技术领域
本发明涉及siRNA领域，具体地说，涉及抑制人Ezrin基因表达 的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用。
背景技术
RNAi是由双链RNA介导的同源靶基因转录后沉默的过程， RNAi可以通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA， 诱导内源靶基因mRNA降解，从而达到减少基因表达的目的。RNAi 技术作为新兴的基因阻断技术，具有明显的优势，它具有高度的特异 性，干扰效率高而且操作简单。因此以及广泛的应用于基因功能研究 以及抗病毒感染、肿瘤治疗等热点领域。
食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重影响人类健康。全 世界食管癌患者术后5年生存率仅为20％-30％。造成食管癌预后 差的一个重要原因是其转移性强，有些病人甚至在确诊时已经发生了 局部组织浸润和淋巴结的转移。
侵袭和转移是多因素参与的、多步骤完成的分子生物学变化过 程。肿瘤细胞具有很强的迁移能力，使得它能克服细胞与细胞间以及 细胞和基质间的粘附作用侵入周围组织。侵袭性强的细胞通常都有细 胞突触多、细胞间粘附减弱以及通讯连接丧失等特点。现在普遍认为 肿瘤细胞的这些恶性征是由于肌动蛋白结合蛋白以及一些相关的连 接蛋白引起的细胞骨架重组所致。
在这些骨架相关蛋白中，我们研究的是Ezrin。Ezrin基因又称 VIL2，定位于染色体6q25.2～q26，其表达产物Ezrin蛋白是ERM (ezrin-radixin-moesin)家族成员之一，主要参与细胞中细胞骨架与胞 膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接粘附分子及调节信号 转导等功能。
越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细 胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示，来自啮齿动物乳腺、人 胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高；同时，Ezrin在多 种人类肿瘤中强烈表达，这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星形细胞 瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等；进一步的研究显示抑制Ezrin蛋 白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞，Ezrin很可能是恶性肿 瘤的关键调节分子。现有的研究还提示Ezrin参与肿瘤细胞的粘附、 凋亡尤其是移动侵袭等生物学过程，并与肿瘤的发生发展密切相关。
食管癌中Ezrin的表达情况最近才得到了初步的阐明，在我们以 往的研究中发现在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEmt 的恶性转化过程中Ezrin发挥着重要的作用。我们最近对食管癌临床 组织样本的研究也揭示食管癌中Ezrin的表达模式发生了改变。然而， Ezrin在食管癌及其它肿瘤中的功能及其表达改变的机制至今仍未得 到很好的阐明。如能应用RNAi技术来抑制食管癌细胞中Ezrin基因 的表达，从而探讨Ezrin在食管癌细胞中的功能，这将有助于从分子 水平阐明Ezrin在这些上皮来源的肿瘤组织细胞表达改变的机制，从 而为揭开食管癌的发病机制及治疗提供有用的线索。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌 细胞移动侵袭研究中的应用。
本发明的上述目的可以通过以下措施实现。
设计抑制Ezrin基因表达的双链siRNA片段：依据Dharmacon 公司在网上提供的设计软件设计了两组siRNA。其碱基序列及作用部 位如下：
E1：(SEQ ID NO：1)
5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATA
GTGGATTTTTGGAAA 3’
5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATC
CACATAGTGGAGGG 3’
作用于人Ezrin mRNA的第274-292；
E2：(SEQ ID NO：2)
5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGC
CAAAGTTTTTTGGAAA 3’
5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAG
TGGAGGCCAAAGTGGG 3’
作用于人Ezrin mRNA的第265-283。
本发明的可以产生抑制人Ezrin基因表达的siRNA的载体，其具 有以下的基本结构：由启动子、Ezrin编码区、终止密码、DNA序列 顺序连接而成的环状双链DNA分子；
启动子为可启动产生siRNA的序列，它是启动它的下游紧邻之 基因的表达的元件；启动子优选polymerase-III H1-RNA基因启动子。
Ezrin编码区为表达权利要求1所述的siRNA的编码区，由19 个核苷酸组成，可采用双向结合或以发夹状结构在细胞内形成双链 RNA；
终止密码为5～6个T；
DNA序列为任何真核质粒载体和/或病毒的介于RNA编码区和 启动子之间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点，或 含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对抗某种抗生素的抗性的基因 或使真核细胞获得某种抗生素的抗性的基因。所述任何真核质粒载体 和/或病毒优选pSUPER.neo载体。所述抗生素抗性基因优选抗生素 G418抗性基因neo。
上述载体pSUPER.neo(Oligoengine)具有以下优点：(1)具有 polymerase-IIIH1-RNA基因启动子，可以产生一个不含多聚腺苷酸尾 的小RNA转录子；(2)可以很精确的启动转录；(3)终止信号包含有 T5；(4)在第二个尿嘧啶的后面终止转录，可以产生和合成的siRNA 相类似的末端，即3’端含两个不配对的胸腺嘧啶或尿嘧啶。这个载 体能在哺乳动物细胞里面稳定的表达siRNA，而且还含有neo基因， 可以用G418筛选转染成功的细胞，建立细胞系，适合于做长期的研 究。
根据pSUPER.neo载体图，我们在线性化载体时采用依次酶切法。 同时由于插入siRNA后的载体其Bgl II的酶切位点将被破坏，因此我 们在连接后转化之前重新用Bgl II处理半小时，把自身环化的载体重 新酶切成线性，以降低平板克隆生长背景，大大提高阳性质粒的筛选 的效率。阳性质粒经EcoRI和Hind III酶切后可获得一287bp的片断， 而空载体则可切出一227bp的片断，因此我们采用了更为敏感的非变 性聚丙烯电泳加银染鉴定的办法进行重组子的筛选。
将构建好的表达载体转染进食管癌细胞系EC109。为获得稳定表 达质粒的细胞，我们首先使用浓度较高的G418进行药物筛选。转染 空白质粒PSC和转染以上siRNA的细胞(分别称为PSE1和PSE2)的 EC109细胞，由于质粒载体上有neo基因，具有G418抗性，因此得以 存活；而相比之下，未转染上述质粒的对照EC109细胞则因G418的毒 性作用而被杀死。为防止连续传代培养过程中，表达质粒的丢失，仍 将细胞置于药物浓度相对较低的生长环境中培养，如果质粒丢失，细 胞仍会因G418的毒性作用而被杀死。在上述条件下，细胞能够持续 生长，表明稳定转染空白质粒和干扰质粒的EC109细胞株已被成功建 立。
筛选出来的细胞株首先进行干扰效果的分析。本发明用RT-PCR 和Western blotting分别从转录和翻译水平进行分析。结果显示无论是 在转录水平还是在翻译水平，干扰后的细胞Ezrin表达均明显降低， 而且转染空白质粒的细胞Ezrin基因的表达未受影响，结果同时还显 示干扰效果的比较为PSE1＞PSE2。此外，连续几代的细胞总蛋白中 Ezrin表达的检测也显示干扰的效果非常的稳定。
确定有良好的干扰效果的siRNA用于以下食管癌细胞粘附、移 动以及侵袭能力的研究。
以未处理的EC109细胞和转染空载体的PSC细胞作对照检测了 Ezrin低表达对细胞粘附的影响。结果显示PSE1、PSE2细胞的粘附 能力明显较PSC和对照EC109的减弱，提示Ezrin表达降低可引起 细胞粘附能力的减弱。
应用Chamber细胞移动实验和细胞侵袭实验分别检测细胞的迁 移和侵袭能力变化，结果显示Ezrin下调表达后细胞的移动性和侵袭 性分别比未处理的EC109细胞减弱了60％和75％，提示Ezrin和细 胞的移动侵袭相关。
为进一步探讨Ezrin影响细胞侵袭的机制，本发明收集细胞培养 上清并作了酶谱分析，结果可见，PSC、PSE1、PSE2和对照EC109 细胞中均出现了分别代表金属蛋白酶MMP-2(72kD)和MMP-9 (92kD)的条带。但PSE1、PSE2中MMP-2和MMP-9的条带均比 PSC、EC109的弱，而PSC和EC109之间则未见明显区别。提示Ezrin 的下调表达使MMP-2和MMP-9的活性减弱，从而影响了细胞的侵 袭性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明设计、合成 了靶向人Ezrin基因的两对siRNA，并成功构建了它们在哺乳动物细 胞内的表达载体。同时，运用这些siRNA可以有效、特异地干扰Ezrin 的表达，建立了食管癌Ezrin低表达细胞株，为深入研究食管癌及其 它Ezrin相关肿瘤中Ezrin的功能打下了坚实的基础。本发明还研究 了Ezrin与食管癌细胞粘附以及移动侵袭的关系，为揭示食管癌的发 病机制以及食管癌的治疗提供了重要线索。
附图说明
图1为siRNA发夹结构示意图；
图2载体构建示意图；
图3为Ezrin基因siRNA哺乳动物内表达载体PSE的酶切鉴定图；
图4为阳性质粒的测序鉴定图；
图5为Ezrin干扰效果的检测；
图6为pSUPER.neo载体图；
图7为移动实验图；
图8为侵袭实验图；
图9为条件培养基酶谱分析结果；
图10为粘附实验图。
其中，图3中，1、2泳道为阳性质粒，3泳道为阴性对照，第4 泳道为100bp DNA marker。图5中，(A)干扰效果的Western blotting 检测；(B)干扰稳定性的检测；(C)干扰效果的RT-PCR检测；β-actin 和GAPDH分别作为的Western blotting和RT-PCR的上样对照。图7 中，(A)穿过的细胞Giemsa染色图，空箭头所示为细胞，实箭头的 为膜上的孔，a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109；(B)穿过的细胞计 数所得的柱形图。图8中，(A)穿过的细胞Giemsa染色图，空箭头 所示为细胞，实箭头的为膜上的孔；a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109； (B)穿过的细胞计数所得的柱形图。图10中，(A)粘附的细胞； a，PSE1；b，PSE2；c，PSC；d，EC109；(B)粘附细胞数比较。
具体实施方式
实施例1靶向Ezrin基因的siRNA设计、合成和退火。
依据Dharmacon公司在网上提供的设计软件设计了两组siRNA 序列，如表1：
表1 siRNA Target Sequence 编号 Region Start 5′T C C A C T A T G T G G A T A A T A A 3′(SEQ ID NO：3) PSE1 ORF 274 5′A C T T T G G C C T C C A C T A T G T3′(SEQ ID NO：4) PSE2 ORF 265
设计的原则如下：
(1)从mRNA的AUG起始密码开始，寻找5’AA(N19)TT，
其中N是任意碱基，结构长度为19bp的序列(如表1)；
(2)目标序列上不能连续出现3个或者三个以上的G或者C；
(3)干扰序列避免在靶基因的首末端；
(4)选择GC含量在30％-52％之间的序列；
(5)靶向ORF区；
(6)挑选的序列在公共数据库中进行同源性比较；
克隆入siRNA表达载体中的DNA片段包括两个短的反向重复序 列，中间由发夹序列分隔，随后接上5-6个T作为RNA聚合酶III的 转录终止子；片段的5’端加BglII的酶切位点，而3’端则含有HindIII 的酶切位点(见图1)。整理好的序列送上海基康生物技术有限公司 合成。
合成的寡核苷酸序列(2OD)加入66μl的无核酸酶水中(终浓 度为1μg/μl)，充分溶解。退火时，在一新的离心管中依次加入下列 试剂(总体积50μl)：siRNA正反义链各3μl，加上44μl的退火缓冲 液(10Mm NaCl，50mM Hepes，pH74)，充分混匀后在PCR仪上完成 以下操作：94℃ 4min，80℃ 4min，75℃ 4min，然后是70℃ 10min， 37℃ 20min，最后冷却到25℃。产物可以直接用于连接或者保存于 4℃。
实施例2表达载体PSE1和PSE2的构建
1.载体的线性化及回收：在离心管中依次加入下列试剂(总体积 50μl)：无菌水37.5μl、pSUPER.neo载体5μl、10×缓冲液B 5μl、乙 酰化BSA(10mg/ml)0.5μl和HindIII(20u/μl)2μl。混匀后，37℃ 水浴孵育1h后继续往混合物中加入Bgl II(20u/μl)2μl，在37℃水 浴再孵育1h。取5μl电泳进行1％琼脂糖凝胶电泳，以未酶切质粒为 对照，鉴定载体是否已成线性。参照Quick PCR purification kit说明 书回收线性pSUPER.neo载体片段。
在酶切混合液中加入5倍体积的PB缓冲液，然后将此混合液转 移至QIAquick spin柱，12000×g离心1min；弃流出液，在QIAquick spin柱加入750μl PE缓冲液，12000×g离心1min，弃流出液；将 QIAquick spin柱放回原收集管，12000×g再离心1min；接着将 QIAquick spin柱转移至一干净1.5ml离心管中，并加入30μl EB缓冲 液于柱中心，室温下放置1min，室温下12000×g离心1min。取2μl 回收液进行电泳，确定回收成功，剩余回收液-20℃冻存备用。
2.将退火后的siRNA连接进线性化的载体中：退火后的siRNA 与线性pSUPER.neo载体的连接。在一新的离心管内依次加入以下试 剂(冰上操作)：2×T4 DNA连接酶缓冲液5μl、线状pSUPER.neo 载体1μl、siRNA 3μl和T4 DNA连接酶1μl，混匀，25℃循环水浴1h。 转化前加入1μl Bgl II处理半小时。
3.将连接产物常规转化进感受态细胞——JM109。生长出的克隆 扩增后提取质粒进行双酶切鉴定：取2μl质粒DNA，加入2μl 10× buffer，2μl乙酰化BSA，8μl无菌水和3μl EcoR I和3μlHindIII限制 性内切酶。37℃水浴4～5h。8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行 银染鉴定，步骤如下：10％乙醇固定30min；1％硝酸处理8min；超 纯水洗两次后用0.2％的硝酸银染色30min，然后在3％无水碳酸钠 与0.1％的甲醛组成的显色液中显色数分钟，最后在10％的冰乙酸中 定影。按照载体图，含有siRNA的重组子经酶切后可见287bp的片 断，而空载体对照则可切出227bp的片断。筛选出的阳性克隆再进行 测序获得表达质粒(图2、3、4)。
实施例3稳定转染及干扰效果的分析
鉴定后的重组子转染进人食管癌细胞系EC109细胞，同时还转染 空载体做对照。为获得稳定表达质粒的细胞，我们首先使用浓度较高 的G418(400μg/ml)进行药物筛选。转染空白质粒PSC和转染以上 siRNA的细胞(分别称为PSE1和PSE2)的EC109细胞，由于质粒载体 上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未转染 上述质粒的对照EC109细胞则因G418的毒性作用而被杀死。为防止连 续传代培养过程中，表达质粒的丢失，仍将细胞置于药物浓度相对较 低的生长环境中培养(200μg/ml)，如果质粒丢失，细胞仍会因G418 的毒性作用而被杀死。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定 转染空白质粒和干扰质粒的EC109细胞株已被成功建立。
转染的方法为：首先，在玻璃试管中加入97μl无血清培养基， 然后直接往里加入3μl FuGENE6(Roche公司)转染试剂，轻轻混匀 后室温下静置5min。取1μg质粒(PSE质粒和pSUPER.neo空载体)加 入以上的混合物中，轻轻混匀。室温下静置15min后，取以上混合物 加入培养皿中，置于5％CO2、湿度95％和37℃条件下培养。24h后， 把培养皿中的培养液换为含有G418(400mg/L)的常规199培养液进 行筛选。14天后，抗药克隆长出，换为培养液中含200mg/LG418的 培养液继续培养，传代扩增。
筛选建立的细胞株用于干扰效果的分析。本发明分别用RT-PCR 和Western blotting的方法从转录和翻译水平进行干扰效果的分析。提 取细胞总蛋白Western blotting分析，结果提示(图5A)PSE1和PSE2 在蛋白水平上对Ezrin均有不同程度的干扰效果，而转染空载体的 PSC和未作处理的EC109细胞之间Ezrin表达无差异，其中PSE1较 对照减弱了87％，而PSE2则为75％。提取细胞总RNA，用人Ezrin 特异性的引物进行RT-PCR，结果显示在RNA水平PSE1和PSE2中 Ezrin的表达均较两个对照减弱，且PSE1＞PSE2(图5C)，这与Western blotting的结果一致。经过连续的传代，分别收获第7、8、9代细胞 总蛋白进行Western blotting检测，以确定干扰的稳定性(图5B)。结 果显示各代均有明显干扰效果而且程度比较稳定。
实施例4Ezrin与EC109细胞移动和侵袭性的关系
应用Chamber细胞移动实验和细胞侵袭实验分别检测细胞的迁 移和侵袭能力变化，结果显示Ezrin下调表达后细胞的移动性和侵袭 性分别比未处理的EC109细胞和PSC细胞减弱了(移动性：PSE1较 对照减弱了60％，PSE2减弱55％；侵袭性：PSE1较对照减弱了75 ％，PSE2减弱60％)，提示Ezrin和细胞的移动侵袭相关(图7、8)。 为进一步探讨Ezrin影响细胞侵袭的机制，本发明收集细胞培养上清 并作了酶谱分析，结果可见，PSC、PSE1、PSE2和对照EC109细胞 中均出现了分别代表金属蛋白酶MMP-2(72kD)和MMP-9(92kD) 的条带。但PSE1、PSE2中MMP-2和MMP-9的条带均比PSC、EC109 的弱，而PSC和EC109之间则未见明显区别(图9)。提示Ezrin的 下调表达使MMP-2和MMP-9的活性减弱，从而影响了细胞的侵袭 性。
移动和侵袭实验的方法：在Transwell侵袭小室(Invitrigen，8μm 滤孔)膜内侧表面均匀涂布60μl Matrigel(BD，Biosciences，原液 11.1mg/ml，用无血清199培养液按1∶3稀释)，室温下放置1h。于小室 上室内分别加入200μl重悬于无血清199培养液中的细胞(含1×105个 细胞)，下室加600μl含10％小牛血清的常规199，置37℃，5％CO2培 养24h。取出小室弃除上室液体，用棉签擦尽上室膜面未穿膜的细胞， 室温下甲醇固定5min，Giemsa常规染色，中性树胶封片，400倍光镜下 计数10个视野的侵袭细胞数，取其平均值，以侵袭细胞的相对数目表 示肿瘤细胞的侵袭能力。每组重复3次。移动实验除了不用在 Transwell小室内表面涂Matrigel外，其余步骤和上述侵袭实验相同。
酶谱法：细胞长成单层后，用1×PBS洗三次，以洗去细胞表面残 留的血清；然后加入5ml不含血清的培养液，37℃，5％CO2中继续培 养，24h后，收集培养液；取1ml此条件培养液用蛋白浓缩柱(Pall公 司)浓缩至约10μl，与2×SDS样品缓冲液等体积混匀进入下一步实 验；剩余条件培养液保存于-20℃。将制备好的样品置于37℃水浴中 温育30min，稍离心后，上样，进行SDS-PAGE电泳(40V下，约需 4h)。电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，2.5％Triton X-100)在室温摇动下洗涤1h，其间换液一 次。然后加入孵育缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl and 10mM CaCl2)没过胶面，用保鲜膜包好平皿，至37℃恒温箱中，其 间换液一次，24h后取出，弃去孵育缓冲液，加入0.1％考马斯亮兰染 液染色约30min，回收染液，加入脱色液(40％甲醇，10％乙酸)脱 色至兰色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中止脱色。用凝 胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值相对定量样品中 酶活性。
实施例5Ezrin与EC109细胞粘附性的关系
以未处理的EC109细胞和转染空载体的PSC细胞作对照检测了 Ezrin低表达对细胞粘附的影响。结果显示PSE1、PSE2细胞的粘附 能力明显较PSC和对照EC109的减弱，其中PSE1减弱了66％，PSE2 减弱了45％，提示Ezrin表达降低可引起细胞粘附能力的减弱(图 10)。
粘附实验实施方法为：参照Malinda等的方法(1999)，取96孔细胞 培养板，在孔的底部均匀涂布50μl的Matrigel(BD，Biosciences，原浓度 10mg/ml，用无血清199培养基10倍稀释使用)。37℃孵育1h后用无血 清199洗去表面未凝凝胶。每孔加入100μl 0.1％BSA，37℃孵育1-2h。 同时用胰酶消化各种细胞并用无血清199制成细胞悬液。弃去封闭液， 用无血清199洗三次后每孔加入4×105细胞，置37℃，5％CO2培养 1h。弃去培养液，无血清199洗三次。每孔加入150μl无血清199和 50μl1mg/ml的MTT，轻轻混匀，置37℃，5％CO2培养3-4h。弃上清， 每孔加入100μlDMSO原液，摇床上混匀10分钟后上酶标仪测定490和 630nm波长A值。每次实验设九个平行孔和三个空白孔(不加凝胶，其 余同)，实验重复三次。
所有实验均表明，本发明所提供的siRNA表达载体能有效的在 哺乳动物细胞内表达siRNA并能特异、高效的干扰Ezrin的表达，为 研究Ezrin提供很好的工具。同时实验还证明Ezrin参与食管癌细胞 的粘附、移动以及侵袭等生物学过程，为研究食管癌的发病机制和治 疗提供线索。
抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110>汕头大学医学院
<120>抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用
<130>
<160>4
<170>Patent In version 3.2
<210>1
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
E1：
5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’
5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’
<210>2
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
E2：
5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTTGGAAA 3’
5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTTGGG 3’
<210>3
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
5′TCCACTATGTGGATAATAA3′
<210>4
<211>
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
5′ACTTTGGCCTCCACTATGT3′