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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610439435.5 (22)申请日 2016.06.16 (71)申请人 青岛大学 地址 266071 山东省青岛市市南区宁夏路 308号 (72)发明人 王斌 鲁晓晴 李万通 王海涛 闫志勇 (74)专利代理机构 北京北新智诚知识产权代理 有限公司 11100 代理人 张晶 郭佩兰 (51)Int.Cl. A61K 36/756(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 一种含中草药的用于预防龋齿。
2、的药物组合 物 (57)摘要 本发明提供一种含中草药的用于预防龋齿 的药物组合物， 由黄柏， 大青叶按(0.9-1 .1): (0.9-1.1)的重量比组成。 本发明提供的药物组 合物可制成漱口液， 对于致龋菌乳酸杆菌、 变异 链球菌具有良好的抑制效果， 特别是二者配合比 单独使用具有更低的作用浓度， 说明二者配合具 有协同增效的效果。 本发明使用的原料提取自植 物， 不含任何化学添加剂， 对粘膜无刺激性、 无生 殖毒性、 对人体安全无毒。 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 105878511 A 2016.08.24 CN 105878511 A 1.一种含中草药的用于预防龋齿的药。
3、物组合物， 其特征在于， 由黄柏和大青叶组成， 所 述黄柏和大青叶的重量比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。 2.如权利要求1所述的含中草药的用于预防龋齿的药物组合物， 其特征在于， 所述黄柏 和大青叶的重量比为1:1。 3.如权利要求1所述的含中草药的用于预防龋齿的药物组合物， 其特征在于， 所述药物 组合物的剂型为漱口液。 4.如权利要求3所述的含中草药的用于预防龋齿的药物组合物， 其特征在于， 所述漱口 液中黄柏和大青叶的含量为： 黄柏12.5mg/mL， 大青叶12.5mg/mL。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105878511 A 2 一种含中草药的用于预防龋齿。
4、的药物组合物 技术领域 0001 本发明属于预防医学领域， 涉及一种含中草药的用于预防龋齿的药物组合物。 背景技术 0002 龋齿是人类的常见病和多发病， 是继心血管疾病和癌症之后第三种需要重点防治 的疾病， 全球6090的儿童和成人都曾受过龋病的困扰。 2010年， 全球有超过50亿人患 龋齿， 中国龋齿发病率高达7080， 婴幼儿中高达90以上。 龋齿发病的前提条件是致 龋菌的生长和产酸， 致龋菌是口腔中的常驻微生物群， 其中变异链球菌和乳酸杆菌与龋齿 的关系十分密切， 可发酵多种糖类产酸， 致菌斑pH下降和釉质脱矿溶解， 造成龋损。 自从20 世纪50年代以来许多学者从抑制或杀灭变异链球。
5、菌、 乳酸杆菌的药物着手进行了大量的研 究， 曾运用抗生素、 消毒剂、 氟化物和免疫制剂等。 随着经济的不断发展， 伴随环境污染、 生 态失调等问题的日益出现， 消费者对产品的安全性越来越重视， 以化学物质为主要有效成 分的抗菌物质存在环境降解周期长、 长期使用会产生刺激性、 广谱消毒杀菌对环境与人体 微生态产生影响等缺点， 进而可能影响机体代谢而对人类健康产生潜在不良影响。 因此， 利 用植物提取物来防治变异链球菌、 乳酸杆菌感染是目前抗龋药物研发的一个热点， 研究较 多的有茶叶、 黄芪、 黄芩、 厚朴、 连翘、 金银花、 五倍子、 蜂胶、 血藤和甘草等的提取物， 研究较 深入的有蜂胶、 五。
6、倍子、 茶多酚和厚朴。 但是， 现有含有多种中草药成分的配方复杂， 有效成 分难以确定， 生产成本高， 抗菌效果不显著， 因此， 需要开发抗菌效果确切， 配方简单的预防 龋齿的中药配方。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种含中草药的用于预防龋齿的药物组合物， 该组合物配 方简单， 对于致龋齿的乳酸杆菌、 变异链球菌具有良好的抑菌效果。 0004 为了实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0005 本发明提供一种含中草药的用于预防龋齿的药物组合物， 其特征在于， 由黄柏和 大青叶组成， 所述黄柏和大青叶的重量比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。 0006 优选地， 所述黄柏。
7、和大青叶的重量比为1:1。 0007 优选地， 所述药物组合物的剂型为漱口液。 0008 更优选地， 所述漱口液中黄柏和大青叶的含量为： 黄柏12.5mg/mL， 大青叶12.5mg/ mL。 0009 黄柏为芸香科植物黄蘖、 黄树皮的干燥树皮， 临床上广泛用于湿热痢疾、 腹泻、 黄 疸、 皮肤湿疹等。 现代药理研究表明， 黄柏具有抗菌、 抗真菌、 镇咳、 降压、 抗溃疡以及免疫抑 制作用。 文献记载， 黄柏对金黄色葡萄球菌、 白喉杆菌、 绿色链球菌、 痢疾杆菌、 溶血性链球 菌、 百日咳杆菌、 破伤风杆菌、 脑膜炎球菌、 霍乱弧菌、 炭疽杆菌、 白色葡萄球菌、 绿脓杆菌均 有抑制作用， 但未。
8、见有对乳酸杆菌、 变异链球菌抑菌作用的报道。 0010 大青叶为十字花科植物菘蓝的干燥叶。 二年生草本植物， 外皮灰黄色味苦、 性寒。 说 明 书 1/7 页 3 CN 105878511 A 3 主要有清热解毒、 凉血消斑的功效。 中医用于高热神昏、 黄疸、 痢疾、 痄腮、 喉痹、 丹毒、 脓肿 等。 已有的研究表明， 大青叶水煎剂在体外对金黄色葡萄球菌、 白色葡萄球菌、 甲型链球菌、 乙型链球菌均有明显抑制作用， 对沙门氏菌、 李斯特氏菌、 炭疽杆菌均有较强的抑制效应， 未见有对乳酸杆菌、 变异链球菌抑菌作用的报道。 0011 变异链球菌(Streptococcus mutans)是口腔主。
9、要的致龋齿菌之一， 常见于牙菌斑 中， 可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。 0012 乳酸杆菌(Lacticacid bacteria)为革兰氏阳性细菌， 可发酵碳水化合物产生大 量乳酸， 在自然界分布广泛， 是动物和人肠道等处的重要正常菌群之一， 对动物和人类无害 并有重要的生理功能。 但是， 当其通过饮食滞留于口腔时， 易与唾液中的黏蛋白和食物残屑 混合在一起， 牢固地粘附在牙齿表面形成菌斑， 容易造成牙齿釉质表面脱钙、 溶解， 形成龋 齿， 因此也是口腔致龋齿菌。 0013 本发明通过在10余种中草药中筛选出有抑菌作用的黄柏、 以其与大青叶配制成复 方合剂， 对其进行最小抑菌浓度和。
10、毒理学研究， 研制出的一种具有有效抑菌作用、 使用浓度 低、 无毒性、 无粘膜刺激作用的新型预防龋齿的配方。 0014 其中黄柏为1:12提取物， 大青叶为1:5提取物， 具体方法均为： 采用热回流低温提 取浓缩机提取， 制成粉末， 溶剂均为乙醇， 乙醇温度85， 提取温度为65-85， 浓缩温度 为50-70、 重金属、 农药残留及微生物指标符合国家标准要求， 使用时用量折成原药计算。 0015 本发明的有益效果在于： 0016 本发明提供一种预防龋齿的组合物配方， 该配方由黄柏和大青叶组成， 对于致龋 菌乳酸杆菌、 变异链球菌具有良好的抑制效果， 特别是二者配合比单独使用具有更低的作 用浓。
11、度， 说明二者配合具有协同增效的效果。 本发明使用的原料提取自植物， 不含任何化学 添加剂， 对粘膜无刺激性、 无生殖毒性、 对人体安全无毒。 附图说明 0017 图1为本发明提供的药物组合物复方漱口液对乳酸杆菌的抑菌环。 0018 图2为本发明提供的药物组合物复方漱口液对变异链球菌的抑菌环。 具体实施方式 0019 以下仅以实施例说明本发明可能的实施形式， 但并非用以限制本发明所要保护的 范畴。 0020 实施例： 0021 1试验材料与试剂 0022 1.1黄柏购自深圳华润三九医药股份有限公司， 原药抗菌有效成分盐酸小蘖碱含 量4.81， 使用时制成1:12提取物。 0023 1.2大青叶。
12、提取物购自南京泽朗医药科技有限公司， 主要有效成分靛玉红含量为 1.05， 使用时制成1:5提取物。 0024 1.3龋齿的指示菌变异链球菌(ATCC35668)、 乳酸杆菌(ATCC4546)购自北京豫鼎鑫 捷科技有限公司。 0025 1.4脑心浸液琼脂培养基购买自青岛高科园海博生物科技有限公司、 MRS培养基购 说 明 书 2/7 页 4 CN 105878511 A 4 买自由青岛尼赛欣合生物技术有限公司。 0026 2试验方法与结果 0027 2.1单一抑菌物质抑菌环试验 0028 取黄柏提取物、 大青叶提取物， 分别配制成含原药400mg/mL的溶液进行抑菌试验。 用双倍稀释法将黄柏。
13、提取物、 大青叶提取物按原药浓度分别配制成5个浓度梯度溶液： 400mg/mL、 200mg/mL、 100mg/mL、 50mg/mL、 25mg/mL， 并煮沸灭菌。 取配制好的溶液各20 l， 滴 加于无菌干燥的圆形滤纸片(d5mm)上， 同时以滴加20 l无菌蒸馏水的滤纸片作为阴性对 照， 将滤纸片晾干备用。 0029 分别将变异链球菌、 乳酸杆菌配制成浓度为5105cfu/mL5106cfu/mL的试验 菌液。 用无菌棉拭子蘸取菌液， 均匀涂抹变异链球菌于脑心浸液琼脂培养基、 乳酸杆菌于 MRS培养基表面， 室温下干燥5min。 在染菌平板上贴放制备好的滤纸片及阴性对照， 置于厌 氧。
14、缸中37恒温箱培养， 乳酸杆菌18-24h后观察结果、 变异链球菌40-48h后观察结果， 试验 平行做3组。 0030 试验结果： 用游标卡尺测量并记录抑菌环直径， 结果如表1和表2所示。 其中， 阴性 对照组应无抑菌环产生， 否则试验无效。 抑菌环直径大于7mm者， 为有抑菌作用， 小于或等于 7mm者， 为无抑菌作用， 结果为3组试验的平均数。 0031 表1黄柏、 大青叶对乳酸杆菌抑菌环试验结果 0032 0033 表2黄柏、 大青叶对变异链球菌抑菌环试验结果 0034 0035 由表1和表2结果可见， 黄柏、 大青叶对乳酸杆菌和变异链球菌均有抑菌作用。 0036 2.2单一抑菌物质最。
15、小抑菌浓度试验 0037 黄柏、 大青叶分别应用400mg/mL、 200mg/mL、 100mg/mL、 50mg/mL、 25mg/mL、 12.5mg/ mL 6个浓度梯度， 将配制好经煮沸消毒的抗菌物质溶液分别混合溶解于脑心浸液琼脂培养 基、 MR培养基中， 点种变异链球菌和乳酸杆菌， 以无菌蒸馏水作为阴性对照组， 置于厌氧缸 中37恒温箱培养， 乳酸杆菌18-24h后观察结果、 变异链球菌40-48h后观察记录各组平皿 菌落生长情况。 0038 试验结果： 黄柏对乳酸杆菌的最小抑菌浓度为100mg/mL、 对变异链球菌的最小抑 菌浓度为25mg/mL； 大青叶对乳酸杆菌和变异链球菌的。
16、最小抑菌浓度均为100mg/mL。 说 明 书 3/7 页 5 CN 105878511 A 5 0039 2.3药物组合物的筛选 0040 根据抑菌环试验和单一抑菌成分最小抑菌浓度筛选试验结果， 选取抑菌效果较好 的黄柏、 大青叶按照不同比例配制成溶液1-16号。 具体方法为： 将上述成分分别溶解于 100mL蒸馏水中， 煮沸灭菌后， 冷却备用， 各组组合物中有效成分浓度见表3。 0041 表3不同浓度配比的组合物 0042 0043 0044 2.4各组合物抑菌试验结果 0045 将表3中组合物， 采用滤纸片扩散法分别对乳酸杆菌、 变异链球菌进行抑菌试验。 具体方法为： 取配制好的溶液各2。
17、0 l， 滴加于无菌干燥的圆形滤纸片(d5mm)上， 同时以滴 加20 l无菌蒸馏水的滤纸片作为阴性对照， 将滤纸片晾干备用。 0046 分别将变异链球菌、 乳酸杆菌配制成浓度为5105cfu/mL5106cfu/mL的试验 菌液。 用无菌棉拭子蘸取菌液， 均匀涂抹变异链球菌于脑心浸液琼脂培养基、 乳酸杆菌于 MRS培养基表面， 室温下干燥5min。 在染菌平板上贴放制备好的滤纸片及阴性对照， 置于厌 氧缸中37恒温箱培养， 乳酸杆菌18-24h后观察结果、 变异链球菌40-48h后观察结果， 实验 平行做3组。 0047 试验结果： 用游标卡尺测量并记录抑菌环直径， 结果如表4所示。 其中，。
18、 阴性对照组 应无抑菌环产生， 否则试验无效。 抑菌环直径大于7mm者， 为有抑菌作用， 小于或等于7mm者， 为无抑菌作用， 结果为3组试验的平均数。 0048 表4各组合物抑菌试验结果 说 明 书 4/7 页 6 CN 105878511 A 6 0049 0050 0051 以上研究已得出黄柏对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度分别为100mg/mL、 25mg/mL， 大青叶对乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌浓度均为100mg/mL。 黄柏和大青叶配 伍使用时， 在表4试验结果中， 各配方均有抑菌作用， 根据有抑菌作用时使用最低剂量的原 则， 选用黄柏和大青叶均为12.5mg/mL的16。
19、号配方为乳酸杆菌和变异链球菌的最小抑菌环 浓度， 故以16号配方进一步进行最小抑菌浓度试验， 各组浓度见表5。 试验结果乳酸杆菌的 最小抑菌浓度为1号组、 变异链球菌的最小抑菌浓度均为2号组。 0052 表5各组配方有效抑菌成分浓度 0053 说 明 书 5/7 页 7 CN 105878511 A 7 0054 3毒理学试验 0055 3.1急性经口毒性试验 0056 选体重18-22g小鼠20只， 雌雄各半， 分笼饲养。 试验前预饲7d， 试验前禁食过夜， 不 限制饮水， 采用一次最大限度试验方法， 一次灌胃剂量5000mg/(kgbw)。 按黄柏： 大青叶的 比例1:1配制溶液， 用经口。
20、灌胃方式将上述配好的复方漱口液合剂给予小鼠。 每只小鼠称重 后， 按每次30mL/(kgbw)剂量分2次灌胃， 中间间隔12h。 染毒后14d内观察动物中毒表现、 有无死亡、 死亡数量及时间。 0057 结果： 14d内实验动物均无中毒表现， 无死亡。 根据判断标准， 可判定复方漱口液合 剂LD50大于5000mg/kg体重， 为实际无毒级物质。 0058 3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 0059 因本复方合剂LD505000mg/Kg体重， 故试验分为5组。 选体重25-30g小鼠50只， 随 机分成5组， 每组10只雌雄各半。 试验设高、 中、 低剂量组， 以5000mg/kg体重为高。
21、剂量组、 1000mg/kg体重为中剂量组、 250mg/kg体重为低剂量组， 阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体 重)， 阴性对照组用蒸馏水。 动物染毒采用经口灌胃30h染毒法， 两次染毒间隔24h， 第二次染 毒后6h取材。 处死小鼠后以5mL生理盐水冲洗骨髓腔， 将骨髓细胞冲入离心管中。 所得细胞 悬浮液1000rpm离心10min， 滴悬液于载玻片的一端， 按常规涂片法涂片， 晾干。 将载玻片置 于固定液(甲醇和冰乙酸按3:1混合)中固定10min。 置于Giemsa染色液(10)染色10min- 15min， 然后用流水冲洗掉浮色， 晾干。 选择细胞形态完整、 分布均匀、 着色适。
22、当的区域， 在油 镜下按一定顺序计数嗜多染红细胞(PCE)和微核。 PCE呈灰蓝色， 微核多数为圆形、 边缘光 滑、 整齐， 质地均匀， 呈紫红色或蓝紫色。 直径通常为红细胞主核的1/20-1/5。 每只动物计数 1000个PCE， 微核细胞率以千分率表示。 0060 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果： 0061 通过检测复方漱口液合剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响， 评价其染色 体损伤毒性。 微核试验结果见表6， 阴性对照组、 阳性对照组微核细胞率分别为4.1、 25.0， 试验1组(LD50)、 试验2组(1/5LD50)和试验3组(1/20LD50)微核细胞率分别为5.1、 5.5。
23、、 5.4， 将微核细胞率经平方根转换后进行单因素方差分析， 结果显示， 试验组与阴 性对照组比较， 无显著性差异(F0.121， P0.05)； 试验组与阳性对照组比较， 有显著性差 异(F12.071， P0.05)； 各剂量组之间比较， 无显著性差异(F0.012， P0.05)。 说明该 复方漱口液合剂对小鼠无体内染色体损伤作用。 0062 表6小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果 说 明 书 6/7 页 8 CN 105878511 A 8 0063 0064注a：为微核率进行平方根数据转换后的结果； 0065 3.3粘膜刺激试验 0066 应用3月龄的雄性大鼠， 用乙醚将大鼠麻醉、 以。
24、碘伏消毒口腔内外组织， 用灭菌棉 试子蘸取含黄柏12.5mg/mL、 大青叶12.5mg/mL的复方中草药漱口液合剂在口腔两侧颊粘膜 表面涂抹， 一侧为试样、 另一侧为无菌生理盐水对照， 24h内观察结果。 0067 试验结果： 3只大鼠口腔粘膜试样侧、 对照侧均无红斑形成， 记分为0分， 为无刺激 反应。 0068 本发明提供的以黄柏和大青叶复配的药物组合物， 对于引起龋齿最常见的变异链 球菌和乳酸杆菌为指标菌进行抑菌作用研究， 是在多种中草药提取物中筛选出的对变异链 球菌和乳酸杆菌有抑菌作用的组方， 进一步进行最小抑菌浓度试验， 结果： 黄柏对乳酸杆菌 和变异球菌链的最小抑菌浓度分别为10。
25、0mg/mL、 25mg/mL， 大青叶对乳酸杆菌和变异链球菌 的最小抑菌浓度均为100mg/mL。 0069 为了减少药物的使用浓度增强药物的抑菌效果， 将黄柏提取物和大青叶提取物制 成复方合剂， 最佳配方比例为16号， 即含黄柏12.5mg/mL、 大青叶12.5mg/mL， 进一步对该配 方合剂进行最小抑菌浓度试验， 结果为含黄柏12.5mg/mL、 大青叶12.5mg/mL组可有效抑制 乳酸杆菌、 含黄柏6.25mg/mL、 大青叶6.25mg/mL组可有效抑制变异链球菌。 因此， 黄柏和大 青叶以1:1的比例混合， 对于引起龋齿的细菌-乳酸杆菌、 变异链球菌的抑菌作用有明显增 效作用。 为了对乳酸杆菌、 变异链球菌均有抑菌作用， 以含黄柏12.5mg/mL、 大青叶12.5mg/ mL组为本预防龋齿的复方中草药漱口液配方。 0070 从上述实施例可以看出， 本发明提供的预防龋齿药物组合物， 原料提取自天然植 物， 动物实验表明， 该复方漱口液为实际无毒级物质， 无生殖毒性、 对粘膜无刺激性、 对人体 安全无毒。 说 明 书 7/7 页 9 CN 105878511 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 10 CN 105878511 A 10 。