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1、(10)授权公告号 CN 101415399 B (45)授权公告日 2011.11.16 CN 101415399 B *CN101415399B* (21)申请号 200780011924.X (22)申请日 2007.03.19 11/393,538 2006.03.30 US A61K 8/49(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) A61K 8/27(2006.01) A61K 8/29(2006.01) A61Q 17/04(2006.01) (73)专利权人 荷兰联合利华有限公司 地址 荷兰鹿特丹 (72)发明人 LJ肖尔 SA罗查 MD麦金尼 (74)专利代。
2、理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 段晓玲 付磊 US 5858997 A,1999.01.12, 全文 . WO 0170190 A2,2001.09.27, 全文 . US 20050271608 A1,2005.12.08, 全文 . US 20050031559 A1,2005.02.10, 全文 . C.Y.Chen， et al.The absorption and emission spectra of some substituted 3-phenylcoumarins.Heterocycles .1977, 第 7 卷 ( 第 2 期 ), 第 933。
3、-945 页 . (54) 发明名称 使皮肤色泽变淡的试剂和组合物 (57) 摘要 本发明提供了化妆品组合物和方法， 特别是 用于使皮肤色泽变淡， 单独或结合其它皮肤有益 试剂使用通式(I)的7-羟基-2-苯基香豆素和衍 生物作为使皮肤色泽变淡的试剂， 并结合化妆品 媒介物 ： 其中R1和/或R2可以位于苯环上的1-、 2-、 3-、 5-、 和 / 或 6- 位 ； R1和 / 或 R2各自或二者均代表氢原 子、 OH、 C1-C4酰基基团、 或 C1-C4烷基基团 ； 且 R 代 表氢原子、 C1-C4酰基基团、 或 C1-C4烷基基团。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段。
4、日 2008.09.28 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2007/002440 2007.03.19 (87)PCT申请的公布数据 WO2007/112853 EN 2007.10.11 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 陈欢 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 10 页 CN 101415399 B1/2 页 2 1. 组合物在制备使皮肤色泽变淡的化妆品中的用途， 其中该组合物包含 ： a.0.000001 至 50的式 III 的 7- 羟基 -3- 苯基香豆素 ： b. 化妆品可接受的载体。 2. 权利要求 1 。
5、的用途， 其中所述组合物还包括防晒剂。 3. 权利要求 2 的用途， 其中所述防晒剂是微粉化的金属氧化物。 4. 权利要求 1 的用途， 其中所述组合物还包括选自 - 羟酸、 - 羟酸、 多羟基酸、 氢 醌、 叔丁基氢醌、 二元酸、 类视黄醇及其混合物的皮肤有益试剂。 5. 权利要求 1 的用途， 其中所述组合物还包括选自 2- 羟基 -4- 甲氧基二苯甲酮、 5- 苯 甲酰基 -4- 羟基 -2- 甲氧基苯磺酸、 2， 2 - 二羟基 -4- 甲氧基二苯甲酮、 二乙醇胺甲氧基 肉桂酸酯、 乙基二羟基丙基 - 对氨基苯甲酸、 甘油基对氨基苯甲酸、 水杨酸高酯、 邻氨 基苯甲酸甲酯、 氰双苯丙烯。
6、酸辛酯、 辛基二甲基对氨基苯甲酸、 辛基甲氧基肉桂酸酯、 水杨 酸辛酯、 对氨基苯甲酸、 2- 苯基苯并咪唑 -5- 磺酸、 三乙醇胺水杨酸酯、 3-(4- 甲基苯亚甲 基 )- 樟脑、 2， 4- 二羟基二苯甲酮、 双 (2， 4- 二羟基苯基 ) 甲酮、 双 (2- 羟基 -4- 甲氧基苯 基 ) 甲酮、 2- 羟基 -4- 辛氧基二苯甲酮、 4- 异丙基二苯甲酰基甲烷、 丁基甲氧基二苯甲酰基 甲烷、 氰双苯丙烯酸乙酯及其混合物的有机防晒剂。 6. 一种化妆品组合物， 包括 ： a.0.000001 至 50的式 III 的化合物 ： b. 有机和 / 或无机防晒剂 ； 和 c. 化妆品可。
7、接受的载体。 7. 权利要求 6 的化妆品组合物， 其中所述化合物占所述组合物的 0.00001 -10。 8. 权利要求 6 的化妆品组合物， 其中所述化合物占所述组合物的 0.001 -7。 9. 权利要求 6 的化妆品组合物， 其中所述化合物占所述组合物的 0.01 -5。 10. 用于使皮肤色泽变淡的化妆品组合物， 包括 ： a.0.000001 至 50的式 III 的化合物 ： 权 利 要 求 书 CN 101415399 B2/2 页 3 b. 有机和 / 或无机防晒剂 ； 和 c. 化妆品可接受的载体。 权 利 要 求 书 CN 101415399 B1/10 页 4 使皮肤色。
8、泽变淡的试剂和组合物 0001 本发明涉及使用 7- 羟基 -3- 苯基香豆素和衍生化合物， 且更具体地， 使用 7- 羟 基 -3- 苯基香豆素和衍生化合物作为使皮肤色泽变淡的试剂的化妆品组合物和方法。 0002 许多人关心他们皮肤色素沉着的程度。例如， 长有老年斑或雀斑的人可能希望使 这类被着色的斑较不显著。 其他人可能希望减轻由于暴露于阳光而造成的皮肤变黑或使他 们天然肤色变淡。 为了满足该需求， 做了很多尝试来开发减少黑素细胞的色素生成的产品。 然而， 迄今已鉴定的物质倾向于具有低功效或不良的副作用， 例如毒性或者皮肤刺激性。 因 此， 持续需要新的使皮肤色泽变淡的化妆品试剂， 具有改。
9、进的总体有效性。 0003 例如， 某些间苯二酚衍生物， 特别是 4- 取代的间苯二酚衍生物， 可用于化妆品组 合物用于使皮肤色泽变淡的益处， 如 Hu 等， U.S. 专利 No.6,132,740 ； Bradley 等， U.S. 专 利 No.6,504,037 和 6,861,564 ； 日本公开的专利申请 JP2001-010925 和 JP2000-327557 ； 和 Harichian 等， U.S. 专利 No.6,852,310 中所公开的。例如在 Chevalier 等， U.S. 专利 No.6,403,065( 用于皮肤 ) 中描述了作为荧光增白剂的氨基苯酚衍生物。。
10、 0004 申请人现在已经发现 7- 羟基 -3- 苯基香豆素和衍生化合物递送了使皮肤色泽变 淡的益处。这些化合物的通用化学式和结构在以下更详细讨论。发现该 7- 羟基 -3- 苯基 香豆素和衍生化合物在化妆品上有效并且可能对皮肤刺激较少。 本发明的这些化合物并没 有被用于化妆品中， 它们也没有被具体地用于使皮肤色泽变淡。 0005 该 7- 羟基 -3- 苯基香豆素可获自 Sigma-Aldrich， 作为用于生理 pH 范围的荧光 pH 探针。Raue GB933042 公开了作为用于纺织品的荧光增白试剂的 3- 苯基 -7 羟基香豆素 化合物。 0006 发明概述 0007 通式 I 的。
11、化合物、 和含有其的组合物的使用递送了使皮肤色泽变淡的益处， 具有 潜在的刺激性减少。 本发明提供了一种化妆品组合物和使用一种组合物使皮肤色泽变淡的 方法， 该组合物除了化妆品可接受的媒 介物之外， 还含有约 0.000001- 约 50的通式 I 的 化合物 ： 0008 0009 其中 R1和 / 或 R2可以位于苯环上的 1-、 2-、 3-、 5-、 和 / 或 6- 位 ； R1和 / 或 R2各 自或二者均代表氢原子、 OH、 C1-C4酰基基团、 或 C1-C4烷基基团 ； 且 R 代表氢原子、 C1-C4酰基 基团、 或 C1-C4烷基基团。 0010 优选的， R 代表氢原子。
12、， 如通式 II 的化合物代表 ： 说 明 书 CN 101415399 B2/10 页 5 0011 0012 在更加优选的实施方案中， R 代表氢原子， 且 R1和 R2二者均代表氢， 得到式 III 的 7- 羟基 -3- 苯基香豆素 ( 也称为 3- 苯基伞形酮 ) ： 0013 0014 在本发明的化妆品组合物中可以包括进一步的皮肤有益试剂。 还可以包括有机和 无机防晒剂。 0015 本发明的化合物和组合物可以用于减少总体皮肤色素沉着以及减少离散的色素 沉着过度， 例如色斑和雀斑， 以及用于减少与刺激性皮肤有益试剂例如视黄醇相关的刺激。 0016 发明详述 0017 本文所用的术语 。
13、“化妆品组合物” 意图用来描述用于局部施加到人类皮肤的组合 物。 0018 本文所用的术语 “皮肤” 包括脸、 颈、 胸、 背、 臂、 腋窝、 手、 腿和头皮上的皮肤。 0019 除了在实施例中， 或者在其它地方明确指出， 在说明书中表示物质量或反应条件、 材料物理性质和 / 或用途的所有数字被理解为经词语 “约” 修饰。所有量是以组合物重量 计， 除非另行指明。 0020 应当注意在指定任何浓度范围时， 任何具体较高浓度可以与任何具体较低浓度结 合。 0021 在本文中的术语 “包括” 以其通常的含义使用并且指包含、 由 . 制成、 由 . 构 成、 由 . 组成和 / 或基本由 . 组成。。
14、换言之， 该术语被定义为并非所指步骤、 组分、 成分 或者特征的穷举。 0022 使皮肤色泽变淡的试剂 0023 本发明涉及如下所示的通式 I 的化合物、 含有其的组合物， 作为皮肤化妆品试剂、 特别是作为使皮肤色泽变淡的试剂的用途。 本发明组合物和方法的一个特别优势在于通式 I 的化合物可以比已知的使皮肤色泽变淡的化合物对皮肤的刺激性更低， 0024 说 明 书 CN 101415399 B3/10 页 6 0025 其中 R1和 / 或 R2可以位于苯环上的 1-、 2-、 3-、 5-、 和 / 或 6- 位 ； R1和 / 或 R2各 自或二者均代表氢原子、 C1-C4酰基基团、 或 。
15、C1-C4烷基基团 ； 且 R 代表氢原子、 C1-C4酰基基 团、 或 C1-C4烷基基团。 0026 优选的， R 代表氢原子， 如通式 II 的化合物代表 ： 0027 0028 在更加优选的实施方案中， R 代表氢原子， 且 R1和 R2二者均代表氢， 得到式 III 的 7- 羟基 -3- 苯基香豆素 ( 也称为 3- 苯基伞形酮 ) ： 0029 0030 在本发明的化妆品组合物中可以包括进一步的皮肤有益试剂。 还可以包括有机和 无机防晒剂。 0031 本发明的化妆品组合物和方法具有有效的使皮肤色泽变淡的性质并且可以对皮 肤刺激性较小。 0032 该组合物通常含有约0.000001。
16、-约50的通式I的化合物。 优选式II和/或III 的化合物。 通式I或式II或式III的化合物的量优选为化妆品组合物总量的约0.00001-约 10， 更优选约 0.001- 约 7， 最优选 0.01- 约 5。 0033 任选的皮肤有益试剂 0034 优选的化妆品组合物是适合根据本发明方法施加到人类皮肤的那些， 其任选， 但 是优选， 包括进一步的皮肤有益试剂。 0035 合适的额外皮肤有益试剂包括抗老化、 减少皱纹、 皮肤增白、 抗痤疮、 和减少皮脂 的试剂。这些的实例包括 - 羟酸、 - 羟酸、 多羟基酸、 透明质酸、 氢醌、 叔丁基氢醌、 维生 说 明 书 CN 101415399。
17、 B4/10 页 7 素 B 衍生物、 维生素 C 衍生物、 尿素囊 ( 一种胎盘提取物 )、 二元酸、 类视黄醇 (retinoids) 和间苯二酚衍生物。 0036 化妆品可接受的载体 0037 化妆品可接受的媒介物可以用作用于组合物中皮肤有益成分的稀释剂、 分散剂或 载体， 从而在该组合物施加到皮肤时促进它们的分布。 0038 媒介物可以是水性的、 无水的或乳状液， 优选水性或者乳状液的组合物， 尤其是 油包水或水包油乳状液， 优选水包油乳状液。当水存在时， 则水可以为 5至 99， 优选 20-70， 最佳 40至 70重量。 0039 除了水以外， 相对挥发性的溶剂也可以作为载体存在。
18、于本发明组合物中。最优 选的是一羟基 C1-C3链烷醇。这些包括乙醇、 甲醇和异丙醇。一羟基链烷醇的含量可以为 1-70， 优选 10-50， 最佳 15-40重量。 0040 润肤剂材料还可以用作化妆品可接受的载体。这些可以是硅油形式和合成酯形 式。润肤剂的量可以为 0.1-50， 优选 1-20重量之间的任何值。 0041 硅油可分为挥发性和非挥发性种类。本文所用的术语 “挥发性” 指在环境温度具 有可测量的蒸气压的那些材料。挥发性硅油优选选自含有 3 至 9、 优选 4 至 5 个硅原子的环 状或直链聚二甲基硅氧烷。 直链挥发性聚硅氧烷材料一般在25下具有小于约5厘沲的粘 度， 而环状材。
19、料通常具有小于约 10 厘沲的粘度。可用作润肤剂材料的非挥发性硅油包括聚 烷基硅氧烷、 聚烷基芳基硅氧烷和聚醚硅氧烷共聚物。本文有用的基本非挥发性聚烷基硅 氧烷包括例如在 25下粘度为约 500 万至约 2500 万厘沲的聚二甲基硅氧烷。在用于本发 明组合物的非挥发性润肤剂中， 优选的是在25下粘度为约10至约400厘沲的聚二甲基硅 氧烷。 0042 酯润肤剂有 ： 0043 (1) 具有 10 至 20 个碳原子的脂肪酸的链烯基或烷基酯。其实例包括新戊酸异花 生基酯、 isononyl isonanonoate、 肉豆蔻酸油酯、 硬脂酸油酯和油酸油酯。 0044 (2) 醚 - 酯， 例如乙。
20、氧基化脂肪醇的脂肪酸酯。 0045 (3) 多元醇酯。乙二醇单和二脂肪酸酯、 二甘醇单和二脂肪酸酯、 聚乙二醇 (200-6000) 单和二脂肪酸酯、 丙二醇单和二脂肪酸酯、 聚丙二醇 2000 单油酸酯、 聚丙二醇 2000 单硬脂酸酯、 乙氧基化丙二醇单硬脂酸酯、 甘油单和二脂肪酸酯、 聚甘油聚脂肪酯、 乙 氧基化甘油单硬脂酸酯、 1， 3- 丁二醇单硬脂酸酯、 1， 3- 丁二醇二硬脂酸酯、 聚氧乙烯多元 醇脂肪酸酯、 失水山梨醇脂肪酸酯和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯是令人满 意的多元醇 酯。 0046 (4) 蜡酯， 例如蜂蜡、 鲸蜡、 肉豆蔻酸肉豆蔻酯、 硬脂酸十八酯和山嵛酸花生基酯。。
21、 0047 (5) 固醇酯， 其实例有胆固醇脂肪酸酯。 0048 本发明组合物中还可以加入具有10至30个碳原子的脂肪酸作为化妆品可接受的 载体。该类别的示例有壬酸、 月桂酸、 肉豆蔻酸、 棕榈酸、 硬脂酸、 异硬脂酸、 羟基硬脂酸、 油 酸、 亚油酸、 蓖麻油酸、 花生酸、 山嵛酸、 和芥酸。 0049 多元醇类型的润湿剂也可以用作本发明组合物中化妆品可接受的载体。润湿剂 帮助提高润肤剂的功效， 减少鳞屑形成， 刺激去除累积的鳞屑， 并改善皮肤感觉。典型的多 元醇包括甘油、 聚亚烷基二醇以及更优选的亚烷基多元醇及其衍生物， 包括丙二醇、 双丙二 说 明 书 CN 101415399 B5/1。
22、0 页 8 醇、 聚丙二醇、 聚乙二醇及其衍生物、 山梨糖醇、 羟丙基山梨糖醇、 己二醇、 1， 3- 丁二醇、 1， 2， 6- 己三醇、 乙氧基化甘油、 丙氧基化甘油及其混合物。为了最好的结果， 润湿剂优选为丙二 醇或透明质酸钠。润湿剂的量范围可以是组合物重量的 0.5至 30， 优选 1至 15之 间的任何值。 0050 增稠剂也可以用作本发明组合物中化妆品可接受载体的部分。 典型的增稠剂包括 交联丙烯酸酯 ( 例如聚羧乙烯 982)、 疏水改性的丙烯酸酯 ( 例如聚羧乙烯 1382)、 纤维素衍 生物和天然树胶。 其中有用的纤维素衍生物有羧甲基纤维素钠、 羟丙基甲基纤维素、 羟丙基 纤。
23、维素、 羟乙基纤维素、 乙基纤维素和羟甲基纤维素。适合本发明的天然树胶包括瓜耳胶、 黄原胶、 菌核、 角叉菜聚糖、 果胶及这些树胶的组合。增稠剂的量的范围可以为 0.0001重 量至 5重量， 通常 0.001重量至 1重量， 最佳 0.01重量至 0.5重量。 0051 水、 溶剂、 聚硅氧烷、 酯、 脂肪酸、 润湿剂和 / 或增稠剂共同构成化妆品可接受的载 体， 其量为 1至 99.9、 优选 80至 99重量。 0052 油或油性材料可以结合乳化剂存在以提供油包水乳状液或水包油乳状液， 这很大 程度上取决于所用乳化剂的平均亲水亲脂平衡 (HLB)。 0053 表面活性剂也可以存在于本发明。
24、的化妆品组合物中。 表面活性剂的总浓度为组合 物重量的 0.1-40， 优选 1-20， 最佳 1-5。表面活性剂可以选自阴离子、 非离子、 阳离 子和两性活性剂。 尤其优选的非离子表面活性剂是具有C10-C20脂肪醇或酸疏水物(每摩尔 疏水物与2-100摩 尔环氧乙烷或环氧丙烷缩合) ； 与2-20摩尔烯化氧缩合的C2-C10烷基苯 酚 ； 乙二醇的单和二脂肪酸酯 ； 脂肪酸单酸甘油酯 ； 失水山梨醇、 单和二C8-C20脂肪酸 ； 嵌段 共聚物 ( 环氧乙烷 / 环氧丙烷 ) ； 和聚氧乙烯失水山梨醇及其组合的那些。烷基聚糖苷和 糖脂肪酰胺 ( 例如甲基葡糖酰胺 ) 也是适合的非离子表面活。
25、性剂。 0054 优选的阴离子表面活性剂包括皂、 烷基醚硫酸盐和磺酸盐、 烷基硫酸盐和磺酸盐、 烷基苯磺酸盐、 烷基和二烷基磺基琥珀酸盐、 C8-C20酰基羟乙磺酸盐、 酰基谷氨酸盐、 C8-C20 烷基醚磷酸盐及其组合。 0055 任选组分 0056 其它辅助次要组分也可以引入该化妆品组合物。这些成分可以包括着色剂和 / 或 颜料、 遮光剂、 香料、 其它增稠剂、 增塑剂、 炉甘石、 抗氧化剂、 螯合剂、 以及额外的防晒剂例 如有机防晒剂。这些其它辅助次要组分的量可以为组合物重量的 0.001-20之间的任何 值。 0057 为用作防晒剂， 金属氧化物可以单独使用或者以混合物使用和 / 或结。
26、合有机防晒 剂使用。有机防晒剂的实例包括但不限于下表列出的那些 ： 0058 表 1 0059 说 明 书 CN 101415399 B6/10 页 9 0060 化妆品组合物中有机防晒剂的量优选为约 0.1 重量 - 约 10 重量， 更优选约 1 重量 -5 重量。 0061 由于其有效性以及商业可得性， 优选的有机防晒剂是Parsol MCX和Parsol1789。 0062 组合物的用途 0063 根据本发明的方法主要意图作为使用个人护理产品用于局部施加到人类皮肤， 用 于化妆品益处， 包括但不限于使皮肤色泽变淡。 0064 本发明化合物和组合物可以用于减少总体皮肤色素沉着以及减少离散。
27、的色素沉 着过度， 例如色斑和雀斑， 以及用于减少与刺激性皮肤有益试剂例如视黄醇相关的刺激。 0065 使用中， 少量的组合物， 例如 1-5ml， 从合适的容器或施加器被施加 于皮肤区域， 并且如果必要的话， 然后使用手或手指或合适的设备将其涂抹和 / 或摩擦入皮肤。 0066 产品形式和包装 0067 可用于本发明方法的化妆品组合物可以配制为具有粘度 4,000 至 10,000mPas 的 乳液， 具有粘度 10,000 至 20,000mPas 的流体霜或具有粘度 20,000 到 100,000mPas 或以上 的霜。组合物可以包装在合适的容器中以适合其粘度和消费者的预期用途。例如乳。
28、液或流 体霜可以包装在瓶子或走珠式施加器或推进剂 - 驱动的气雾剂设备或装有适合手指操作 的泵的容器中。 该组合物是霜时， 它可以简单地储存在非可变形的瓶子或挤压容器中， 比如 管或有盖的罐。当组合物是固体或半固体棒时， 其可以包装在合适的容器中用于手动地或 说 明 书 CN 101415399 B7/10 页 10 用机械方法排挤或挤出该组合物。 0068 本发明因此也提供包含如本文所述的化妆品可接受的组合物的密闭容器。 0069 以下实施例是通过举例， 而非限制本发明的原理， 从而举例说明执行本发明的最 佳方式。 0070 实施例 1 0071 制 备 在 本 发 明 范 围 内 的 化 。
29、妆 品 组 合 物。7- 羟 基 -3- 苯 基 香 豆 素 获 自 Sigma-Aldrich。 0072 下表所示的基料配方是通过在搅拌下加热相 A 成分至 70-85来制备的。相 B 成 分在分开的容器中被搅拌加热至 70-85。然后， 相 A 添加入相 B， 同时两个相都是保持在 70-85。在 70-85搅拌该混合物至少 15 分钟， 然后冷却。 0073 基料配方如下表所示 0074 表 2 0075 0076 *BAL 指余量 0077 实施例 2 0078 制备本发明范围内的额外的化妆品组合物。 0079 表 3 0080 Wt 相 水， DI余量 A EDTA 二钠0.05 。
30、A 硅酸镁铝0.6A 说 明 书 CN 101415399 B8/10 页 11 对羟基苯甲酸甲酯0.15 A 西甲硅油0.01 A 丁二醇 1， 33.0A 羟乙基纤维素0.5A 甘油， USP2.0A 黄原酸胶0.2A 三乙醇胺1.2B 硬脂酸3.0B 对羟基苯甲酸丙酯 NF0.1B 甘油基羟基硬脂酸酯1.5B 十八烷醇1.5B 棕榈酸异硬脂酯6.0B C12-15 醇辛酸酯3.0B 聚二甲基硅氧烷1.0B 胆甾醇 NF0.5B 失水山梨醇硬脂酸酯1.0B 微粉化二氧化钛5.0C 生育酚乙酸酯0.1B PEG-100 硬脂酸酯2.0B 硬脂酰基乳酰乳酸钠0.5B 羟基辛酸0.1C 7- 羟。
31、基 -3- 苯基香豆素10.0 C Parsol MCX2.4C - 没药醇0.2C 0081 该实施例的组合物制备如下 ： 0082 1. 加热相 A 到 80 0083 2. 在分开的容器中加热相 B 到 75 0084 3. 将相 B 加入到相 A 并且去热 (heat off) 混合 30 分钟。 0085 4. 在 50加入相 C 并且混合 10 分钟。 0086 实施例 3-10 0087 在本发明范围内制备可用于本发明方法的一组额外的组合物并且列在下表中。 0088 表 4 0089 说 明 书 CN 101415399 B9/10 页 12 0090 实施例 11 0091 该。
32、实施例显示了根据本发明方法使用 7- 羟基 -3- 苯基香豆素作为使皮肤色泽变 淡的试剂的使皮肤色泽变淡的效果。使用 MatTekCorporation 黑种人皮 (MelanoDerm) 培 养物来实施该试验。使用比色计测量发光来化验 3-D 皮肤模型的黑化 (melanization) 程 度。 0092 黑种人皮培养物方法 0093 黑种人皮培养物获自 MatTek Corporation， Ashland， Massachusetts。黑种人皮 根据制造商说明进行维护。用于维护黑种人皮培养物的基底介 质是除了抗真菌剂和抗生 素以外， 补充了未指明数量的表皮生长因子、 胰岛素、 氢化可的。
33、松和专有表皮分化化合物的 Dulbeccco 改进的 Eagle 培养基 (DMEM)。 0094 为了黑种人皮的长期维护， 对基底介质补充基本成纤维细胞生长因子 (bFGF) 和 - 黑素细胞 - 刺激性激素 (a-MSH)， 该化合物是黑素细胞生长和黑素生成的刺激剂。培养 物每隔一天喂料， 持续总计两周。当进行喂料时， 还将在二甲基亚砜 (DMSO) 或培养物介质 中制备的新鲜的活性制剂施加到黑种人皮。 每个处理条件重复一次并且对黑种人皮培养物 进行数码拍照来评价总体色素沉着。 对黑种人皮进行显微照相来评价角质化细胞和黑素细 胞的细胞存活性。作为该处理是 / 非细胞毒性的进一步证据， 对来。
34、自 24 小时后 - 处理培养 物的上清液进行乳酸酯脱氢酶 (LDH) 化验 (Promega， Madison， WI)。 0095 可溶性黑素化验 0096 为制备化验用的组织 ： 0097 在处理之后， 组织通常冰冻直到实验完成。解冻组织， 每次一些， 并且放置在 Dulbecco s 磷酸化缓冲溶液 (D-PBS) 中以从该培养物介质和残余实验制品中除去过量酚 红。 从该插入体取出单一组织。 吸干(blotdry)并且放置在1.7毫升微量离心管(microfuge tube) 中。重复所有样品。添加 250 微升 SolvableTM(Tissue and Gel Solubilize。
35、r0.5M- 说 明 书 CN 101415399 B10/10 页 13 PackardBioscience Co.Catalogue No.6NE9100(NEF910)。 关闭该管并且确保组织完全浸 没。在 60与标准物一起培养过夜。在早晨， 涡旋样品。有时稠的 (thick) 组织将需要额 外的时间来完成溶解过程。 0098 为制备标准物 ： 0099 在 SolvableTM中以 1 毫克 / 毫升溶解黑素 (Sigma Cat.M8631)。溶液可以在 37 轻柔温热 15 分钟。在黑暗中储存溶液。 0100 为制备标准物曲线 ： 0101 在总计 250 微升 SolvableT。
36、M中从含有 0 微克 -250 微克的黑素的标准物制备稀释 物。和样品一起培养稀释物。 0102 为读取化验 ： 0103 冷却样品和标准物。在 13000rpm 离心 5 分钟以造粒。用 200 微升的各样品和标 准物填充微孔板(C-96)。 在移液时样品有一些发泡。 轻柔地吹过样品以在读取该板之前破 坏气泡。在 490nm 读板。结果显示在下表。 0104 表 5 0105 mg/ml 黑素标准物OD 490nm 8002.727 4001.321 2000.573 1000.321 500.184 250.065 对照OD 490nm DMSO1.292 未处理的1259 7- 羟基 -3- 苯基香豆素 (uM)OD 490nm 251.674 501.339 750.849 1000.293 0106 从上述列表的结果可以看出本发明的 7- 羟基 -3- 苯基香豆素化合物减少了黑素 合成。 0107 应当理解本文举例的和描述的本发明的具体形式仅意图用作代表。 包括但不限于 本说明书中所暗示的变化可以在所举例的实施方案中得出， 并且不会背离本公开的清楚教 导。因此， 应当参考以下所附权利要求来确定本发明的全部范围。 说 明 书 。