴化丙啶染色 结果。结果显示，100μg/mL黑TiO2-PEG作用细胞4小时后，使用2W/cm2的 808nm近红外光照射细胞5分钟，肿瘤细胞即发生大量死亡，死亡率可高达95％ 或更高。
实施例22：复合纳米材料的动物急性毒性
取实施例1-18制得的复合纳米材料分散于生理盐水中，配制成200μg/mL， 高温灭菌待用。取健康的小鼠，通过尾静脉给药100μL复合纳米材料以及生理 盐水。观察并记录动物在给药后24小时内的毒性症状及程度。24小时后，将 小鼠处死，测定肝、肾功能相关的血清生化指标、并对心、肝、脾、肾、肺等 主要脏器进行组织切片分析。
图9是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料对 健康小鼠肝、肾相关的血清生化指标的影响的实验结果。结果显示，制备的黑 TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料生物相容性良好，作用小鼠24小时后， 没有显著地影响小鼠肝、肾器官的功能。
实施例23：复合纳米材料对荷瘤小鼠实体瘤的光热治疗
取实施例1-18制得的复合纳米材料分散于生理盐水中，配制成200μg/mL， 高温灭菌待用。取MCF-7细胞荷瘤小鼠，给药200μL的复合纳米材料以及生 理盐水，用2W/cm2的808nm激光照射肿瘤部位。照射结束后，将一半小鼠处 死，对其肿瘤进行苏木精/伊红染色的组织切片分析，评价小鼠肿瘤损伤情况， 通过ICP-MS分析被处死小鼠的心、肝、脾、肾、肺以及肿瘤中钛元素的含量。 其余小鼠在两周内，每天测量肿瘤大小及体重，分析治疗效果。两周之后将所 有小鼠处死，解剖实体瘤，记录其体积、重量,评价复合纳米材料治疗小鼠实 体瘤的效果。
图10是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料 经尾静脉注射人乳腺癌细胞荷瘤小鼠后，在其心、肝、脾、肾、肺以及肿瘤内 的分布情况。结果显示，黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料主要分布 于肝、脾等器官，在肿瘤部位也有一定量的分布。
图11是实施例1、2所制备的黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料 在808nm、2W/cm2的近红外光照射下，对人乳腺癌细胞荷瘤小鼠的光热治疗效果。 结果显示，与对照组(生理盐水、激光、黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA等)相 比，黑TiO2-PEG、黑TiO2-PEG-FA复合纳米材料在808nm近红外光作用下的， 能够显著地引起肿瘤的消融，说明制备的复合纳米材料是一种优异的肿瘤光热 治疗试剂。
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