《伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 1842329 B (45)授权公告日 2011.09.14 CN 1842329 B *CN1842329B* (21)申请号 200580000860.4 (22)申请日 2005.01.19 012207/2004 2004.01.20 JP A61K 31/231(2006.01) A23L 1/30(2006.01) A61K 31/232(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12P 7/64(2006.01) (73)专利权人 三得利控股株式会社 地址 日本大阪府 (72)发明人 石仓义之 河岛。
2、洋 滨崎智仁 渡边志朗 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 黄革生 林柏楠 EP 0704211 A,1996.04.03, 权利要求 1-11, 说明书第 1 页第 2 栏最后一段第 2 页第 3 栏第 4 段和第 2 页第 4 栏最后一段 . JP 8053349 A,1996.02.27,权利要求以及说 明书第 15 段 . JP 2002053892 A,2002.02.19, 权利要求以 及说明书第 1 段 . CN 1468060 A,2004.01.14, 权利要求 1-17, 说明书摘要 , 说明书第 1 段 . (54) 发明名称 伴随肝损伤的肝脏。
3、疾病的预防剂或改善剂 (57) 摘要 提供了以 -9 不饱和脂肪酸为活性成分的 用于伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2006.03.10 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2005/000941 2005.01.19 (87)PCT申请的公布数据 WO2005/067914 JA 2005.07.28 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 林冠 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 1842329 B1/1 页 2 1. 具有 2 个或以上。
4、双键的 -9 不饱和脂肪酸或以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱 和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物的用途， 其用于制备伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改 善剂， 其中所述伴随肝损伤的肝脏疾病是病毒性肝炎、 醇性肝炎或脂肪型肝炎引起的急性 肝炎或慢性肝炎， 所述以具有2个或以上双键的-9不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物 是具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸的醇酯、 以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱 和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油单酯、 甘油二酯和 / 或甘油三酯、 或者磷脂， 所述以具有 2 个 或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油三酯含有的具有 2 个或以上双键的 -9不。
5、饱和脂肪酸相对于组成所述甘油三酯的总脂肪酸为20以上， 所述具有2个或以上 双键的 -9 不饱和脂肪酸为至少一种选自 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:29)、 8， 11- 二十碳二 烯酸 (20:29) 及 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:39) 的 -9 不饱和脂肪酸。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其中所述以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱 和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油三酯是通过对属于被孢霉属 (Mortierella)、 耳霉属 (Conidiobolus)、 腐霉属 (Pythium)、 疫霉属 (Phytophthora)、 青霉属 (Penicillium)。
6、、 枝 孢属 (Cladosporium)、 毛霉属 (Mucor)、 镰孢属 (Fusarium)、 曲霉属 (Aspergillus)、 红酵 母属 (Rhodotorula)、 虫霉属 (Entomophthora)、 刺孢囊霉属 (Echinosporangium)、 水霉属 (Saprolegnia) 的并可产生花生四烯酸的微生物进行突变处理而得到的 12 去饱和活性 低下或缺乏的微生物在培养基中培养， 并自培养物提取而得到的。 3. 具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸或以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱 和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物的用途， 其用于制备对伴随肝损伤的肝。
7、脏疾病具有预防或 改善作用的组合物或饮食品， 其中所述伴随肝损伤的肝脏疾病是病毒性肝炎、 醇性肝炎或 脂肪型肝炎引起的急性肝炎或慢性肝炎， 所述以具有2个或以上双键的-9不饱和脂肪酸 为组成脂肪酸的化合物是具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸的醇酯、 以具有 2 个 或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油单酯、 甘油二酯和 / 或甘油三酯、 或 者磷脂， 所述以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油三酯含有 的具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸相对于组成所述甘油三酯的总脂肪酸为 20 以上， 所述具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪酸。
8、为至少一种选自 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:29)、 8， 11-二十碳二烯酸(20:29)及5， 8， 11-二十碳三烯酸(20:39)的-9不 饱和脂肪酸。 4. 根据权利要求 3 所述的用途， 其中所述以具有 2 个或以上双键的 -9 不饱和脂肪 酸为组成脂肪酸的甘油三酯是通过对属于被孢霉属、 耳霉属、 腐霉属、 疫霉属、 青霉属、 枝孢 属、 毛霉属、 镰孢属、 曲霉属、 红酵母属、 虫霉属、 刺孢囊霉属、 水霉属的并可产生花生四烯酸 的微生物进行突变处理而得到的 12 去饱和活性低下或缺乏的微生物在培养基中培养， 并自培养物提取而得到的。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的。
9、用途， 其中所述饮食品为功能性食品、 营养补助食品、 特 定保健用食品或老人用食品。 权 利 要 求 书 CN 1842329 B1/8 页 3 伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂 技术领域 0001 本发明涉及以-9不饱和脂肪酸为活性成分或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪 酸的化合物为活性成分的针对伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂、 涉及对伴随肝损 伤的肝脏疾病具有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并涉及其制备方法。 更具体地， 本发 明涉及以选自 -9 不饱和脂肪酸、 -9 不饱和脂肪酸的醇酯、 以 -9 不饱和脂肪酸为组 成脂肪酸的甘油单酯、 甘油二酯、 甘油三酯和磷脂中的至少之一为活。
10、性成分的针对伴随肝 损伤的急性或慢性肝炎、 急性肝功能衰竭、 肝硬变和 / 或肝细胞癌的预防剂或改善剂、 涉及 具有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并涉及其制备方法。 背景技术 0002 由于病毒或多种毒性物质等造成的肝细胞破坏发展而来的肝损伤为引起急性或 慢性肝炎、 进一步地为引起肝硬变、 肝细胞癌等的原因。尤其是急性肝炎与普通肝炎相比， 前者存在自觉症状如恶心、 呕吐、 倦怠感等剧烈、 高烧、 白细胞数增多、 CRP 强阳性、 黄疸也急 剧变坏， 已知有时导致成年前死亡。 另外， 即使没有成年前死亡， 从慢性肝炎到肝硬变、 肝细 胞癌的病例极多， 形成了极多的社会问题。 0003 从肝炎。
11、的原因来看， 特异性感染肝细胞的病毒 ( 甲型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒、 丙 型肝炎病毒、 丁型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒 ) 为主要引起急性肝炎的原因， 其中丙型病毒性 肝炎占日本慢性肝病原因的大半， 实际上占肝细胞癌原因的 90。由于自身免疫机制引 起的肝损伤称为自身免疫性肝病， 其除了自身免疫性肝炎外， 还包括原发性胆汁性肝硬变 (PBC)、 原发性硬化性胆管炎 (PSC) 及其相关疾病。 0004 醇类主要经肝脏代谢， 慢性摄入醇类对肝脏的多种代谢系统产生影响， 从而引起 高尿酸血症、 高脂血症、 高乳酸血症等。脂肪酸的代谢障碍引起中性脂肪的蓄积、 刺激炎性 细胞并引发肝炎， 有时大量饮。
12、酒导致称为重症醇性肝炎的预后不良的急性肝功能衰竭。肝 细胞中脂肪的蓄积起因于饮酒而产生的醇性或肥胖引起的营养过剩， 这通常不会导致肝 炎， 但据报道有时伴随着类似醇性肝炎的炎症， 偶尔最终引起肝硬变的例子。 0005 肝硬变为所有慢性肝损伤的最终结果。在肝细胞障碍与再生的长期重复过程中， 形成了肝脏的纤维化和再生结节。因此， 表现出慢性肝损伤的所有肝脏疾病显示出肝细胞 功能不全和门脉压亢进。在日本约 40 万肝硬变患者的病因几乎都是病毒性的， 特别是由丙 型肝炎病毒引起的为 62， 由乙型肝炎病毒引起的为 15。病毒性肝硬变中肝细胞癌的发 生率高， 这极大影响肝硬变的预后。其他的病因有醇、 药。
13、物及毒性物质、 自身免疫、 胆汁郁 滞、 循环障碍、 代谢异常、 寄生虫等。 0006 作为治疗方法， 对于可避免的病因 ( 醇性、 药剂型 ) 避免病因是最重要的， 对于病 毒性 (HBV、 HCV) 而言目前的治疗法仅为干扰素， 其对 HBV 的效果几乎不可期待， 对 HCV 的效 果仅为 30至 50。最近， 新研发出对于慢性乙型肝炎可与拉米夫定 (lamivudine)( 抗病 毒剂 ) 联用， 对于慢性丙型肝炎可与利巴韦林 (ribavirin)( 抗病毒剂 ) 联用。另一方面， 对于不能清除病毒的病例， 为了减缓肝损坏并抑制向肝硬变的发展， 作为癌的二次或一次 说 明 书 CN 1。
14、842329 B2/8 页 4 预防目的， 可施与糖皮质激素、 甘草皂甙制品、 熊去氧胆酸等 ( 药局 Vol.54， 增刊号， 2003)。 因此， 当前以辅助治疗的肝保护疗法为主体， 尚无无副作用的有效肝炎治疗剂和肝炎诱发 抑制剂 (Medical Digest ； 卷 39(4) ： 1990)。 0007 发明公开 0008 因此， 非常希望研发出可预防或改善伴随肝损伤的肝脏疾病并与食物很好适应的 副作用小的化合物。 0009 本发明者们为了解决上述课题进行了大量研究， 结果发现了显示极好的抑制肝损 伤作用、 预防或改善伴随肝损伤的肝脏疾病、 显示极好的食品适应的 -9 不饱和脂肪酸或。
15、 以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物， 从而完成了本发明。因此， 本发明者们提供 了以-9不饱和脂肪酸为活性成分或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物为活性 成分的针对伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂、 提供了对伴随肝损伤的肝脏疾病具 有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并提供了其制备方法。 0010 更具体地， 本发明提供了以选自 -9 不饱和脂肪酸、 -9 不饱和脂肪酸的醇酯、 以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油单酯、 甘油二酯、 甘油三酯和磷脂中的至少之一 为活性成分的、 针对伴随肝损伤的急性或慢性肝炎、 急性肝功能衰竭、 肝硬变和 / 或肝细胞 癌的预防剂或改善剂 。
16、； 提供了具有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并提供了其制备方 法。 0011 附图简述 ： 0012 图 1 为显示蜜酸 (mead acid) 对半乳糖胺肝损伤中肝功能标志物的效果图。图中 对照代表对照食物组， N-3 代表 DHA 食物组， N-9 代表蜜酸食物组。施用 GalN/LPS 的组为每 组 15 只小鼠， 施用生理盐水的组为每组 3 只小鼠。 0013 图 2 为显示蜜酸对半乳糖胺肝损伤中生存率的效果图。图中对照代表对照食物 组， N-3 代表 DHA 食物组， N-9 代表蜜酸食物组。每组各使用 10 只小鼠。 0014 实施发明的最佳实施方式 0015 本发明涉及以-9。
17、不饱和脂肪酸为活性成分或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪 酸的化合物为活性成分的针对伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂、 涉及对伴随肝损 伤的肝脏疾病具有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并涉及其制备方法。本发明的活性 成分 -9 不饱和脂肪酸是指与脂肪酸的甲基端最接近的双键位于自甲基开始数的第 9 位 碳和第10位碳之间， 具有2个或以上双键， 优选地具有18至22个碳原子数， 可包括例如6， 9- 十八碳二烯酸 (18:2 9)、 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 和 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:3 9) 等， 它们可分别单独使用或组合使用。 0016 另外， 由于。
18、天然存在的 -9 不饱和脂肪酸均为顺式， 本发明优选使用顺式的 -9 不饱和脂肪酸。 0017 已知-9不饱和脂肪酸中如5， 8， 11-二十碳三烯酸(20:3 9， 也称为蜜酸(mead acid) 和 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 可作为缺乏必需脂肪酸的动物组织的组成脂肪 酸之一而存在。 0018 这些不饱和脂肪酸在体内可成为白三烯 3 类的前体， 其生理活性是很有前景的， 已发明了 “用白三烯 B4(LTB4) 作为医学疾病的预防剂和改善剂” ( 特开平 07-041421)、“介 导迟发型超敏反应的医学疾病的预防剂和改善剂” ( 特开平 08-053349)、“引起软骨。
19、组织异 说 明 书 CN 1842329 B3/8 页 5 常的疾病的预防药或治疗药” (WO97-05863)， 报道了其适用于抗炎、 抗过敏、 抗关节炎和变 形性关节病。然而， 根据现有技术， 不能预见其对伴随肝损伤的肝脏疾病的预防作用， 而本 发明首次使用本发明的肝损伤模型动物评估而明确。 0019 本发明的活性成分为 -9 不饱和脂肪酸， 并且可使用以 -9 不饱和脂肪酸为组 成脂肪酸的所有化合物。对于以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物， 可以游离脂肪 酸形式使用， 也可包括可药用的 -9 不饱和脂肪酸盐， 如钠盐、 钾盐、 锂盐或其它的碱金属 盐、 锌盐、 钙盐、 镁盐等。另。
20、外， 可例举 -9 不饱和脂肪酸的低级醇酯如 -9 不饱和脂肪酸 甲酯、 -9 不饱和脂肪酸乙酯等。此外， 可使用以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油 单酯、 甘油二酯、 甘油三酯、 磷脂和糖酯等。另外， 本发明不限于上述， 可利用以 -9 不饱和 脂肪酸为组成脂肪酸的所有化合物。 0020 本发明使用的-9不饱和脂肪酸或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物 可为任何来源。即， 它们可来自能产生 -9 不饱和脂肪酸或以 -9 不饱和脂肪酸为组成 脂肪酸的化合物的微生物， 其也可由缺乏必需脂肪酸的动物组织、 缺乏必需脂肪酸的动物 培养细胞产生， 也可通过化学或酶法合成， 另外也可从天然物质。
21、如自动物软骨提取、 分离和 纯化而产生。 0021 但是， 考虑到应用于食品时， -9 不饱和脂肪酸优选地为甘油单酯、 甘油二酯、 甘 油三酯或磷脂的形式， 特别优选地为甘油三酯的形式。虽然不存在包含 -9 不饱和脂肪酸 的甘油三酯 ( 与含有的部分或全部组成脂肪酸为 -9 不饱和脂肪酸的甘油三酯同义 ) 的 丰富来源， 本发明者们使得以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油三酯可工业应用。通 过提供肝损伤模型动物， 首次阐明了本发明活性成分的效果， 明确了对伴随肝损伤的肝脏 疾病具有预防或改善效果。 0022 可产生包含 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 的微生物例如为通过 对属于。
22、被孢霉属 (Mortierella)、 耳霉属 (Conidiobolus)、 腐霉属 (Pythium)、 疫霉属 (Phytophthora)、 青霉属 (Penicillium)、 枝孢属 (Cladosporium)、 毛霉属 (Mucor)、 镰孢属 (Fusarium)、 曲霉属 (Aspergillus)、 红酵母属 (Rhodotorula)、 虫霉属 (Entomophthora)、 刺孢囊霉属 (Echinosporangium)、 水霉属 (Saprolegnia) 的并可产生花生四烯酸的微生物 进行突变处理而得到的 12 去饱和活性低下或缺乏的微生物。 0023 可产生。
23、花生四烯酸的微生物能从作为培养基成分的碳源生物合成硬脂酸 (18:0)， 硬脂酸在9去饱和酶的作用下转化为油酸(18:1 9)， 油酸在12去饱和酶的作用下转 化为亚油酸 (18:2 6)， 亚油酸在 6 去饱和酶的作用下转化为 - 亚麻酸 (18:3 6)， -亚麻酸在延伸酶的作用下转化为二高-亚麻酸(20:3 6)， 二高-亚麻酸在5去 饱和酶的作用下转化为花生四烯酸(20:4 6)。 但是， 当阻断12去饱和酶时， 由6去饱 和酶自油酸生物合成产生 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:2 9)， 在延伸酶的作用下自 6， 9- 十八 碳二烯酸生物合成产生 8， 11- 二十碳二烯酸 (20。
24、:2 9)， 然后在 5 去饱和酶的作用下自 8， 11- 二十碳二烯酸生物合成产生 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:39)。 0024 具体地， 作为可产生包含 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 的微生物， 包括 但不限于通过对特开平 5-91888 号所述的可产生花生四烯酸的微生物进行突变处理而得 到的、 具有 5 去饱和酶活性和 6 去饱和酶活性且 12 去饱和酶活性低下或缺乏的微 生物， 例如高山被孢霉 (Mortierellaalpina)SAM1861(FERM BP-3590)( 根据布达佩斯条约 说 明 书 CN 1842329 B4/8 页 6 进行的国际。
25、保藏， 于 1991 年 9 月 30 日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生 物保藏中心 ( 茨城县筑波市东 1 丁目 1 号 1 中央第 6) ； 进一步地， 对可产生花生四烯酸 的微生物进行突变处理而得到的、 12 去饱和酶活性低下或缺乏且在具有 5 去饱和活 性、 6 去饱和活性和 / 或链延伸活性中的至少之一得以提高的微生物， 例如高山被孢霉 SAM2086(FERM BP-6032)( 根据布达佩斯条约进行的国际保藏， 于 1996 年 8 月 5 日保藏于 独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 ( 茨城县筑波市东 1 丁目 1 号 1 中央 第 6)( 自 199。
26、6 年 8 月 5 日保藏的国内保藏 FERM P-15766 于 1997 年 7 月 30 日转移为国 际保藏 )。 0025 为了培养用于本发明的菌株， 将所述菌株的胞子、 菌丝或预培养得到的预培养液 接种至液体培养基或固体培养基并培养。当为液体培养基时， 作为碳源可使用通常使用的 任一碳源， 包括但不限于葡萄糖、 果糖、 鼠李糖、 蔗糖、 麦芽糖、 可溶性淀粉、 糖蜜、 甘油和甘 露糖醇等。 0026 作为氮源， 可使用蛋白胨、 酵母提取物、 麦芽提取物、 肉膏、 酪蛋白氨基酸、 玉米浆、 大豆蛋白、 脱脂大豆、 棉籽碾碎物等天然氮源、 尿素等有机氮源、 以及硝酸钠、 硝酸铵、 硫酸 。
27、铵等无机氮源。此外， 根据需要， 可将磷酸盐、 硫酸镁、 硫酸铁、 硫酸铜等无机盐和维生素等 作为微量营养源使用。对这些培养基成分只要不为损害微生物生长的浓度， 并无特定的限 制。实践中， 碳源的总添加量通常为 0.1 至 40 重量， 优选地为 1 至 25 重量， 氮源的总 添加量通常为 0.1 至 20 重量， 优选地为 1 至 10 重量， 可在培养开始时或在培养过程中 为了达到总碳源量和总氮源量而添加碳源及氮源。 0027 -9 不饱和脂肪酸产生菌的培养温度虽然取决于所使用的微生物， 但可在 5 至 40， 优选地在20至30， 或在20至30培养使菌体增殖然后在5至20继续培养， 。
28、从而 产生不饱和脂肪酸。通过这样的温度管理， 所产生的脂肪酸中高度不饱和脂肪酸的比例可 上升。培养基的 pH 为 4 至 10， 优选地为 5 至 9， 通过通气搅拌培养、 振荡培养或静置培养进 行。培养通常进行 2 至 30 天， 优选地为 5 至 20 天， 更优选地进行 5 至 15 天。 0028 进一步地， 作为提高含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 中 -9 不饱和 脂肪酸比例的方法， 可对含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂进行选择性加水分解而得到高含 有 -9 不饱和脂肪酸的油脂。所述选择性加水分解所使用的脂肪酶对甘油三酯不具有位 置特异性， 由于加水分解活性与双键数成。
29、反比， 不为高度不饱和脂肪酸的脂肪酸酯键被加 水分解。这样， 所产生的 PUFA 部分甘油酯间的酯交换反应等产生高度不饱和脂肪酸提高的 甘油三酯(Enzymatic Fractionation and Enrichment of n-9 PUFA， J.Am.OilChem.Soc.， 80， 37-42(2003)。 0029 因此， 可将对含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 进行选择性加水分解 而得到的高含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 作为本发明的活性成分。相对于 含有本发明 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 的总脂肪酸， -9 不饱和脂肪酸的比 。
30、率优选地高， 以排除其他脂肪酸的影响， 其中所述 -9 不饱和脂肪酸具体而言为至少一种 或一种以上选自 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:2 9)、 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 及 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:3 9) 的 -9 不饱和脂肪酸。 0030 然而， 本发明不限于高比率， 在实际中， 当应用于食品时有时会碰上 -9 不饱和 脂肪酸的绝对量， 基本上可使用含有-9不饱和脂肪酸20重量或以上， 优选地30重量 说 明 书 CN 1842329 B5/8 页 7 或以上， 更优选地40重量或以上的油脂(甘油三酯)。 进一步地， 基本上可使用含有5， 8， 。
31、11- 二十碳三烯酸 (20:3 9)10重量或以上， 优选地 20重量或以上， 更优选地 30重 量或以上的油脂 ( 甘油三酯 )。 0031 自可产生 -9 不饱和脂肪酸的微生物的培养菌体开始， 通过菌体破坏， 根据需要 使干燥， 用有机溶剂例如正己烷等进行提取处理或通过用超临界碳酸气提取处理可获得含 有-9不饱和脂肪酸的油脂。 另外， 对上述油脂进行加水分解和酯化操作可获得含有-9 不饱和脂肪酸的游离脂肪酸混合物或脂肪酸酯混合物。接下来， 对上述游离脂肪酸混合物 或脂肪酸酯混合物通过常规的尿素分级法、 液液分配色谱、 柱层析等， 可获得纯度 80或以 上的游离脂肪酸 6， 9- 十八碳二。
32、烯酸、 8， 11- 二十碳二烯酸及 5， 8， 11- 二十碳三烯酸以及脂 肪酸酯。 0032 另外， 本发明的活性成分 -9 不饱和脂肪酸不必限于高纯度的纯化品， 也可使用 以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物， 具体而言为含有 -9 不饱和脂肪酸的甘油 单酯、 甘油二酯、 甘油三酯、 磷脂和糖脂。此外， 可将以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的 化合物单独使用或与含有 -9 不饱和脂肪酸的游离脂肪酸混合物或脂肪酸酯混合物组合 使用。 0033 本发明涉及以-9不饱和脂肪酸为活性成分或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪 酸的化合物为活性成分的针对伴随肝损伤的肝脏疾病的预防剂或改善剂、 涉及。
33、对伴随肝损 伤的肝脏疾病具有预防或改善作用的组合物或饮食品， 并涉及其制备方法。作为本发明对 象的伴随肝损伤的肝脏疾病， 可列举如病毒性肝炎、 药物性肝炎、 醇性肝炎或脂肪型肝炎等 引起的急性肝炎或慢性肝炎等。 进一步地， 作为考虑了这些肝炎发展而发病的疾病， 可列举 急性肝功能衰竭、 肝硬变、 肝细胞癌等。 0034 对伴随肝损伤的肝脏疾病具有预防或改善作用的饮食品的制备方法中， 可将 -9 不饱和脂肪酸和/或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物单独使用， 或与基本上不 含有-9不饱和脂肪酸的饮食品原料或与既使含有也仅含有少量-9不饱和脂肪酸的饮 食品原料组合使用。 0035 特别地， 在。
34、组成脂肪酸的部分或全部为 -9 不饱和脂肪酸的甘油三酯的情况下， 油脂 ( 甘油三酯 ) 可用于无数种用途， 可作为食品、 饮料、 化妆品、 医药品的原料和添加物。 因此， 对其使用目的、 使用量无任何限制。 0036 例如， 作为食品组合物， 除了一般食品外， 可例举功能性食品、 营养品、 补助食品、 早产儿配方奶、 婴幼儿配方奶、 婴幼儿食品、 孕产妇食品或老人用食品等。 此外， 根据医生的 处方在营养师的管理下， 在医院调配饭食时可向任一食品中加入本发明的 -9 不饱和脂 肪酸和/或以-9不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的化合物， 以当场制备好的食品形式施与患 者。 0037 作为含油脂的食品例。
35、如有肉、 鱼和坚果等本身含有油脂的天然食品、 汤等在烹调 时加入了油脂的食品、 油炸圈饼 (donut) 等作为热介质而使用油脂的食品、 奶油等油脂食 品、 小甜饼干等加工时加入油脂的加工食品、 或硬饼干等加工结束时喷或涂上油脂的食品。 进一步地， 可将油脂添加至不含油脂的农产品、 发酵食品、 畜产品、 水产品或饮料中。 进一步 地， 它们可为功能性产品或药品的形式， 例如可为经肠营养剂、 粉末剂、 颗粒剂、 片剂、 内服 液、 悬液、 乳液、 糖浆等加工形式。 说 明 书 CN 1842329 B6/8 页 8 0038 另外， 本发明的组合物除了含有本发明的活性成分外， 还可含有通常在饮食。
36、品、 药 品或准药品中使用的多种载体或添加物。 特别优选地含有防止本发明的活性成分氧化的抗 氧化剂。 抗氧化剂包括例如生育酚、 黄酮衍生物、 叶甜素、 曲酸、 没食子酸衍生物、 儿茶酸、 款 冬酸、 棉酚、 吡嗪衍生物、 芝麻酚、 愈创木酚、 愈创木酸、 对香豆酸、 去甲二氢愈创木酸、 固醇 类、 萜类、 核酸碱基类、 类胡萝卜素类和木素类等天然抗氧化剂、 以及以抗坏血酸 - 棕榈酸 酯、 抗坏血酸 - 硬脂酸酯、 丁基羟基苯甲醚 (BHA)、 丁基羟基甲苯 (BHT)、 单 - 叔丁基羟基醌 (TBHQ) 和 4- 羟甲基 -2， 6- 二叔丁基酚 (HMBP) 为代表的合成抗氧化剂。 00。
37、39 在生育酚中， 作为相关化合物， 可提及 - 生育酚、 - 生育酚、 - 生育酚、 - 生 育酚、 - 生育酚、 - 生育酚、 - 生育酚和生育酚酯 ( 生育酚乙酸酯等 ) 以及生育三烯 酚。在类胡萝卜素中可提及例如 - 胡萝卜素、 角黄素、 虾青素等。 0040 本发明的组合物除了包含本发明的活性成分外， 还可包含作为载体的多种载体、 补充剂、 稀释剂、 填充剂、 分散剂、 赋形剂、 结合剂溶剂 ( 如水、 乙醇、 植物油 )、 助溶剂、 缓冲 剂、 溶解促进剂、 胶凝剂、 混悬剂、 小麦粉、 米粉、 淀粉、 玉米淀粉、 多糖、 乳蛋白、 胶原、 米油、 卵磷脂等。作为添加剂， 包括但不。
38、限于例如维生素类、 甜味剂、 有机酸、 着色剂、 香料、 防湿 剂、 纤维、 电解质、 矿物质、 营养素、 抗氧化剂、 防腐剂、 芳香剂、 湿润剂、 天然食物提取物、 蔬 菜提取物等。 0041 当本发明的活性成分实际应用于饮食品时， 食品中混合的 -9 不饱和脂肪酸的 绝对量也变得重要。 但是， 在食品中混合的绝对量也随所混合的饮食品的摄取量而变化， 因 此当将含有组成脂肪酸的一部分或全部为 -9 不饱和脂肪酸的甘油三酯的甘油三酯与食 品混合时， 以 -9 不饱和脂肪酸的量为 0.001 重量或以上、 优选地 0.01 重量或以上、 更优选地0.1重量或以上进行混合。 进一步地， 对5， 8。
39、， 11-二十碳三烯酸， 可使用0.0003 重量或以上、 优选地0.003重量或以上、 更优选地0.03重量或以上， 并且根据常规的 制备法进行加工制备。 0042 以对伴随肝损伤的疾病的预防改善或健康维持为目的， 作为标准， 将含有本发明 的脂肪酸的饮食品以每天经口摄入本发明的脂肪酸 0.001g 至 10g， 优选地 0.001g 至 5g， 更 优选地 0.001g 至 2g。 0043 本发明的组合物作为药品使用时， 可按照制剂技术领域惯用的方法如日本药典中 所记载的方法或根据所述方法的方法制造。 0044 本发明的组合物作为药品使用时， 对组合物中的活性成分的混合量没有特别的限 制。
40、， 只要能达到本发明的目的即可， 可使用合适的混合比例。 0045 本发明的组合物作为药品使用时， 可以为任何剂型， 只要经口施与或非经口施与 可行即可， 例如可列举注射剂、 输注液、 散剂、 颗粒剂、 锭剂、 胶囊剂、 肠溶剂、 片剂、 内用液 剂、 悬浮剂、 乳剂、 糖浆剂、 外用液剂、 湿布剂、 滴鼻剂、 滴耳剂、 滴眼剂、 吸入剂、 软膏剂、 洗 剂、 坐剂等， 它们可根据相应的症状分别使用， 特别地， 优选经口施与。这些制剂可按照常 规方法根据目的在主要成分中使用已知的辅助剂进行制剂， 其中所述已知的辅助剂为稳定 剂、 防氧化剂、 赋形剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂、 矫味剂等在药。
41、物的制剂技术领域通常可使 用的辅助剂。 0046 本发明的组合物的施与量根据年龄、 体重、 症状、 施与次数等而不同， 例如成人 ( 约 60kg) 一天施用本发明的 -9 不饱和脂肪酸和 / 或以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪 说 明 书 CN 1842329 B7/8 页 9 酸的化合物以-9不饱和脂肪酸换算通常约0.001g至20g， 优选地0.01g至10g， 更优选地 0.05g 至 5g， 最优选地 0.1g 至 2g， 一日 1 次 -3 次施与。进一步地， 以 5， 8， 11- 二十碳三烯 酸换算通常约 0.0001g 至 10g， 优选地 0.001g 至 5g， 更优选地。
42、 0.01g 至 2g， 最优选地 0.05g 至 2g， 一日 1 次 -3 次施与。 0047 知道了本发明的活性成分脂肪酸为在生物体内缺乏必需脂肪酸的状态下被生物 合成的生物体组分。 通过对7周龄的ICR雄性小鼠以2g/kg/天连续施与(经口施与)2周， 没有观察到任何异常的症状， 可见在安全性方面也是良好的。 0048 实施例 ： 0049 下面通过实施例对本发明进一步具体地说明。但是， 本发明不限于这些实施例。 0050 参考例 1 以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的甘油三酯的制备方法 0051 将含有 4葡萄糖和 1酵母提取物的培养基 (pH6.0)5L 置于 10L 发酵罐中，。
43、 于 120灭菌 30 分钟。接种高山被孢霉 (Mortierella alpina) 的突变株 SAM1861 或 SAM2086 的 100ml 预培养液， 通气量 1vvm， 搅拌数为 300 转 / 分钟， 进行 8 天的通气搅拌培养。培养 温度为 ： 培养开始时为 28， 自培养第 2 天下降至 20。培养的第 1 至 4 天， 每天添加 1 的葡萄糖。 0052 培养结束后， 通过过滤、 干燥回收具有以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的菌 体， 自得到的菌体通过己烷提取获得油脂， 经过食用油脂的纯化步骤 ( 脱胶、 脱酸、 脱味、 脱 色 ) 得到含有 -9 不饱和脂肪酸的甘油三酯。
44、 (-9 不饱和脂肪酸在甘油三酯的任一位置 处结合 )。 0053 将得到的油脂 ( 甘油三酯 ) 甲酯化， 对得到的脂肪酸甲酯气相色谱分析时， 培养 SAM1861 株可得到 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:2 9)、 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 和 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:3 9) 占总脂肪酸比例分别为 12.94、 3.29、 16.38 ； 培养 SAM2086 株可得到 6， 9- 十八碳二烯酸 (18:2 9)、 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 和 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:3 9) 占总脂肪酸比例分别为 12.4。
45、1、 3.58、 20.87。 0054 进一步地， 将上述含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 ( 甘油三酯 ) 乙酯化， 因为为含 有 20 5， 8， 11- 二十碳三烯酸乙酯的脂肪酸乙酯混合物， 通过常规的高效液相色谱， 可以 分离纯化 98纯度的 5， 8， 11- 二十碳三烯酸乙酯。 0055 实施例 1 通过肝损伤模型动物评价含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 1 0056 将 8棕榈油 ( 对照食物 ) 添加至市售饲料、 将参考例 1 制备的 6， 9- 十八碳二 烯酸 (18:2 9)、 8， 11- 二十碳二烯酸 (20:2 9) 和 5， 8， 11- 二十碳三烯酸 (20:3 9。
46、) 占总脂肪酸比例分别为 12.94、 3.29、 16.38的比例形成组成脂肪酸的油脂 SUNTGM17 8 ( 蜜酸食物 ) 添加至市售饲料、 以及将含有 22 DHA 的鱼油 5和三油精甘油酯 3的 混合物 (DHA 食物 ) 添加至市售饲料， 施与 4 周龄雄性 ddY 品系小鼠 3 周后， 使用生理盐水 溶解 D- 半乳糖胺和脂多糖分别至 800mg/kg 和 25g/kg， 将它们混合 (GalN/LPS) 并腹膜 内施用。施用 GalN/LPS 6 周后取血， 分离血清， 测定血清中 GPT、 GOT 活性， 确认了虽然施用 GalN/LPS使得诱发了肝损伤， GPT、 GOT活。
47、性上升， 但蜜酸食物组与对照食物组和DHA食物组 相比 GPT、 GOT 活性显著性降低， 蜜酸明显地可抑制肝损伤， 该抑制效果较 DHA 强 ( 图 1)。 0057 实施例 2 通过肝损伤模型动物评价含有 -9 不饱和脂肪酸的油脂 2 0058 将8棕榈油(对照食物)添加至市售饲料、 与实施例1同样的SUNTGM17 8(蜜 说 明 书 CN 1842329 B8/8 页 10 酸食物 ) 添加至市售饲料、 以及将含有 22 DHA 的鱼油 5和三油精甘油酯 3的混合物 (DHA食物)添加至市售饲料， 施与4周龄雄性ddY品系小鼠3周后， 使用生理盐水溶解D-半 乳糖胺和脂多糖分别至 80。
48、0mg/kg 和 75g/kg， 将它们混合 (GalN/LPS) 并腹膜内施用。施 用 GalN/LPS 后， 每隔 1 小时调查生存数， 直至 24 小时后。计算生存率时， 蜜酸食物组的生 存率明显高于对照组和 DHA 食物组 ( 图 2)。 0059 实施例 3 通过肝损伤模型动物评价 5， 8， 11- 二十碳三烯酸乙酯 0060 自参考例1制备的油脂SUNTGM17纯化的5， 8， 11-二十碳三烯酸乙酯(蜜酸)10mg/ kg经口施用1周后， 使用生理盐水溶解D-半乳糖胺和脂多糖分别至800mg/kg和25g/kg， 将它们混合 (GalN/LPS) 并腹膜内施用。施用 GalN/LPS 6 周后取血， 分离血清， 测定血清中 GPT、 GOT活性， 在对照食物组中GOT活性为102494 IU/L， 与之相比蜜酸施与组为41337 IU/L， 认为其可显著性抑制肝损伤。 0061 实施例 4 制备胶囊 0062 向明胶 100 重量份和食品添加剂甘油 35 重量份中加水， 50 至 60溶解， 制备粘度 2000cp 的明胶包衣。接下来， 向自参考例 1 制备的以 -9 不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的 油脂 ( 甘油三酯 ) 混合 0.05 重量的维生素 E 油， 制备。