技术领域
本发明涉及真菌来源的多糖作为用于人类和动物健康的药物 组合物或食品补充剂的应用。
背景技术
已知微观真菌和食用真菌具有有益于健康的特性，例如降血 糖、降低血液胆固醇、抗氧化或免疫促进的特性。真菌含有具有与 胃肠道和身体总体健康有关的重要特性的可消化性化合物，被定义 为多糖类饮食纤维。通过降低血液胰岛素浓度、增加小肠内食物的 黏度并减慢碳水化合物吸收，其具有对葡萄糖循环(glucose circulation)发挥作用的特性。因此，真菌具有调节糖代谢的能力。 它们还在动脉血压的调节中发挥作用。如Fukushima et al.，(2000)对 蘑菇(Agaricus bisporus)的纤维的研究(Fukushima M，Nakano M， Morii Y，Ohashi T，Fujiwara Y & Sonoyama K(2000)J.Nutr.130：2151) 表明，含有大量纤维的真菌对于降低血液中的总胆固醇和HDL-胆 固醇的浓度具有有益的作用。因此，其在对高血压和心血管疾病， 更广泛地，对肥胖和代谢综合征的预防中发挥着间接作用。
极少有食品能发挥免疫促进特性。大多数食品导致免疫抑制而 非免疫促进。真菌例如花菇(Lentinus edodes)、舞菇(灰树花，Grifola frondosa)、灵芝(灵芝菌，Ganoderma Lucidum)或巴西菇(姬松 茸，Agaricus blazei murill)为“免疫促进性”食物。免疫促进功能 主要是由于其细胞壁内存在β-葡聚糖类多糖(Lull C，Wichers HJ & Savelkoul HFJ(2005)Antiinflammatory and immunomodulating properties of fungal metabolites.Mediators Inflammation 2：63)。
某些植物纤维被推荐用于预防、抑制或治疗肥胖和肥胖相关疾 病，如源自菊苣菊粉的寡果糖、或昆布多糖(一种源自藻类的β- 葡聚糖)。寡果糖通过在结肠内发酵从而释放能够抑制血浆生长素 (plasmatique en ghreline，一种通常刺激食欲的激素)含量的化合 物而发挥作用。间接地，通过增加饱腹感和减少食物摄入，可观察 到对胆固醇水平和动脉粥样硬化的效应，这是与代谢综合征以及与 心血管疾病相关的多种效应之一。
并且已知壳聚糖(一种由来自有壳水生动物外壳的壳质中获得 的多糖，并被认为是一种纤维)可发挥降低血脂和降低血液胆固醇 的作用。这些效应是由于胃内的食物脂肪酸或胆汁酸(带负电)与 壳聚糖(带正电)之间的相互作用。然而，壳聚糖的缺点在于其来 源于有壳水生动物，其可能引起过敏。
含壳质-葡聚糖共聚物(chitin-glucan copolymer)的组合物的非 食物相关的用途已经为人所知，特别是作为愈合皮肤的活性剂。对 源自黑曲霉(Aspergillus niger)的Mycoton和Mycoran组合物用于 皮肤和瘢痕的特性进行了描述。然而，并未发现任何口服应用，特 别是在食品或制药领域中。
大多数针对真菌来源的纤维的有益效果所开展的研究，是在新 鲜真菌或粉状真菌或可溶于水性介质的β-葡聚糖(通常从植物中提 取)上进行的。然而，这些产品并非最适用于上述指征。
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是提供一组真菌来源的天然物质，其能够提 供食品补充剂或药物组合物，特别是作为平衡饮食和良好卫生规范 的补充而用于改善人类和动物健康，尤其是用于预防和/或对抗诸如 代谢综合征、肥胖、糖尿病和心血管疾病或相关疾病的病状。
本发明的目的还在于提供一组物质，其表现出无懈可击的食品 安全，且同时能够以与作为食品补充剂的应用相一致的费用，大体 积供应。
本发明的目的还在于提供一组非动物来源且纯度优良的天然 物质，已经对其进行了良好的表征并且具有良好的追溯性。
本发明的目的还在于提供一种稳定且易于配制的多糖类食品 补充剂。
本发明的目的在于提出一种药物活性剂或食品补充剂，其能够 使与代谢综合征、肥胖、糖尿病和/或心血管疾病病状相关的参数， 例如甘油三酯含量、LDL-胆固醇与HDL-胆固醇之间的平衡、脂 质沉积物覆盖的主动脉弓表面积、血浆抗氧化能力等恢复到正常水 平。
发明描述
本发明描述了经有益纯化的真菌来源的、并且优选黑曲霉的提 取物的效用。纯化提取物的水解产物，即壳质(chitine，几丁质) 和低分子量的β-葡聚糖的共聚物，也是本发明的一部分。正是这两 种聚合物(壳质和β-葡聚糖)之间的结合以及来自真菌源的共聚物 的三维结构，使其成为有益于健康的化合物。特别是黑曲霉(其为 用于食品和制药工业的柠檬酸生产中的副产品)的可利用性和特 性，使其成为其衍生物在人类和动物健康中进行应用的供选择的原 材料。
各种来源的多糖类纤维及其寡聚物，如寡果糖、昆布多糖或壳 聚糖等的有益作用已经为人所知。本发明者已经在国际申请WO 03/068824中描述了用于生产来自真菌的、更特别地来自黑曲霉类 真菌的非动物来源的壳聚糖的过程。
现在，本发明者已经意外地发现，上述来自真菌源、特别是来 自真菌黑曲霉的壳质-葡聚糖复合物及其水解产物出乎预料地兼有 几种已知的纤维特性，并且发现壳聚糖并非用于例如克服血脂障碍 而最合适的化合物。实际上，壳质-葡聚糖复合物及其水解产物发挥 降低血液胆固醇和降血糖的作用，其增加血浆的抗氧化能力，从而 促进粥样斑的减少，其可增加饱腹感并刺激免疫系统。
关于壳聚糖，存在这样的情况(先验的)，葡聚糖通过脂肪酸 或胆汁酸与壳聚糖铵基之间的静电相互作用，依靠其在胃处结合脂 质的能力发挥减肥作用，依靠其在肠内结合脂质的能力发挥降低血 液胆固醇的作用。不过，本发明的壳质-葡聚糖物质及其水解产物， 首先基本上不带静电荷，其次不能在体外吸收脂肪酸。然而，其具 有显著减少甘油三酯含量、总胆固醇含量和LDL-胆固醇的作用(相 当于壳聚糖的作用)，同时促进HDL-胆固醇的增加(增加方式与壳 聚糖相当)。
关于壳聚糖，除了这些常见的作用，还有一些使其成为有益物 质的效果未曾描述：壳质-葡聚糖及其水解产物能够在水中吸收通常 约10倍于其自身的质量，这使得其成为具有优良纤维特性(尤其 是能够改善转运)的物质。由于壳质部分与β-葡聚糖部分之间的协 同，其能够显著刺激血浆的抗氧化活性并能够发挥免疫促进活性。
由于不能够在胃水平吸收脂质，因而壳质-葡聚糖及其水解产物 不会引起脂类营养素(维生素)失调的风险，而有时怀疑壳聚糖具 有此风险。最后，壳质-葡聚糖及其水解产物可按照一种易于实施的 过程获得并纯化，该过程开始于优质真菌，其为可大量获得并可更 新的副产品，并且其为非动物来源。
本发明人通过“真菌来源的多糖”表示从真菌细胞壁纯化获得 的提取物，其主要由壳质和β-葡聚糖的多糖(以共聚物形式)及其 水解产物组成。纯化的提取物优选包含以质量计超过提取物总质量 的70％、优选超过80％、优选超过85％、更加优选超过95％的壳质 -葡聚糖含量。
本发明人通过“壳质-葡聚糖”表示从真菌细胞壁提取的纯化共 聚物，其由α构象的通过(1，6)-型键()彼此连接的N- 乙酰-D-葡糖胺单元和可选地较小比例的D-葡糖胺单元的链(壳质 链)以及β构象的通过(1，3)-型、(1，3)(1，6)-型或(1，3)(1，4)-型键，并 且优选(1，3)-型键彼此连接的D-葡萄糖单元链(β-葡聚糖链，本文 中也称为“葡聚糖”)组成。
通常认为，真菌细胞壁多糖根据其在碱介质中的溶解性可分为 两组，且细胞壁骨架是不可溶的。人们还已经知道不溶性成分由壳 质和β-葡聚糖(根据物种不同，比例有所不同)组成，β-葡聚糖 单元通过不同的结构的键而连接，壳质与β-葡聚糖之间的键是稳定 的，如由例如Siestma & Wessels关于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(接合菌(Zygomycete))、粗糙链孢霉(Neurospora crassa) (子囊菌(Ascomycete))、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(子囊 菌(Ascomycete))和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)(担子菌 (Basidiomycete))所表明的(Siestma JH & Wessels JG.(1981) Solubility of(1，3)-beta-D-(1，6)-beta-D-glucan in fungal walls： importance of presumed linkage between glucan and chitin.(1981)J. Gen.Microbiol.125：209)。已知黑曲霉不溶性成分的壳质与β-葡聚 糖链彼此之间共价连接，如例如由Stagg CM和Feather MS(Biochim. Biophys.(1973)Acta 320：64)所论及的。例如，Fontaine等关于烟曲 霉(Fontaine T，Simenel C，Dubreucq G，Adam O，Delepierre M， Lemoine J，Vorgias CE，Diaquin M & Latgé JP.(2000)Molecular organization of the alkali-insoluble fraction of Aspergillus fumigatus cell wall，J.Bio.Chem.275：27594)、和Kollar等关于酵母菌酿酒酵母 (Kollar R，Petrakovas E，Ashwell G，Robbins P & Cabib E.(1995) Architecture of the yeast cell wall，the linkage between chitin and beta(1，3)glucan，J.Biol.Chem.270：1170)已经描述了用于确定壳质与 β-葡聚糖之间的共价键性质的方法。
有益地，壳质-葡聚糖共聚物包含低于10％的水溶性化合物。 优选地，壳质-葡聚糖共聚物的纯度高于80％，优选高于85％。有 益地，壳质-葡聚糖共聚物包含的重金属低于40mg/kg，优选低于 20mg/kg，如利用欧洲药典(European Pharmacopeia)2.4.8F专题论 文中描述的方法所确定的。有益地，壳质-葡聚糖共聚物包含低于 2ppm的砷，如通过AES-ICP确定的。有益地，壳质-葡聚糖共聚物 具有适于食用的微生物学性质，优选包含低于10,000cfu/g，更加优 选低于1,000cfu/g的微生物总数(包括酵母和霉菌数)。
壳质与β-葡聚糖之间的比值在95:5和5:95之间，优选在70:30 和20:80之间，更加优选在70:30和25:75之间，更加优选在60:40 和25:75(m/m)之间。另一优选的壳质与β-葡聚糖的比值介于50:50 和10:90之间，优选在45:55和20:80之间。这种类型的共聚物可 通过之前描述过的壳质-葡聚糖共聚物水解而得到。壳质-葡聚糖共 聚物的壳质部分优选包含至少85％的N-乙酰-D-葡糖胺单元和至多 15％的D-葡糖胺单元，优选包含至少90％的N-乙酰-D-葡糖胺单元 和至多10％的D-葡糖胺单元。共聚物通常呈白色至轻微褐色的粉末 形式。无论温度和pH如何，其在水性和有机溶剂中基本上不可溶。 其在水性介质中能够溶胀。它是吸湿性的，在水中通常可吸收约7 倍于其自身的质量，这相当于植物不溶纤维如半纤维素或果胶的溶 胀度。
有益地，根据本发明的壳质-葡聚糖共聚物可通过以 KITOZYME S.A.名义分别于2003年2月12日和2005年7月4日 提交的国际申请WO 03/068824和法国专利申请所描述的工艺而获 得，两个申请均结合于此供参考。该工艺特别是在申请FR0507066 中加以描述，如所提交申请的第18页第14行等等。在该工艺中， 优选将黑曲霉用作真菌来源。
有益地，该方法包括下列步骤：
1)可选地，将生物菌体(生物量，biomasse)悬浮于酸性溶 液中并除去酸溶性产物，
2)将酸不溶性成分悬浮于碱性溶液中并除去碱溶性产物，
3)通过进一步用水处理，纯化碱不溶性产物，
4)干燥不溶于水的产物，
5)可选地，通过用有机溶剂处理而纯化干燥产物，
6)可选的，干燥不溶于有机溶剂的产物。
根据初始生物菌体组成和最终壳质-葡聚糖共聚物产物所需纯 度的不同，第一个步骤即将生物菌体悬浮于酸性溶液中是可选性 的。优选酸性溶液为盐酸或硫酸的水溶液，优选盐酸的水溶液。根 据一个具体实施例，所述酸性溶液的浓度介于0.1与5N之间，优 选约0.5N。
有利地，该第一个提取步骤可除去酸溶性化合物包括无机化合 物。
第二个步骤有利地利用诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵水 溶液这样的水溶液，并且优选氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。优选 地，所述碱性溶液的浓度介于0.1与5N之间，优选约1N。
第三个步骤即纯化碱不溶性产物优选通过使所述产物与水接 触并通过例如过滤分离水不溶性产物而实施。
每一个步骤均优选在5-120℃之间的温度下实施，并且更加优 选在低于60℃的温度下实施。生物菌体优选占1-15％(干重，w/v)， 并且更加优选占3-12％。这些步骤优选持续4-48小时，并且更加优 选少于30小时。每一个步骤均可重复多次。
本发明人通过“壳质-葡聚糖水解产物”表示由特别是从真菌细 胞壁提取的壳质-葡聚糖共聚物受控水解得到的共聚物，并且其由共 价连接的壳质链和β-葡聚糖链组成，其中壳质与β-葡聚糖的比例 优选在50:50和10:90(m/m)之间，优选60:40和15:85(m/m)之间。 由于部分水解，水解产物的分子量低于壳质-葡聚糖共聚物的分子 量。壳质-葡聚糖水解产物的壳质部分优选由至少85％的N-乙酰-D- 葡糖胺单元和至多15％的D-葡糖胺单元组成，优选由至少90％的 N-乙酰-D-葡糖胺单元和至多10％的D-葡糖胺单元组成。
附图说明
图1示出了用于记录壳质-葡聚糖F1和水解的壳质-葡聚糖F4 的固相碳13核磁共振(13C-NMR)谱的条件。
图2示出了壳质-葡聚糖F1(第28批)的13C-NMR谱。
图3示出了水解的壳质-葡聚糖F4(第2批)的13C-NMR谱。
具体实施方式
本发明者意外地发现壳质-葡聚糖共聚物及其水解产物(属于一 组结构类似于壳聚糖结构的多糖)，尽管其基本不带电荷，却具有 与壳聚糖相当的降低血液胆固醇的特性。该化合物易于从真菌来 源，例如黑曲霉的菌丝体获得，其构成真菌细胞壁外骨架的不溶性 部分。壳质-葡聚糖共聚物及其水解产物还具有其它有益于健康的作 用，如在本发明中所描述的。
本发明特别涉及从真菌来源提取的多糖及其水解衍生物作为 用于改善人类和动物健康的药物活性剂或食品补充剂。经常口服本 发明的多糖使得特别能够预防、治疗或对抗尤其是血脂障碍、高胆 固醇血症和动脉粥样硬化，并刺激生物体的抗氧化活性，刺激免疫 系统，发挥有利于糖尿病情况中的降血糖作用，且增强饱腹感以将 代谢综合征减至最少。本发明的多糖可按照能实现优良的纯度、良 好的重复性的有益过程，从真菌来源中以大生产量获得。本发明的 多糖基本上由D-葡糖胺单元、和/或N-乙酰-D-葡糖胺单元和D-葡 糖胺单元、尤其是壳质(N-乙酰-D-葡糖胺)和β-葡聚糖(D-葡萄 糖)共聚物组成。本发明还包括这些聚合物或共聚物的任何修饰， 例如通过将化学官能团连接到聚合物上以改善其特性。
因此，根据第一方面，本发明涉及至少一种真菌来源的多糖(主 要包括壳质-葡聚糖共聚物)用于制造口服组合物的应用。
本发明还涉及至少一种不溶于水性或有机介质中的真菌来源 的多糖用于制造口服组合物的应用，所述多糖主要包括壳质-葡聚糖 共聚物。
本发明还涉及至少一种包括含β-葡聚糖键()的 聚合物的真菌来源的多糖用于制造口服组合物的应用，所述β-葡聚 糖键基本上由1，3-位的β-葡聚糖键组成。
本发明还涉及至少一种基本上包含上文所定义的多糖的真菌 来源的提取物用于制造口服组合物的应用。有益地，按质量计算， 多糖包含的壳质-葡聚糖多糖占真菌来源的提取物总质量的70％以 上，优选大于85％。
真菌提取物可从多类真菌包括接合菌、担子菌、子囊菌(黑曲 霉是其中的一部分)以及半知菌的菌丝体细胞壁，和/或它们的混合 物中获得。选择所述真菌来源使得能够提取上文和下文所定义的多 糖。虽然存在着某些包含葡聚糖的真菌来源，但特别地，这些单元 是水溶性的或者包括很少或不包括壳质结构链，因此也不可能获得 本发明的多糖。真菌来源可以为天然的或经遗传修饰的(GMO)。
本发明涵盖所有能获得本发明所定义的壳质-葡聚糖聚合物的 真菌类型。
有益地，采用上述定义的多糖的水解产物。
有益地，壳质-葡聚糖水解产物中壳质与β-葡聚糖的比值在 60:40与15:85(m/m)之间。
有益地，壳质-葡聚糖共聚物中壳质部分的至少85％是N-乙酰 -D-葡糖胺单元，而该部分的至多15％是D-葡糖胺单元。
因此，本发明能够为人类或动物，优选哺乳动物提供一种口服 组合物，用于获得一种选自由以下组成的组中的效应：抗氧化、降 低血液胆固醇或降血脂效应、对免疫系统的刺激效应、降血糖效应 (特别是糖尿病)、饱腹效应、改善食物转运的效应、以及旨在预 防和/或治疗和/或对抗选自由血脂障碍、动脉粥样硬化、肥胖、肥 胖相关疾病、心血管疾病、代谢综合征、糖尿病和高尿酸血症组成 的组的病症的效应。
本发明还涉及一种药物或食品补充剂组合物，其包括至少一种 如上文定义真菌来源的多糖或提取物作为活性成分。
本发明还涉及一种治疗、预防或对抗病症(特别是上文提到的 病症)的方法，包括使需要多糖的个体口服有效量的包括至少一种 如上文或下文描述中所定义的多糖的组合物。
本发明还涉及用于减少人或动物优选哺乳动物的重量或防止 或对抗重量增加的方法。这个方法特别涉及保养美学。
本发明还涉及用于优化食物转运(transit)的方法。
因此，本发明涉及本发明产品制造尤其用于上述其中一个方法 或者用于施加上文或下文所述其中一个效应的组合物的应用。
通过常规方法，本领域的技术人员可以容易地确定将采用的本 发明产品的有效量。有益地，按重量计算，所采用的根据本发明的 产品的有效量占将给与的组合物总重量的0.001％至100％。如果产 品以胶囊、颗粒或片剂的形式给与，则其可以纯品(pure)应用或 以任何其它浓度、与其它活性成分或者赋形剂一起应用。如果将其 掺入食品中，则产品浓度低于15％，优选低于10％。
本发明的产品通常以颗粒、片剂或胶囊的形式配制，或者以其 他形式掺入食品或饮品中。
本领域的技术人员在阅读涉及多种实施例的解释性说明书之 后，将更加明了本发明的其它目的、特征和优点，然而说明书中的 实施例仅仅为了进行示例而不能以任何方式限制本发明的范围。
实施例是本发明不可或缺的一部分，并且基于作为整体的说明 书，任何相对于现有技术表现为新颖性的特征，包括实施例，在其 功能和其一般性方面都是本发明不可或缺的一部分。
因此，每一个实施例均具有一般范围。
此外，在实施例中，除非另有指明，所有的百分比均按重量给 出，并且除非另有指明，所有的温度均以摄氏度表示，且除非另有 指明，压力均为大气压。
实施例
用于获得下文所得壳质-葡聚糖共聚物的过程在专利申请WO 03/068824和FR05.07066中有所描述。
实施例1-从黑曲霉的菌丝体中提取和纯化的壳质-葡聚糖共聚 物的实施例(提取物F1)
为了制备F1壳质-葡聚糖共聚物，将质量50kg(干重)的湿黑 曲霉菌丝体悬浮于浓度为1％的盐酸溶液中，然后过滤。随后将固 体物质悬浮于0.25％的氢氧化钠溶液中，然后过滤。将固体物质用 水洗4次，随后干燥。接下来悬浮于乙醇中，然后过滤并干燥。得 到大约20kg壳质-葡聚糖(F1)。
在表1中给出6批F1壳质-葡聚糖的分子特征及组成。
根据下文简要描述的方法，通过在图1中所示条件下记录的固 相碳13核磁共振(MNR)谱来计算壳质/葡聚糖的质量比。F1壳质 -葡聚糖复合物(第28批)的谱在图2中示出。β-葡聚糖的比例根 据以下四个共振带的面积来确定：104ppm(壳质和β-葡聚糖的碳 1)、23ppm(壳质的CH3碳)、55ppm(壳质的碳2)和61ppm(壳质 和β-葡聚糖的碳6)，以纯壳质作为参照。例如，可根据式1进行 计算，其中I′是碳信号面积，并且其中[]CG表示所分析的壳质-葡聚 糖的比值，而[]C则是参照壳质的比值。C1是壳质和β-葡聚糖的碳 1，C2则是壳质的C2。
6批壳质-葡聚糖的壳质/葡聚糖的质量比平均为39:61±2 (m/m)。
D-葡糖胺(NGlc)单元的比例，以壳质部分的mol％表示，可根 据NMR谱估算，如Heux等所描述的(Heux L，Brugnerotto J， Desbrières J，Versali MF & Rinaudo M.(2000)Solid state NMR for determination of the degree of acetylation of chitin and chitosan. Biomacromolecules 1：746)。D-葡糖胺单元的比例则在盐酸过量的悬 浮液中利用氢氧化钠进行电位滴定而测定。
在表2中给出壳质-葡聚糖的微生物学性质以及搜索病原体的 结果。
表1-各批壳质-葡聚糖共聚物(F1)的分子特征和组成
批次 壳质-葡聚糖比值 NGlc (滴定)灰分 蛋白 脂质 重金属 (m/m)mol％(％)(％)(％)(ppm)第26批F136:64±5*00.44.630<LQ**第27批F142:58±701.33.540<LQ第28批F139:61±701.52.512.09<LQ第29批F140:60±601.73.050.06<LQ第30批F137:63±101.91.541.248.7第31批F140:60±402.54.261.27<LQ
*壳质-葡聚糖比值4次计算结果的标准差；**LQ：离子耦合等 离子体分析法的敏感性限值(5.3ppm)。
表2-F1壳质-葡聚糖(第26批)的微生物学性质
微生物数量/g嗜温需氧微生物总量20cfu/g需氧孢子<10cfu/g酵母和霉菌20cfu/g病原体肠杆菌科<10cfu/g大肠埃希杆菌<10cfu/g凝固酶阳性葡萄球菌<10cfu/g假单胞菌10cfu/g沙门氏菌无
因此，从上表中能够了解，根据本发明的共聚物具有较高的纯 度。
实施例2-壳质-葡聚糖共聚物水解产物(F4)的实例
在该实施例中，F4壳质-葡聚糖水解产物通过将F1壳质-葡聚 糖共聚物在浓度大于30％的氢氧化钠溶液中于100℃或更高的温度 下碱性水解至少2小时而获得。将该物质用水洗数次、悬浮于乙醇 中，然后过滤并干燥。可从20kg F1壳质-葡聚糖中得到大约5kg水 解产物。
在表3中给出几批F4壳质-葡聚糖水解产物的分子特征和组 成。壳质-葡聚糖比值根据固相碳13核磁共振谱进行计算。该比值 根据所采用的水解方法而变化。分析条件与用于F1的分析条件相 同。
表3-各批壳质-葡聚糖水解产物(F4)的分子特征和组成(灰 分、蛋白)
*壳质-葡聚糖比值4次计算结果的标准差。
根据本发明的共聚物明显具有较高的纯度。
实施例3-口服水解的壳质-葡聚糖后，抗动脉粥样硬化、抗氧 化、降低血液胆固醇和降血脂效应的证实
所采用的动物模型是给与引起动脉粥样化饮食的仓鼠。对仓鼠 喂食富含胆固醇而缺乏抗氧化剂(维生素C、维生素E和硒)的食 物，其将引起与人类粥样斑中所出现的损伤类似的血脂障碍和动脉 损伤(Nistor A，Bulla A，Filip DA & Radu A(1987)The hyperlipidemic hamster as a model of experimental atherosclerosis.Atherosclerosis 68：159)。因为仓鼠的脂质代谢，其易于操作而且诱导损伤(或病变) 所需时间较短(8-12周)，所以仓鼠是一种特别有用的研究动脉粥 样硬化的动物模型。因为其对旨在降低胆固醇和粥样斑的操作反应 良好，因此被选择用来研究壳质-葡聚糖水解产物的效应(Kowala， MC，Nunnari，JJ，Durham，SK & Nicolosi，RJ(1991)Doxazosin and cholestyramine similarly decrease fatty streak formation in the aortic arch of hyperlipidemic hamsters.Atherosclerosis 91：3549)。
在该实施例中，将两种化合物(其特征总结于表4中)投于仓 鼠的每日食物中。
●42.85mg/kg/天F4水解的壳质-葡聚糖(即，对于重70kg的 人，相当于3g/天)
●42.85mg/kg/天F7真菌来源的壳聚糖(即，对于重70kg的 人，相当于3g/天)
对照组每天通过管饲法接受水，以实现与其它组相同的实验条 件并防止由于管饲压力所导致的任何可能的差异。
一旦接收，即将28只重约80克的叙利亚金仓鼠置于塑料笼内， 并分为3批，每批8只，房间温度23℃，湿度70％，光周期12小 时(12N/12D)。每天测定食物消耗量和它们的体重。各组所接受的饮 食(及其成分)在表5中详细给出。
表4-F4和F7化合物的特征
F4 水解的 壳质-葡聚糖F7 壳聚糖 分子量N/A10000壳质(占壳质-葡聚糖共聚物的百分比％)25NAβ-葡聚糖(占壳质-葡聚糖共聚物的百分比％)752葡糖胺(壳质部分的摩尔百分比mol％)090灰分(％)1.21.3蛋白(％)8.9<1
表5-仓鼠饲料的组成
1无机盐混合料包括(mg/kg饲料)：CaHPO4，17200；KCl，4000； NaCl，4000；MgO，420；MgSO4，2000；Fe2O3，120；FeSO4·7H2O，200； 微量元素，400(MnSO4·H2O，98；CuSO4·5H2O，20；ZnSO4·7H2O，80； CoSO4·7H2O，0.16；KI，0.32；淀粉，足量(qs)40g(每kg饲料)。该 混合料不含Na2SeO3。
2维生素混合料包括(mg/kg饲料)：视黄醇，12；胆钙化甾醇， 0.125；硫胺素，40；核黄素，30；泛酸，140；吡多辛，20；肌醇，300； 氰钴胺素，0.1；甲萘醌，80；烟酸，200；胆碱，2720；叶酸，10；对氨 苯甲酸，100；生物素，0.6；淀粉，足量(qs)20g(每kg饲料).该混 合料不含α-生育酚和抗坏血酸。
组织取样.实验12周后，仓鼠禁食16小时，随后施以腹膜内 麻醉。
血浆取样.首先通过心内穿刺取血样，然后3500×g离心10分 钟。回收血浆、等分并随后储存于-80℃。随后测定这些血浆中的总 胆固醇、HDL-胆固醇水平、LDL-胆固醇水平、甘油三酯、尿酸和 尿素。
器官取样.用含1mM氯化钙和0.27％葡萄糖的磷酸盐缓冲液 (1mM，pH7.2)灌注后，取出肝脏。该操作的目的是为了除去可能含 SOD和GSHPx活性的残留血液。随后将所述肝脏干燥、称重并随 即储存于-80℃。将在该器官上测定谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物 歧化酶活性。
用含2.5mM氯化钙、2.5％低聚甲醛和1.5％戊二醛的0.1M二 甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)固定血管系统后，取出主动脉。随后在 双目透镜下取出主动脉弓，纵向打开，固定(epingler)在一块软木 上，然后浸入固定液中并储存于4℃。将主动脉壁的脂质染色后， 可观察到由饮食引起的动脉粥样损伤。
结果的统计学处理
以下部分将示出的值对应于从各组(8个动物/组)获得的平均 值±SEM(平均值的标准误差)。平均值之间的显著性通过StatView 4.5软件(ABACCUS Concept，Inc)利用Fischer检验进行变量 ANOVA分析而确立。如果值具有相同的上标字母，则表示这些值 未达到P<0.05的显著性差异。
结果
a-脂质表面积测定.组织学染色后，按照Nunnari et al.，(Nunnari JJ，Zand T，Joris I & Majno G.(1989)Quantification of oil Red O staining of the aorta in hypercholesterolemic rats.Exp.Mol.Pathol. 51:1)描述的方法，利用装配有照相装置的光学显微镜测定脂质沉积 物的表面积。
表6-覆盖有主动脉脂质沉积物的主动脉表面积的百分比
对照F4F7脂质沉积物的百分 比14.79±4.08a0.35±0.20b0.57±0.37b
可以注意到根据本发明的产品比壳聚糖更加有效。
b-血浆测定
对血浆进行多项测定：
●生物学参数测定(总胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL、尿酸、 尿素)，
●关于抗氧化能力的测定(TAS).
血浆胆固醇总量的测定.利用试剂盒No.1489232 Roche/Hitachi， Roche Diagnostics进行分析。该分析基于Allain等(Allain CC，Poon LS，Chan CS，Richmond W & Fu PC.(1974)Enzymatic determination of total serum cholesterol，Clin.Chem.20：470)所描述的技术。
血浆甘油三酯的测定.利用试剂盒No.1488872Roche/Hitachi， Roche Diagnostics，按照Wahlefeld & Bergmeyer(Wahlefeld AW & B ergmeyer HU(1974)in：Methods of enzymatic analysisS econd Edition，New York Academic Press p.1831)开发的方法进行分析。
血浆HDL的测定.利用试剂盒No.1930672 Roche/Hitachi， Roche Diagnostics进行分析。按照Marz & Gross( W & Gross W. (1986)Evaluation of a phosphotungstic acid/MgCl2precipitation and quantitative lipoprotein electrophoresis assay.Clin.Chim.Acta.158：33) 描述的技术分离HDL。
血浆LDL的测定.利用总胆固醇含量与HDL-胆固醇含量之间 的差值计算血浆LDL-胆固醇含量。
表7-生化参数总结
对照F4F7总胆固醇(g/l)3.10±0.30a2.53±0.21b2.37±0.03b甘油三酯(g/l)1.96±0.55a1.04±0.27bd0.60±0.21bcHDL(g/l)0.57±0.16a2.01±0.11bd1.84±0.09bcLDL(g/l)2.13±0.2a0.24±0.05b0.26±0.09b
可以注意到本发明的产品具有等同于壳聚糖的效应。
尿素的测定.利用试剂盒No.1489364 Roche/Hitachi，Roche Diagnostics进行分析。该尿素定量分析基于Talke和Schubert(Talke H & Schubert GE.(1965)Enzymatische Harnstoffbest timmung im blut und serum im optischen test nach Warburg.Klin.Wochenschr.43：174) 描述的UV动力学方法。
尿酸的测定.利用试剂盒COBAS INTEGRA 400/700/800 Uric Acid ver.2(UA2)Roche/Hitachi，Roche Diagnostics进行分析。该分 析是按照Town等(Town MH et al.，(1985)J.Clin.Chem.Clin. Biochem.23：591)的改良方法进行的酶比色测定(enzymatic colorimetric assay)。
表8-血浆酶活性
对照 F4 F7 尿酸(μmol/l) 255.00±37.85a 100.75±62.02bd 82.25±21.70bc 尿素(mmol/l) 14.87±5.58a 4.00±0.37b 5.25±0.25b
可以注意到本发明的产品的血浆酶活性优于或等同于壳聚糖。
血浆抗氧化能力的测定(TAS).该参数利用Randox No. NX2332试剂盒(Laboratoire Randox)而测定，该试剂盒的方法基于 Miller等(Miller NJ，Rice-Evans C，Davies MJ，Gopinathan V & Milner A.(1993)A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates， Clinical Science.84：407)的技术。
表9-血浆抗氧化活性
对照 F4 F7 抗氧化能力 (mmol/l) 1.03±0.08abd 1.37±0.07bce 0.89±0.04de
可以注意到本发明的产品具有完全出乎意料的血浆抗氧化活 性，且其不能与抑制血浆抗氧化活性的壳聚糖相比较。
c-测定肝脏酶活性
肝脏细胞溶质成分的制备.对细胞溶质成分进行肝脏酶活性测 定；特别地，因为酶处于细胞溶质中，因此有必要实施两步超速离 心：第一次离心是将肝组织匀浆以5％浓度于0.15M NaCl中，在4 ℃下以8000×g离心20分钟，从而回收上清液。上清液随后则在 4℃下以105 000xg离心1小时。将细胞溶质储存于-80℃，以备分 析。蛋白分析则按照Smith等(Smith PK et al.，(1985)Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal.Biochem.150：76)利用二辛可 宁酸法进行。
谷胱甘肽过氧化物酶活性(Se-GSHPx).该酶活性的测定基于 样品利用水性过氧化氢催化谷胱甘肽氧化的能力，按照Wendel的 方法(Wendel A.(1981)Glutathione peroxydase.Methods in enzymology，77：327)而进行。
表10-肝Se-GSHPx的比活性
对照 F4 F7 Se-GSHPx (U/mg蛋白) 109.12±88.94a 134.04±1.49a 142.85±54.60a
可以注意到本发明的产品具有的肝酶活性等同于壳聚糖的肝 酶活性。
超氧化物歧化酶活性(SOD).SOD的活性利用SOD525试剂 盒(Tebu-Bio)按照Paoletti与Mocali的方法(Paoletti F & Mocali A. (1990)Determination of superoxide dismutase activity by purely chemical system based on NADCPJH oxidation，Methods Enzymology. 186：209)而测定。
表11：肝SOD的比活性
对照 F4 F7 SOD (U/mg蛋白) 0.58±0.56a 0.03±0.02bd 0.04±0.01cd
可以注意到本发明的产品所具有的超氧化物歧化酶活性与壳 聚糖相当。
为了对这些结果进行概述，表12和13将各种参数中的变化量 (variation)(表示为相对于对照组的百分比(％))综合在一起。
表12-主动脉脂质沉积物表面积和肝脏酶活性的变化量(表示 为相对于对照组的百分比(％))
Se-GSHPx (U/mg蛋白) SOD (U/mg蛋白) 脂质沉积物的百分 比 F4 +22.8％ -94.8％ -97.6％ F7 +30.9％ -93.1％ -96.1％
表13-各种生化参数的变化量(表示为相对于对照组的百分比 (％))
总胆固醇 (g/l)甘油三酯(g/l)HDL(g/l)LDL (g/l)抗氧化能力 (mmol/l)尿酸 (μmol/l)尿素 (mmol/l)F4-18.4％-46.9％+252.6％-88.7％+33.1％-60.5％-73.1％F7-23.5％-69.4％+222.8％-87.8％-13.6％-67.7％-64.7％
总胆固醇、甘油三酯、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇是能够表明 水解的壳质-葡聚糖和壳聚糖降低血液胆固醇效应的生化参数。实际 上，与对照组相比，总胆固醇和LDL-胆固醇的下降(显著性下降， 下降系数为10)能够证实水解的壳质-葡聚糖和壳聚糖对发生粥样 斑的预防作用以及因此对心血管疾病的预防作用。
HDL-胆固醇的增加比较引人注意。这反映了一个事实，即胆 固醇从周围器官向肝脏的流动增加，从而减少了器官和动脉内富含 胆固醇的颗粒沉积和氧化的风险。基于F4和F7的治疗能够逆转相 比于对照的HDL/LDL水平。
覆盖有脂质沉积物和泡沫细胞的主动脉弓的表面积百分比是 动脉粥样损伤发生的直接指标。与对照相比，两种处理均能非常显 著地降低该百分比，其中有效水平近乎相似，均在97％左右。然而， 根据喂以动脉粥样硬化饲料的相同仓鼠模型中所研究的分子，被认 为在降低脂质沉积物方面非常有效的化合物例如酒多酚(wine polyphenol)表现为覆盖有脂质沉积物的主动脉弓表面积下降 70％-90％(Auger R et al.，J.Agric.Food Chem.(2005)53：9823；Auger R et al.，(2005)J.Agric.Food Chem.53：2015；Auger R et al.，(2004)J. Agric.Food Chem.52：5297)。
仅F4增加了血浆抗氧化能力，比对照组增加33.1％。至于抗 氧化系统中涉及的肝脏酶活性，观察到，相比于对照组，通过用F4 和F7处理，硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶活性有所增加，而SOD 活性则大大下降。
还可以注意到，用F4和F7处理的两组中，血浆中尿酸和尿素 极大下降(60％-70％)。所观察到的下降反映了肾对尿酸和尿素较 大的清除，其降低了高尿酸血症的风险，而已知高尿酸血症是促进 粥样斑形成的参数。
所采用动物模型的脂质谱及相关参数的很大改善，使得能够推 断经常性摄入水解的壳质-葡聚糖对于预防动脉粥样硬化甚至肥胖 均有益，效果可与摄入壳聚糖相比拟，甚至更好。
实施例4 口服壳质-葡聚糖对大鼠胃肠道、血糖谱和脂质谱的 影响
流程
所采用的模型是正常大鼠，给与其富含果糖(21％)的标准饲 料和饮品，其通过肝的快速果糖代谢而促进肝脂肪变性，引起高甘 油三酯血症和高胰岛素血症以及骨骼肌和肝内胰岛素作用的下降。
将壳质-葡聚糖(表14)以10％的比率投于大鼠的日常饮食中， 该比率是能够在动物体内产生急性效应的剂量。研究了其短期和长 期效应。对照组接受富含果糖的标准饲料(表15)。将10只重约 100-125g的雄性Wistar大鼠分入两组(对照/处理)置于笼内，房 间温度23℃、湿度70％，光周期12小时(12N/12D)。
每周测定一次饲料消耗量和体重变化。处理2周后，估算24 小时的粪便量及其中的水含量。适应期(1周，在该过程中动物接 受不富含果糖的标准饲料)后，对存在壳质-葡聚糖下的胃排空和血 糖反应进行评估。大鼠断食18小时。处理组通过管饲法接受葡萄 糖-对乙酰氨基酚-壳质-葡聚糖(10％)溶液，而对照组则接受葡萄 糖-对乙酰氨基酚溶液。在2小时期间取血样(血葡萄糖水平、血胰 岛素水平、对乙酰氨基酚)。同样，处理3周后，对不存在壳质-葡 聚糖下的胃排空和血糖反应进行评估。在该情形中，大鼠断食18 小时，并通过管饲法给与葡萄糖-对乙酰氨基酚溶液2天。在2小时 期间取血样(血葡萄糖水平、血胰岛素水平、对乙酰氨基酚)。在 处理第3周的过程中，大鼠断食18小时。随后评估口盲肠传输(或 运转)时间。将用卡红溶液着色的饲料给与大鼠。测定第一次出现 有色粪便的时间。
处理4周后，麻醉大鼠并实施剖腹术。将来自门静脉和腔静脉 的血液离心，以回收血清和/或血浆。利用血清和/或血浆分析血脂 (总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇)和血糖(葡萄糖、胰岛 素)谱。取出各种器官、称重并储存以评估盲肠发酵(盲肠增殖、 盲肠pH、短链羧酸含量)、肝脏和粪便的脂质含量以及脂肪量(睾 丸脂肪组织和内脏脂肪组织的重量)。
结果
结果表明经常性摄入壳质-葡聚糖促进大鼠模型中平衡的肠内 转运以及血脂和血糖谱的平衡稳态。观察到“纤维效应”对与代谢 性疾病例如高胆固醇血症、糖尿病或者甚至代谢综合征和肥胖等直 接相关的参数(或因素)具有预防效应。实际上，纤维降低食物的 热量密度(千卡数/100g)，显著减慢胃排空和食物消化，并且显著 减少胰岛素分泌。这些效应共同引起热量消耗的自发下降和饥饿感 的自发下降。
壳质-葡聚糖诱导盲肠水平的发酵。该发酵过程伴随短链脂肪酸 生成，相比于对照组，接受壳质-葡聚糖的组通过影响上皮细胞内环 境稳定，其短链脂肪酸生成显著较高。因此这促进萎缩风险的下降、 促进受损肠上皮的恢复、和/或促进对细胞过度增殖的抑制。
表14-壳质-葡聚糖共聚物的分子特征和组成
壳质-葡聚糖 比例灰分 蛋白 脂质 重金属 35/652.37.711.5<20
表15-大鼠饲料组成(标准AO4饲料，UAR，法国)
％蛋白19.3碳水化合物： -纤维素 -淀粉 -蔗糖 -其他不可消化的物质70.4 5 38 3 8脂质3无机盐/维生素混合料7.3
表16-相比于对照组，已摄入壳质-葡聚糖的大鼠组的生化和生 理参数变化
显著低于对照组的值(p<0.05)；
显著高于对照组的值(p<0.05)；
未显著改变(p<0.05)
实施例5 壳质-葡聚糖的吸水能力
为了模拟壳质-葡聚糖在胃肠道中的行为，使粉状壳质-葡聚糖 在与水、NaCl和不同pH下的水溶液接触。搅拌接触12小时后， 通过离心分离壳质-葡聚糖，并测定湿重。
表17-壳质-葡聚糖在不同介质中的溶胀度(每100g干壳质-葡 聚糖吸收的水(g))
水5％NaClpH3pH5pH7pH9777677
结果
从本实施例可以看出，壳质-葡聚糖能够吸收大约6倍于其本身 质量的水或水性介质，其与已知的商业化不溶性膳食纤维(例如半 纤维素和果胶)具有相同数量级的溶胀度(吸收4-8倍于其自身质 量的水)。
实施例6 证实仓鼠口服壳质-葡聚糖后抗动脉粥样硬化、抗氧 化、降低血液胆固醇和降低血脂的效应
流程
所采用的模型与实施例3中示出的相同。在本实施例中，在仓 鼠每日饮食中给与两种化合物，将这两种化合物的特征总结于表18 中：
●CG2组：42.85mg/kg/天的壳质-葡聚糖(即，对于重70kg 的人，相当于2g/天)
●CG1.5组：21.43mg/kg/天的壳质-葡聚糖(即，对于重70kg 的人，相当于1.5g/天)
●Cs2组：28.57mg/kg/天的壳聚糖(即，对于重70kg的人， 相当于2g/天)
对照组每天通过管饲法接受水，以实现相同的实验条件。
表18-壳质-葡聚糖和壳聚糖化合物的特征
壳质-葡聚糖 (CG)壳聚糖 (Cs)分子量N/A29,000壳质 (占壳质-葡聚糖共聚物的百分 比(％))35 N/A β-葡聚糖 (占壳质组分的摩尔百分比 (mol％))65 2.1 葡糖胺 (占壳质组分的摩尔百分比 (mol％))0 89 灰分(％)2.32.66蛋白(％)7.70.31
一旦接收，则将48只重约100g的叙利亚金仓鼠置于实施例3 的相同实验条件下。每天测定饲料消耗量及其体重。各组饲以实施 例3中示出的相同饲料(表5)。
结果
取样、统计分析和分析方法与实施例3中所示出的相同。所有 结果均示于表19中。
表19-与对照组相比，已摄入壳质-葡聚糖和壳聚糖的仓鼠组的 生化参数的变化
显著低于对照组的值(p<0.05)；
显著高于对照组的值(p<0.05)
从本实施例可以看出，壳质-葡聚糖使饲以动脉粥样硬化饮食的 大鼠的生化参数发生与实施例3中所研究的产物相同的变化。以所 研究的两个剂量，壳质-葡聚糖大大改善脂质谱和相关参数。因此， 壳质-葡聚糖的经常性摄入在动脉粥样硬化甚至相关病状的预防中 是有益的。