技术领域
本发明涉及一种纳米微粒佐剂、其制备方法和其在制备灭活疫苗中的应用。
技术背景
佐剂是一类先于抗原或与抗原同时作用，能非特异性地改变或增强机体对抗 原的特异性免疫应答的一种物质。佐剂基本通过以下几种可能的方式表现出来： a.增加疫苗抗原的生理或免疫半衰期。b.增加抗原的表面积，改进抗原的携带与 递呈。c.诱导免疫调节细胞因子的产生。d.诱导CD8+细胞毒性T细胞应答。
佐剂不仅是灭活疫苗生产中的重要组成成分，对提高弱毒疫苗的免疫效果也 有作用。尤其在诱导更有效的抗病毒免疫反应中，T细胞免疫的参与是必不可少的。 而目前风行免疫领域的粘膜免疫更是需要佐剂对抗原的保护及导向到作用器官和 组织。没有佐剂，灭活苗及许多遗传工程苗是无法诱导T细胞免疫反应的。另外， 诱导老，幼，弱机体的免疫，平衡T、B细胞免疫，减少疫苗反应及对商品肉质量 的影响都是需要解决的问题。
氢氧化铝胶佐剂是目前唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂，已经广泛用于 人兽疫苗生产。铝佐剂作用机制是其与抗原形成复合物，注射后在局部形成抗原贮 存库，使抗原缓慢释放，从而诱导机体持续的免疫反应。但是铝胶佐剂有许多不足 之处，铝佐剂主要促进体液免疫应答而不能很好地诱导细胞介导的免疫。注射后 局部反应较大，容易形成局部肉芽肿；容易诱导机体的过敏反应。
另一种常见的佐剂为油类佐剂，包括弗氏佐剂、白油佐剂、MF-59。这类佐剂 在免疫应答和免疫持续期方面都有独特的优势，但是用其制备的疫苗粘度通常较 大，难以注射，而且都可不同程度地导致局部产生肉芽肿、无菌性脓肿和炎症反 应，甚至有致癌作用。
常见的佐剂和免疫增强剂还有脂质体、免疫刺激复合物佐剂、CpG序列、细胞 因子、蜂胶、植物皂甙等。上述的佐剂免疫增强效果也确实存在，但它们也有一些 不可避免的缺点，如效果较弱、免疫持续期短、免疫机制不明确或者产品成本高、 效果不稳定。
近年来，纳米技术应用于医学领域，特别是在疫苗佐剂中的应用受到极大重 视。纳米技术是一种在纳米尺度空间内的生产方式和工作方式，并在纳米空间认 识自然、创造一种新的技能。该技术已经应用在信息技术、生物医药、能源环保、 化工等各个研究领域。纳米微粒直径通常介于1～100nm之间，由于纳米微粒具有 小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道等效应，从而使其具有特 殊的吸收、吸附、控释和缓释性能，因此在生物医药领域具有重大的研究价值和 广阔的应用前景。
纳米技术应用于生物医药是指从动植物中提取必要的物质，然后在纳米尺度 进行组合，以最大限度地发挥药效。它不但可大幅度提高药物的活性和生物利用 度，甚至可产生新的药效及降低毒副作用。纳米颗粒的比表面积大、表面反应活 性高、表面活性中心多、黏附能力强等这些优异性质也为疫苗和佐剂研究提供了 新的研究思路。
从免疫学观点来看，采用纳米技术制备的佐剂均匀性好，其包裹或黏附的抗 原颗粒正是巨噬细胞和DC的首选吞噬目标，为实现机体有效的免疫反应完成了重 要的一步。纳米粒子的表面效应可使纳米粒子表面原子与总原子数之比随粒径的 变小而急剧增大后引起性质上的变化，从而使制备的疫苗产生一些新的性质，例 如：A.靶向性，实现了抗原的有效呈递，可进一步提高黏附和刺激抗原提呈细胞 (APC)吞噬的能力。B.缓释性。疫苗进入后，缓慢释放抗原，提高了抗原生物利 用度，充分加工处理抗原，表达抗原，免疫效应比较持久。C.显著提高免疫细胞 数量，增强淋巴细胞增殖活性及白细胞介素-2的诱生活性。D.促进粘膜免疫，用 含纳米粒子的疫苗进行免疫接种，会导致粘膜层和胃肠道粘膜表面发生免疫反应。 其机理可能是：当疫苗进入动物体内后，抗原提呈细胞将抗原物质传递给淋巴样 细胞，B淋巴母细胞通过肠系膜淋巴结被运送到不同的粘膜位点，导致产生分泌型 IgA抗体，它存在于内脏及腺体组织、泌尿生殖道、呼吸道等部位，从而可提高机 体的免疫反应。
用作疫苗佐剂纳米粒子可持久释放被包裹的抗原，加强吸收作用，促进机体 免疫系统对被纳米粒子结合抗原的免疫反应。与氢氧化铝等传统佐剂相比，产生 抗体的滴定率要高10～100倍。纳米控释系统用于输送抗原或疫苗的前景亦很光 明。表面修饰的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时能使抗原结构更趋 稳定，注射后引起强烈的、特异的免疫反应，普通佐剂则无此功能。
发明内容
本发明一方面涉及一种纳米微粒佐剂，其特征在于所述佐剂的成份含有矿物 油、表面活性剂、免疫增强剂。其中，以100ml佐剂混合物计，表面活性剂1-20ml， 免疫增强剂0.1-10g。并且，所述微粒采用微粒度测定仪(LKY-3型)所测得的直 径为10～200nm，可采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌。所述矿物油选自注射用 白油或轻质液体石蜡；所述表面活性剂选自司班-80、-85、吐温-80、吐温-85、单 硬脂酸甘油酯或Arlacel A；所述免疫增强剂为硬脂酸铝、纯化的黄芪多糖、黄芩 甙、壳聚糖和卵磷脂中的一种或多种。
另一方面，本发明上述纳米微粒佐剂中的矿物油可用可以代谢的动植物油代 替。所述的动植物油包括棉籽油、花生油、杏仁油或角鲨烯等，可减少动物机体 的疫苗副反应。
本发明另一方面涉及本发明纳米微粒佐剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)向水中加入免疫增强剂和表面活性剂制成佐剂水相；
2)向矿物油中加入免疫增强剂和表面活性剂制成佐剂油相；
3)在搅拌水相的过程中加入的油相进行充分乳化，制成水包油乳液；
4)然后将乳液采用高压均质机进行纳米处理；
5)采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌。
其中，以100ml佐剂混合物计，表面活性剂1-20ml，免疫增强剂0.1-10g；其 中所述乳化剂选自吐温80、吐温85、司班80、司班85、单硬脂酸甘油酯或Arlacel A中的一种或两种；所述免疫增强剂为硬脂酸铝、纯化的黄芪多糖、黄芩甙、壳 聚糖和卵磷脂中的一种或多种。
针对该方法，可以用代替上述方法中的矿物油，所述动植物油选自棉籽油、 花生油、杏仁油或角鲨烯。所述动植物油是一种可在体内代谢的油。
再一方面，本发明涉及一种疫苗，其含有本发明的纳米微粒佐剂和抗原，其 中抗原和佐剂比例在1:1～15:1之间。其中，所述疫苗为口蹄疫灭活疫苗、禽流感 灭活疫苗、支原体灭活疫苗、新城疫灭活疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、猪 伪狂犬灭活疫苗细菌或病毒灭活疫苗。
再一方面，本发明涉及本发明纳米微粒佐剂在制备免疫疫苗中的用途，其中 所述免疫疫苗为口蹄疫灭活疫苗、禽流感灭活疫苗、支原体灭活疫苗、新城疫灭 活疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗等细菌或病毒灭活疫苗。
换言之，本发明的目的是提供一种纳米微粒佐剂，其制备方法及其在灭活疫 苗中的应用。
本发明的技术方案是：采用数种免疫增强剂按照免疫学技术进行组合，并利 用水油亲和平衡技术和纳米技术进行工艺处理，从而获得一种新型的纳米微粒佐 剂。该佐剂用于支原体灭活疫苗和牛传染性鼻气管炎灭活疫苗、新城疫灭活疫苗 能够显著增强抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。
所述纳米微粒佐剂的制备方法如下：
1)向水中加入免疫增强剂、可选择的加入的防腐剂制成佐剂水相；
2)向矿物油中加入免疫增强剂和表面活性剂制成佐剂油相；
3)在搅拌水相的过程中加入的油相进行充分乳化，制成水包油乳液；
4)然后将乳液采用高压均质机进行纳米处理；
5)采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌。
其中，以100ml佐剂混合物计，含表面活性剂1-20ml，免疫增强剂0.1-10g。
本发明的佐剂在牛支原体灭活疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗、牛传染性鼻气 管炎灭活疫苗、新成灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、口蹄疫灭活疫苗中显示了很 好的免疫增强效果。佐剂使用时直接将佐剂与抗原按照合适的比例进行充分混合 即可，不需要疫苗乳化设备。佐剂使用比例广泛，可按1:1～1:15比例配苗，在佐 剂含量仅为6％的情况下仍能保持稳定的乳剂。
本发明的佐剂与现有的商品化佐剂具有下列优点和效果：(1)配苗工艺简单， 不需大型的乳化设备，大大减少了污染的机率和生产成本；(2)具有独特的稳定 性，37℃放置一年无分层或破乳现象；(3)粘稠度低，便于注射；(4)无疫苗副 反应，注射部位无肉芽肿或炎症反应；(5)疫苗免疫周期较长；(6)疫苗免疫效 果理想，可同时诱导体液免疫和细胞免疫；(7)佐剂使用比例小，提升了抗原空 间，是制备多价苗或多联苗的理想选择。
具体实施方式
结合实施对本发明做进一步描述和论证，但本发明之内容并不局限于此。
高压均质机，型号，来源(加拿大AVESTIN公司EmusiFlex-C5型)
实施例1
1.佐剂水相的制备：向每100ml水中加入0.4g的黄芩甙、2ml的吐温-80，充 分溶解；
2.佐剂油相的制备：向每100ml注射用白油中加入2g硬脂酸铝、2ml的司班 -80；
3.将水相和油相按照1:1比例进行乳化混合；
4.将乳液采用高压均质机进行纳米处理；
5.采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌得佐剂1。
实施例2
1.佐剂水相的制备：向100ml水中加入10g的壳聚糖、10ml吐温-80，充分 溶解，混合；
2.佐剂油相的制备：向100ml注射用白油中加入1g硬脂酸铝、10ml的司班 -80，充分混合；
3.将水相和油相按照5:1比例进行乳化混合。
4.将乳液采用高压均质机进行纳米处理；
5.采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌得佐剂2。
实施例3
1.佐剂水相的制备：向100ml水中加入2g的黄芪多糖、3ml吐温-80，充分 溶解，混合；
2.佐剂油相的制备：向100ml注射用白油中加入6g的卵磷脂、7ml的司班-80， 充分溶解；
3.将水相和油相按照2:1比例进行乳化混合；
4.将乳液采用高压均质机进行纳米处理；
5.采用0.22μm微孔滤膜进行滤过除菌得佐剂3。
实验例
实验例1 佐剂免疫增强效果对比测试
1.材料与方法
1)实验动物：8～10周龄SPF Balb/c小鼠
2)病毒抗原：新城疫灭活抗原(Lasota株)
3)试验分组：制备本发明佐剂和比较佐剂，按照下述佐剂分组，抗 原与佐剂比例为1:1。
佐剂1：抗原与佐剂各占50％。
佐剂2：抗原与佐剂各占50％。
佐剂3：抗原与佐剂各占50％。
比较佐剂1组：实施例1佐剂，不经过纳米处理。
比较佐剂2组：佐剂中含5％的吐温80、5％的司班80、30％的注射用白油。 经过纳米处理。
比较佐剂3组：含5％的吐温80、5％的司班80、30％的注射用白油。不经过 纳米处理。
比较佐剂4组：含2％的植物皂甙、5％的吐温80的佐剂混合物，经过纳米处 理。
比较佐剂5组：氢氧化铝胶佐剂。
比较佐剂6组：氢氧化铝胶佐剂，经纳米处理
比较佐剂7组：磷酸盐缓冲液中加入2％吐温80。
2.步骤
1)免疫：每只小鼠颈部皮下接种0.2ml，免疫后21天采血测定血凝抑制抗体效 价。
2)疫苗进行稳定性测定：取疫苗分别3000rpm离心15分钟和37℃条件下放置2 月，观察是否有分层和破乳。
3.结果与分析
1)采用不同佐剂配制新城疫灭活疫苗，进行免疫效果测试和疫苗稳定性测定， 结果如下：
佐剂 HI效价(几何平均值，Log2) 疫苗稳定性
佐剂1 7.52 无分层和破乳
佐剂2 7.35 无分层和破乳
佐剂3 7.04 无分层和破乳
比较佐剂1 6.02 有分层
比较佐剂2 6.38 无分层
比较佐剂3 5.61 有分层
比较佐剂4 4.50 无分层
比较佐剂5 5.33 有分层
比较佐剂6 5.40 有少量分层
比较佐剂7 3.48 无分层
结果表明本发明佐剂具有很好的免疫增强作用，而且稳定性良好。 2)疫苗3000rpm离心15分钟和37℃条件下放置2月，均无分层和破乳现象，表 明疫苗稳定性很好。
实验例2 采用不同佐剂配制牛支原体灭活疫苗免疫小白鼠的免疫效果对比试验。
1 材料与方法
1)疫苗配制：采用5倍浓缩的牛支原体灭活抗原，分别选用本发明佐剂和比 较佐剂配制疫苗，具体如下：
佐剂 抗原 佐剂 PBS缓冲液
本发明佐剂1 1ml 2ml 7ml
氢氧化铝胶佐剂 1ml 2ml 7ml
免疫刺激复合物佐剂 1ml 2ml 7ml
2)实验动物及其免疫方法：采用8～10周龄SPF Balb/c小鼠50只，随机分为 5组，每组10只。每只小鼠颈部皮下折射灭活疫苗0.2ml，免疫后21天采血测定 抗体。具体分组如下：
第一组：无佐剂组。1ml的5倍浓缩抗原加9ml PBS缓冲液；
第二组：本发明佐剂组1；
第三组：氢氧化铝比较佐剂组；
第四组：免疫刺激复合物比较佐剂组；
第五组：非免疫对照组。
a.免疫观察和采血：进行免疫注射后每天观察小鼠精神状态和局部反应。21 天后对小鼠进行眼球后静脉采血。血液室温放置一小时后以3000转/分的速度离心 20分钟，吸取血清移至0.5ml离心管中，—20℃保存，备用。
b.抗体测定：采用ELISA试剂盒测定每只小鼠血清中的IgG含量。
3)结果与分析：佐剂1经皮下免疫注射小白鼠后无死亡或明显不良的局部或全 身反应，表明本发明佐剂1对小鼠安全。
表1 免疫后血清中IgG抗体水平测定结果见下表：
组别IgG平均值阳性率无佐剂组0.3046/10本发明佐剂组10.92410/10氢氧化铝比较佐剂组0.6549/10免疫刺激复合物比较佐剂组0.69710/10非免疫对照组0.0240/10阳性对照孔0.3102/2空白孔0.0210/4
通过试验表明，本发明佐剂比较氢氧化铝胶佐剂和免疫刺激复合物佐剂均具 有显著免疫增强效果。
实验例3 本发明佐剂用于牛传染性鼻气管炎(IBR)灭活疫苗的免疫效果试验。
1.材料与方法
a.病毒培养：将IBR病毒用细胞维持液进行适当稀释(一般稀释1：100)， 按1:100的比例接种于生长良好的MDBK单层细胞，置37℃培养2～5d，细胞单 层80％以上出现典型CPE时，收获病毒，置-80℃保存。
b.病毒含量：采用96孔培养板。先将毒种作10倍系列稀释，取10-5、10-6、 10-7、10-8、四个稀释度，每个稀释度接种MDBK细胞4孔，每孔100μl，接种后 置37℃吸附1小后，再补加含2％犊牛血清的DMEM培养基100μl，置37℃培养，定 时观察细胞病变(CPE)4～5天，计算TCID50。
c.病毒灭活：将合格的IBR病毒(每毫升病毒含量≥107.5TCID50为合格)按 病毒总量的0.2％加入甲醛溶液，充分混合装入无菌容器中，密封后置37℃灭活 24h，间隔2～4h振摇一次进行灭活。
d.试验分组：试验分为3组，分别按如下比例直接将抗原与佐剂充分混匀即 可。佐剂采用实施例佐剂1(试验1组)和佐剂3(试验2组)。
试验分组 IBR抗原 本发明佐剂3 PBS缓冲液
抗原对照组 1ml 0 3ml
试验1组 1ml 1ml 2ml
试验2组 1ml 0.4ml 2.6ml
2.步骤
1)免疫接种：采用IBR抗体阴性的健康犊牛，随机分成3组，每组5头。每 头牛肌肉接种2ml，免疫后21天加强免疫一次。分别在二免前和二免后14天采血 分离血清，测定血清中IBR中和抗体。
2)本发明佐剂的其它指标检验：
a.疫苗稳定性检验：取疫苗3000rpm离心15分钟观察分层情况。并于37℃ 条件下放置30天，观察有无分层或破乳。
b.粘稠度测定：于25℃室温用1ml吸管，出口直径为1.2mm，吸取疫苗1ml， 令其垂直流出，记录流出0.4ml所需要的时间。
c.安全检验：皮下注射18～22g小白鼠5只，每只0.5ml，观察小白鼠有无死 亡或明显不良的局部或全身反应，连续观察7d。
3.结果与分析
1)疫苗稳定性检验：取疫苗3000rpm离心15分钟无分层现象，37℃条件下 放置30天也有无分层或破乳现象，表明才用本发明佐剂3配制的疫苗具有很好的 稳定性。
2)粘稠度测定：于25℃室温用1ml吸管，出口直径为1.2mm，吸取疫苗1ml， 垂直流出0.4ml所需要的时间仅为1.8s左右，表明疫苗粘稠度非常理想，便于注 射。
3)安全检验：注射小白鼠后观察7天，无死亡或明显不良的局部或全身反应， 表明疫苗对小白鼠安全。
4)中和试验结果表明，单纯的抗原免疫，其免疫反应较小，中和抗体滴度较 低。但是加入了本发明佐剂3后可使牛体很快产生较高的中和抗体，加强免疫后 抗体效价显著增高。结果如下：
组别 一免后21天 二免后14天
抗原对照组 1:8 1:16
试验1组 1:32 1:128
试验2组 1:16 1:46
以上结果也表明当本发明佐剂3按照抗原/佐剂为9/1的比例使用时仍可以显 著提高中和抗体滴度，提示使用该佐剂可大大提升抗原空间，为制备多联疫苗提 供了便利。
实验例4 采用不同佐剂配制的新城疫灭活疫苗免疫SPF鸡的免疫效果对比试验。
1.材料与方法
1)抗原：新城疫Lasota株抗原(毒价为109ELD50/0.1ml)
2)试验动物：1～2月龄SPF鸡
3)ND Lasota株抗原灭活：向抗原中加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分 混合。甲醛最终浓度为0.2％，放37℃灭活16小时(灭活温度以瓶内温度达到37 ℃时计)，灭活期间振摇3～4次，灭活结束后置4～8℃保存备用。
4)试验分组：试验分别设白油对照组、ISA206组(法国Seppic公司产品)、佐 剂1组和佐剂2组。
5)疫苗配制：按照以下比例，按常规方法配制。
表2 疫苗配制各成份比例
成份(ml)佐剂1组佐剂2组ISA206组白油组Lasota抗原2828282810％甲醛11111％硫柳汞1111佐剂30306060PBS3030终体积90909090
2.步骤
1)免疫分组：每组10只，每只胸部肌肉注射0.2ml，免疫后21天、42 天采血测定HI抗体效价，同时观察注射部位损伤情况。
2)免疫前和免疫后42天测定各组鸡群的平均增重，观察免疫对鸡群增重 的影响。
3.结果与分析
免疫后21天和42天抗体测定结果表明，本发明佐剂1和佐剂2和Seppic206 佐剂比较在免疫后42天，效果好于206佐剂。与白油佐剂相比，白油佐剂含油量 高达70％，引起的免疫副反应较强，而且影响免疫鸡群的料肉比。具体结果见下 表3。
表3 HI抗体测定结果(Log2)
分组21天42天局部反应佐剂1组5.47.2无损伤、吸收良佐剂2组5.26.6无损伤、吸收良ISA206组6.96.1无损伤、吸收良白油苗组8.08.0轻微的炎症反应、吸收较差
免疫前后统计佐剂对鸡群的增重影响，表明本发明佐剂和对鸡群的增重影 响小于206组和白油组。具体结果见表4。
表4 不同佐剂疫苗对鸡增重的影响
组别免疫前平均体重(g)免疫后42天平均体重(g)平均增重(g)佐剂1组4271061634佐剂2组4241136712ISA206组422922500白油苗组425894469
实验例5 本发明佐剂和传统白油佐剂配制猪伪狂犬灭活疫苗免疫效果对比试验。
1.材料与方法
1)抗原：猪伪狂犬灭活抗原由武汉科前动物生物制品有限责任公司提供
2)试验动物：1月龄健康仔猪(伪狂犬抗体阴性)
3)试验分组：试验分别设佐剂1组(实施例1佐剂)和白油对照组。
4)疫苗配制：按照以下比例，白油组按常规方法配制，佐剂1组直接将其充 分混合即可。
表5 疫苗配制各成份比例
成份(ml)佐剂1组白油组伪狂犬灭活抗原77佐剂714磷酸盐缓冲液70终体积2121
5)免疫分组：每组4头，每头颈部肌肉注射3ml，免疫后28天、60天采血 测定抗体效价。
6)抗体测定：由农业部兽医诊断中心测定。(报告编号：2007717)
2.结果与分析
免疫后28天和60天抗体测定结果表明，本发明佐剂1和白油佐剂免疫效果 均比较理想，并且本发明佐剂免疫效果好于白油组。具体结果见表6。
表6 猪伪狂犬病毒gB抗体(ELISA)测定结果
注：伪狂犬病毒gB抗体≤0.878判为阳性；>0.918判为阴性；之间判为可疑。