技术领域
本发明涉及基于在脂质体中的胆碱酯酶抑制剂的药物组合物，涉 及这样的组合物的制备，和涉及其治疗应用的可能性。
发明背景
中枢胆碱酯酶抑制剂用于轻度和中等严重程度的阿尔茨海默病的 药物治疗，以便部分地修复在这一综合征情况下由于疾病而降低的脑 中的胆碱能刺激传导系统的功能。新的研究表明，许多胆碱酯酶抑制 剂不仅通过不同的机制阻断乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，而且对于 神经元烟碱性乙酰胆碱受体产生直接的作用。这些其天然配体为乙酰 胆碱的受体不仅存在于胆碱能神经上，而且存在于5-羟色胺能和谷氨 酸能神经系统中，并在那里控制每种神经递质的释放。
这种作用在相关试剂的非常不同浓度的情况下出现，在受体的各 种不同的受体结合位点上发生，和能够(部分地还取决于胆碱酯酶抑 制剂本身的浓度和/或同时存在的乙酰胆碱浓度)导致阻断或增强乙酰 胆碱对受体的作用。
在这方面经特别深入研究的加兰他敏适合于担当标准型的角色， 因为在引起具有治疗作用的胆碱酯酶抑制的浓度下，其为在有别于乙 酰胆碱结合位点的结合位点上的变构调节性配体(Samochocki等人， Acta Neurol Scand Suppl.2000；176：68-73；Dalas-Bailador等 人，Mol Pharmacol.2003；64(5)：1217-26)。由此，额外增强了 通过加兰他敏的胆碱酯酶抑制而升高的乙酰胆碱浓度的作用。根据公 开，他克林(Tacrin)同样也结合在受体的这一和另一结合位点上 (Svensson和Nordberg，Neuroreport 1996；7(13)：2201-5)。对 于毒扁豆碱(Physostigmin)(Onkojo等人，Eur J Biochem 1991； 200(3)：671-7)和多奈哌齐也存在可比较的提示。对于加兰他敏还报 道了非胆碱能的抗凋亡作用(Arroyo等人，Rev Neurol.2002；34(11)： 1057-65)，以及还有例如相应于神经生长因子(NGF)的作用(Capsoni 等人，Proc Natl Acad Sci USA，2002；99(19)：12432-7)。
虽然进行了关于治疗具有其特异的胆碱能缺乏的阿尔茨海默痴呆 和与之相关联的神经变性的这些研究，但是其还对于外周神经系统， 特别是感觉神经的变性和疼痛般的疾病具有重大意义。一方面，很久 以来就已知，烟碱和其他对烟碱性受体具有激动作用的物质的抗伤害 作用。另一方面，在早先的关于糖尿病性感觉神经病变研究中，以及 还有如在急性神经损伤时，在相关皮肤区段中NGF的浓度剧烈减少。 在此，NGF或者与之相应的神经营养活性能够修复感觉功能，所述的 神经营养活性直接或者通过与NGF紧密相关联的胆碱能系统而介导。 但是，与此相关的研究的成就不大，可能是因为不能获得没有全身性 副作用的足够高的局部NGF浓度(Anand，Prog Brain Res.2004；146： 477-92)。还已经证明，烟碱性激动剂在其与此相关的治疗可用性方 面受到副作用如高血压和神经肌肉麻痹的不利影响。在外周起作用的 胆碱酯酶抑制剂基本上也是由于副作用问题而被认为不适合用于在人 类中进行止痛治疗(Ghelardini等人，Presynaptic Auto-and Heteroreceptors in the Cholinergic Regulation of Pain.In： Trends in Receptor Research，Elsevier Science Publishers B.V.， 1992)。已知基于膏药的胆碱酯酶抑制剂的经皮制剂，其含有溶解或 分散在皮肤渗透增强剂中的活性物质。关于这些被动经皮系统的示例 性实例，可提及如下：对于毒扁豆碱的EP-0376067、EP-0377147、 EP-0667774、EP-0599952和EP-0517840；对于利凡斯的明 (Rivastigmin)的WO-9934782；对于加兰他敏的EP-0680325；以及 对于石杉碱(Huperzin)的WO-0132115。Moriearty等人(Methods Find Exp Clin Pharmacol 1993；15(6)：407-12)描述了对于美曲膦酯或者 作为胆碱酯酶抑制剂具有活性的其水解产物敌敌畏的这样的系统，和 对于庚基毒扁豆碱的这样的系统。毒扁豆碱的另外两种合成的衍生物， Thiacymserin和Thiatolserin，被它们的研制者明确描述为特别适合 于经皮应用。
这些经皮系统全部都计划用于应用，它们要求全身性施用各活性 物质。在这些情况下，根据这样的要求来选择经皮途径，即活性物质 缓慢而均匀地释放到血液循环系统中和/或避免在经口摄入时出现的 在肝脏中的“首过效应”-降解，从而在较长的时间内保持治疗上最佳 的血浆水平。在此，全身性的作用通过如此来达到，即活性物质以被 动扩散的方式穿过皮肤并被皮下毛细血管吸收入血流中。活性物质还 可以暂时沉积或结合在皮下脂肪组织中，以便从那里缓慢地洗入血液 循环中。在皮肤本身中，活性物质按照意图只有少量的保留。因此， 所述系统不适合于治疗神经病痛或者神经变性引起的皮肤感觉功能的 减退。
已知脂质体是作为用于受控释放药物活性物质的手段(例如参见 Ulrich，Biosci Rep.2002；22(2)：129-50中的综述)，特别地还为 在特殊的经皮“膏药”-系统中(例如公开于WO-8701938和US-5718914) 和在凝胶中(US-5064655)使用的手段。局部麻醉药在局部施用的脂 质体中的制剂对于技术人员来说也是已知的；例如US-4937078描述的 脂质体，其含有常用的钠通道阻断剂如丁卡因、利多卡因等。
虽然描述了用作镇痛剂的胆碱酯酶抑制剂新斯的明(Neostigmin) 的脂质体制剂(Grant等人，Acta Anaesthesiol Scand。2002；46(1)： 90-4)，但是是鞘内(即在结缔组织中)给予的，从而所观察到的麻 醉作用是中枢神经的麻醉。
发明简述
因此，本发明的任务是发现一种给予具有对于神经元烟碱性受体 的已知作用和/或NGF-样神经营养活性的胆碱酯酶抑制剂的方法，从 而不仅可以最小化或避免膏药应用的已知缺点(例如要求尽可能平的 表面用于涂覆膏药；可能的皮肤刺激；膏药中的活性物质浓度必须非 常高；渗透增强剂可能造成皮肤损伤)，而且可以最小化或避免侵入 性施用方法和其他全身性使用方式的缺点，特别是与所需的高剂量相 关的、不希望的全身性副作用。
因此，本发明的目标是提供具有胆碱酯酶抑制剂的药物组合物， 其允许这些活性物质的总体剂量低，但同时在皮肤神经末梢范围内的 局部剂量又足够高，同时尽可能避免其全身化。
本发明的另一个目标是提供一种组合物，其可以涂在身体的任何 部位，特别是还可涂在不适合于膏药应用的“不平的”位置处，例如 在糖尿病性神经病变时的足部、三叉神经痛时的脸部。
本发明的另一个目标是提供一种组合物，其不在皮肤上引起浸渍 现象，这在已经先前受损的和/或脆弱的皮肤的情况下是特别重要的， 例如在糖尿病患者中。
本发明的另一个目标是提供一种组合物，其作为无菌产品制备， 和由此可以例如在带状疱疹的情况下于小疱阶段或者愈合期作为治疗 剂涂覆。
最后，本发明的目标还在于提供一种组合物，其在皮肤中产生活 性物质贮存库，从该贮存库中连续地释放出物质，此外，由此与全身 性应用相比获得更好的生物利用率和更长的半寿期。
根据本发明，这些目标通过提供用于局部给予胆碱酯酶抑制剂的 脂质体系统而达到。
令人惊奇地证实，通过将胆碱酯酶抑制剂包封入具有确定组成和 大小的脂质体中，并随后将这些脂质体配制入适合于经皮给药的盖伦 氏系统中，可以实现前述的目标。在此，对于脂质体的制备和用活性 物质加载，在WO-0236257中公开的、可标度化的用于活性物质胶囊化 的方法经证明是特别有利的，因为其同时在极为温和的操作条件下具有 高的有效性。但是，同样也可以采用其他在现有技术中已知的用于制备 和加载脂质体的方法。
发明详述
用活性物质加载脂质体可以划分成两种主要类别：膜的加载和脂 质体内水相的加载。由于加兰他敏-碱溶于乙醇，所以首先尝试了将活 性物质分子整合入脂质体膜中，然而没有成功。越多的加兰他敏没有 包封入膜中，而是通过过滤而被除去，就会有越多的加兰他敏仍由该 膜再次释放出来。结合在膜上的和未结合的加兰他敏的份额大致是同 样多的。由于这一原因，随后尝试了用加兰他敏加载脂质体内的水相。 这一过程可以以两种方式来实现：通过主动和被动的加载。从对于用 在PBS溶液中的加兰他敏-HBr/碱被动加载脂质体的试验中表明，因而 不能制得稳定的加兰他敏-脂质体-悬浮液。如已经在先前的膜试验中 的一样，一旦未包封的活性物质被从周围介质中去除，活性物质就还 会从含水环境中扩散出来。
因此，要求更详细一些地检查活性物质加兰他敏。在此，发现加 兰他敏具有类似于阿霉素(Doxorubicin)的化学特性，并可以通过 pH梯度控制的加载而包封在脂质体中。对于这种类型的主动加载，重 要的特征是脂质体膜/脂质体介质-分配系数。发现辛醇/缓冲液-分配 系数为物质的跨膜扩散提供了很好的提示，因而与用活性物质加载或 者释放特性有关。此外，活性物质必须含有可质子化的氨基，从而在 低pH的情况下该活性物质是亲水的，且在中性或碱性pH情况下是亲 脂的。
基于该理论模型，在合适的加载缓冲液中，优选在柠檬酸/碳酸钠 -缓冲液中制备具有不同脂质组成的脂质体，优选具有长链的磷脂和低 的胆固醇浓度。由于脂质体在低pH的情况下制备，所以周围的介质被 碱化，并由此产生pH梯度，在将加兰他敏加入碱化的介质之后，活性 物质借助于该pH梯度而迁移入脂质体中，在那里质子化，并稳定地停 留在脂质体中。
在使用这一技术时，加载的规模或者说加载容量首先取决于脂质 体内部和外部pH值的比例。在所实施的试验中，用200-400nmol活 性物质/μmol脂质的活性物质/脂质-比例能够获得类似的值，正如可 从关于主动加载的脂质体的文献中可获知的。升高加载介质中的活性 物质浓度不导致加载容量的增加。
前述的主动加载是一个三步过程，其由小泡形成、添加活性物质 和碱化组成。因此，本发明的另一个目标是建立一步制备方法，其可 以通过使用在WO-0236257中公开的叉流模块(Kreuzstrom-modul)来 实现。为此目的，将加兰他敏溶解在柠檬酸溶液中，借助于叉流注射 技术包封入脂质体中，并随后用稀释缓冲液(柠檬酸/碳酸钠pH 9.0-9.5)直接将剩余的柠檬酸溶液碱化。
在下面的实施例中尤其指出了，加载了活性物质的脂质体的质量 仅仅通过小泡膜中的胆固醇含量的变化，特别是降低，就已经可以得 到改善，主要是在其皮肤渗透性方面。此外，对于来自三步和一步方 法的产品进行的稳定性测试表明，在所述这两种产品的情况下，在超 过六个月的储存之后，产品稳定性和质量保持不变。
如果需要或希望，可以通过将大约150-200nm的平均脂质体大小 (如在此所述的实验中大多数所采用的)增加至300-500nm来进一步 提高加载容量。另外，操作方法的效率，即每ml悬浮液中的包封在脂 质体中的活性物质的量，还可以通过在制备小泡期间或者在随后过滤 小泡时增加脂质浓度而更加进一步地得到提高。
附图简述
图1：显示了用于制备脂质体的装置的示意性图。
图2：显示了在脂质体中加兰他敏包封试验的HPLC结果。暗色的柱为 保留物中的加兰他敏(即脂质体加兰他敏)，而亮色的柱为滤 液中的加兰他敏(未包封的加兰他敏)，和空的柱为加兰他敏 的总含量。纵坐标：以μg/ml表示的加兰他敏。
图3：显示了在脂质体中加兰他敏包封试验的HPLC结果。暗色的柱为 保留物中的加兰他敏(即脂质体加兰他敏)，而亮色的柱为滤 液中的加兰他敏(未包封的加兰他敏)，和空的柱为加兰他敏 的总含量。前三个柱：阳性加载了硬脂胺的脂质体；后三个柱： 阴性加载了E-PG的脂质体。3A：加兰他敏-HBr；3B：加兰他敏 -碱。
图4：显示了在脂质体中加兰他敏包封试验的HPLC结果。暗色的柱为 保留物中的加兰他敏(即脂质体加兰他敏)，而亮色的柱为滤 液中的加兰他敏(未包封的加兰他敏)，和空的柱为加兰他敏 的总含量。
图5：显示了在不同pH的水相的情况下主动加载的加兰他敏-脂质体 的稳定性测试结果。纵坐标：以nmol活性物质/μmol脂质表示 的活性物质浓度；横坐标：从制备该制备物开始计的以周表示 的时间。
图6：显示了依据温度和加载持续时间用加兰他敏加载预先成型的脂 质体的HPLC数据。以使用的加兰他敏浓度的百分比给出。
图7：显示了来自两种制备试验的在加兰他敏过量的情况下主动加载 的脂质体的HPLC数据。暗色的柱为未包封的加兰他敏的量，亮 色的柱为包封在脂质体中的加兰他敏的量。三角形符号(附属 的值：右边纵坐标)之间的亮色的线指出了稳定的脂质/活性物 质-比例。
图8：显示了脂质体制备物的稳定性数据，其中所述脂质体在一步方 法中用加兰他敏主动加载。纵坐标：以nmol活性物质/μmol脂 质表示的活性物质浓度；横坐标：从制备该制备物开始计的以 周表示的时间。
图9：显示了下列主动加载的加兰他敏-脂质体的稳定性数据：A)以 三步方法制备的；B)以一步方法制备的。
图10：显示了主动加载的DMPC-脂质体的加兰他敏包封率和稳定性。
图11：显示了依赖于胆固醇含量的DPPC-脂质体中的加兰他敏吸收。
图12：显示了根据硫酸铵梯度方法制得的加兰他敏-脂质体的稳定性 测试。F1、F2、F3用于标明滤液试样，R表示保留物。
图13：显示了含有具有不同链长(A：C16，和B：C14)的脂质的加兰 他敏脂质体在水凝胶制剂中的稳定性。
图14：显示了对于具有不同脂质组成的脂质体加兰他敏-制备物进行 的体外皮肤渗透研究的结果。纵坐标：在每个试样中的绝对ng 加兰他敏；横坐标：脂质组成的变化。
图15：显示了反复施用之后对于脂质体加兰他敏-制备物进行的体外 皮肤渗透研究的结果。
图16：显示了依据试样量和渗透持续时间的对于脂质体加兰他敏-制 备物进行的体外皮肤渗透研究的结果。
图17：显示了依据水凝胶浓度的对于脂质体加兰他敏-制备物进行的 体外皮肤渗透研究的结果。
图18：显示了对于微乳液形式的脂质体加兰他敏-制备物进行的体外 皮肤渗透研究的结果。
图19：显示了与包封在脂质体中的加兰他敏相比较，对于基于游离存 在的加兰他敏的水凝胶制备物进行的体外皮肤渗透研究的结 果。
图20：显示了对于悬浮液形式的或作为凝胶的脂质体加兰他敏-制备 物进行的体外皮肤渗透研究的结果。
图21：显示了在不同的皮肤试样中对于脂质体加兰他敏-制备物进行 的体外皮肤渗透研究的结果。
为了更好地进行阐述，本发明将借助于下面的实施例作进一步的 解释。试验的实施采用作为活性物质的加兰他敏，其为游离的碱的形 式或者作为HBr-盐。技术人员容易理解，在本发明的范围内，加兰他 敏还可以以其对映异构体和其所有药学上可接受的盐的形式使用。同 样地，在本发明的范围内还包括加兰他敏的化学衍生物及其对映异构 体，例如在WO-9612692、WO-9740049和WO-0174820中所要求保护的分 子，只要其为胆碱酯酶抑制剂和/或烟碱性受体调节剂和/或显示出神 经营养性的、NGF-类型的作用，其中脂质体的组成和大小可以适应于这 些分子的物理化学特性。
在同样的意义上，对于专业人员来说明显的是，除了加兰他敏之外 的其他物质及其盐和衍生物同样也在本发明的范围内，只要其为胆碱 酯酶抑制剂和/或烟碱性受体调节剂和/或显示出神经营养性的、NGF- 类型的作用。属于此的，除了所有在现有技术的引导性描述部分中所 列举的物质之外，特别地还有在WO 02059074中所述的分子，同样还有 如在WO 0178728和WO 0198271中所述的多奈哌齐的衍生物，特别是还 有其氟-衍生物ER-127528。
实施例1：加兰他敏-脂质体的制备和稳定性检验
为了制备小泡，使用合成的二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC，Genzyme， Schweiz)和胆固醇(Solvay，Niederlande)。一些实验使用鸡蛋磷 脂酰甘油(E-PG；Fa.Lipoid，Deutschland)或者用硬脂胺(Sigma，USA) 来进行，以便在脂质体膜中引入阳性或阴性加载。将加兰他敏 (Sanochemia AG，Austria)以游离的碱或者以HBr-盐用于包封试验。 使用PBS(磷酸缓冲盐水)或者联合碳酸钠的柠檬酸作为缓冲溶液。
优选地，借助于根据WO-0236257的无剪切力的叉流注射技术来制 备脂质体。该技术具有非常良好的可重复性，和允许任何活性物质包 封入脂质体中。该可连续进行的一步方法使得能够通过改变操作条件， 特别是脂相的注射压力，来稳定地制备具有指定的、可预先选择的平 均大小和大小分布的带有脂双层(“双分子层”)的单层脂质体。此 外，其还可以在非常温和的操作条件下施行，并使得能够完全放弃使 用可能有害的溶剂，以及特别是放弃使用剪切力来形成小泡。这一方 法的其他优点在WO-0236257中有详细的描述。
此外，用此方法能够以经消毒的或无菌的形式提供所有的试剂和在 无菌的条件下进行脂质体的制备和加载，从而最终产生以加载有活性物 质的脂质体形式存在的经消毒的或无菌的产品。
包封的加兰他敏的检测，在搅拌池(Amicon，USA)中进行超滤和 /或渗滤(Diafiltration)之后或者于在Sephadex G25柱(Pharmacia， Deutschland)上进行凝胶过滤之后，借助于rp-HPLC(反相高效液相 色谱)来进行。内部rp-HPLC技术使得能够在唯一的工艺过程中定量 测定膜成分胆固醇和活性物质加兰他敏。脂质体的大小和分布借助于 光子相关光谱法(PCS)来测定。
脂质体制备：
脂质体优选借助于叉流技术来制备。如在图1中所描绘的，用于 脂质体制备的装置由叉流注射模块1、用于极性相的容器(注射缓冲 液2和稀释缓冲液3)、用于乙醇/脂质溶液的容器4和氮气压缩机5 构成。叉流模块中的注射口的直径为大约250μm。优选地，将脂质混 合物于25-60℃的温度(根据脂质选择或脂质组成)在搅拌下溶解在 96％乙醇中，优选地在DPPC-脂质体的情况下，温度为50-55℃。优选 地，也将缓冲溶液的温度调节至同样的温度，优选55℃。在借助于泵 6，例如蠕动泵，将极性相抽吸通过叉流模块期间，同时将乙醇/脂质 溶液在可预先任意选择的压力下注射入极性相中。
变体方案I：
将DPPC、胆固醇和硬脂胺(摩尔比为7∶2∶1)与加兰他敏一起溶 解在96％乙醇中，并注射入PBS缓冲液中。在自发形成脂质体之后， 将其过滤，并且用rp-HPLC分析保留物以及滤液。如可从图2中所见 的，不能将加兰他敏以这种方式稳定地整合入脂质体中。滤液(未包 封的加兰他敏)和保留物(包封在脂质体中的加兰他敏)显示出相同 的活性物质浓度。
在图2中：
柱1：表示给出的加兰他敏的总含量；
柱2和3：表示在第一次渗滤之后(柱2)和在又一次渗滤之后(柱3) 滤液和保留物中的活性物质分布。
变体方案II：
再次将脂质溶解在乙醇中。对于用阴性加载的脂质体所进行的试 验，用鸡蛋磷脂酰甘油(E-PG)代替硬脂胺。将乙醇/脂质溶液注射入 PBS/加兰他敏碱的溶液或者PBS/加兰他敏-HBr溶液中。
如可从图3A和3B中所见的，还根据该方法，将加兰他敏并不令 人满意地包封入脂质体中。在过滤之后，在滤液和保留物中发现了相 同量的加兰他敏。
在图3A和3B中：
柱1和4：表示各给出的加兰他敏的总含量；
柱2和3或者柱5和6：表示在第一次渗滤之后(柱2和5)或者在又 一次渗滤之后(柱3和6)滤液和保留物中的活性物质分布。
变体方案III：
借助于pH梯度用加兰他敏对脂质体进行外部加载。将脂质(DPPC∶ 胆固醇的摩尔比＝55∶45)溶解在乙醇中，并将该溶液注射入300mM 柠檬酸(pH 3.5-4.5)中。在自发形成小泡后，加入加兰他敏-HBr， 并用500mM碳酸钠将该溶液碱化。以这种方式，在脂质小泡(脂质体) 的内侧和外侧之间形成了pH梯度。低于2.5的pH值由于所出现的水 解问题而是较不适宜的，同样地，大于5.5的pH值由于总是变得平缓 的pH梯度而不是优选的。
如可从图4中所见的，在滤液中的加兰他敏份额显著少于在保留 物中的，这证实大部分的加兰他敏明显沿着pH梯度迁移入脂质体中， 在那里质子化，并滞留在脂质体内部的酸性介质中。
在图4中：
柱1：表示给出的加兰他敏的总含量；
柱2和3：表示在第一次渗滤之后(柱2)或者在又一次渗滤之后(柱 3)滤液和保留物中的活性物质分布。
将该产品分成多个等分试样，并进行稳定性测试。在图5中描绘 了在9周的时间内的产品稳定性，
为了测定用加兰他敏主动加载脂质体的动力学，研究了加载过程 的持续时间和确定了最佳加载温度。如可从图6中所见的，在足足15 分钟内，全部加兰他敏的量迁移入脂质体中，并且不仅对于活性物质 的吸收，而且对于脂质体内的活性物质的保留，室温(18-22℃)范围 内的温育温度是有利的。但是，对于22-40℃范围内的温度而得到的 差异要小，并且肯定不起重要作用。更高的温育温度的负面影响看起 来首先在于影响加载的脂质体的稳定性，其中在60℃的温度下，在3 个小时的温育之后，活性物质的损失已经达到大约20-25％(图6)。
为了增加包封在脂质体中的加兰他敏的量，准备每ml溶液具有 8-10mg加兰他敏的溶液。如可从图7中所见的，过量的加兰他敏(暗 色的柱；左边纵坐标)并不能改善活性物质/脂质这一比例，该比例在 该试验中恒定地保持在大约200-300nmol加兰他敏/μmol脂质(三角 形符号之间的亮色的线；右边纵坐标)。因此，在通过pH梯度的主动 外部加载的情况下，有效加载量看起来首先取决于该梯度，而较少取 决于给出的活性物质浓度。
变体方案IV：
根据首先对于在前的结果的评价，建立了一步制备方法。将脂质 (DPPC∶胆固醇＝55∶45Mol％)溶解在乙醇中，并将该溶液注射入加兰 他敏-HBr/柠檬酸溶液(pH 3.5-4.5)中，随后在紧接着自发形成小泡 之后，加入碳酸钠/柠檬酸-缓冲溶液(pH 9.0-9.5)以便稀释和碱化 反应混合物，即所产生的脂质体悬浮液。通过在紧接着形成小泡之后 制备该pH梯度，加兰他敏不仅在一个步骤中被吸收入脂质体中，而且 稳定地滞留在那里。以这种方式吸收在脂质体中的加兰他敏的量(依 赖于pH值或者pH梯度)在至少100nmol加兰他敏/μmol脂质的范围 内，优选在至少150-400nmol加兰他敏/μmol脂质的范围内，例如当 pH值为3.5时通常在250-350nmol加兰他敏/μmol脂质的范围内(图 8-11)。在6周的观察时间内完全保持了该产品的稳定性(见图8)。
实施例2：以具有可变的脂质组成的脂质体或微乳液形式的加兰他敏制 备物的制备和比较
在该实施例中，使用合成的二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC，Genzyme， Schweiz)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC，Genzyme，Schweiz)和 胆固醇(Solvay，Niederlande)作为脂质。将加兰他敏(Sanochemia AG， Austria)以HBr-盐用于脂质体包封研究。使用柠檬酸/碳酸钠作为缓 冲溶液。
作为主动加载的第二种可能性，采用硫酸胺梯度方法。使用硫酸 胺溶液和葡萄糖溶液作为用于小泡制备的水相。在此，再次采用叉流 技术。在借助于凝胶过滤除去未包封的加兰他敏之后，用rp-HPLC测 定活性物质含量以及脂质含量。脂质体的大小和分布也还是借助于光 子相关光谱法(PCS)来测定。
除了脂质体之外，还通过在用多个热循环进行逐步加热(加热至 80℃)的情况下剧烈混合来制备微乳液形式的制备物。使用肉豆蔻酸 异丙酯(IPM)作为油相。Tween和Span 20用作乳化剂和共乳化剂。 脂质体设计和稳定性：
与实施例1中一样，进行脂质体的制备、加载和分析。接着进行 脂质摩尔比为DPPC∶胆固醇＝55∶45的脂质体样品的稳定性测试。结果 显示在图9A和9B中。
图9A显示了第一个成功地根据主动方法用加兰他敏加载的脂质 体样品的稳定性数据。在0.3mol柠檬酸(pH 3.5-4.5)存在下制备 脂质体。在小泡形成之后加入加兰他敏，并同时将脂质体外部溶液的 pH值提高至7.5。由此产生的在脂质体内侧和外侧之间的pH梯度导致， 依赖于脂质体内部的H+离子浓度，加兰他敏被吸收进脂质体中。
图9B显示了具有类似组成的脂质体样品的稳定性数据，但其中小 泡形成和加兰他敏加载采用在一步方法中的叉流技术来进行。数据明 显地显示出，pH梯度，因而包封在脂质体中的加兰他敏的含量，在超 过半年的时间内保持恒定。
为了确定在膜柔韧性和与之相关的皮肤渗透特性方面最好的脂质 体制剂，准备并测试具有不同脂质组成的多种不同的脂质体悬浮液。 在此，首先使用磷脂，可选地与胆固醇组合。但是，用其他脂质代替 磷脂或者补充其他脂质也在本发明的范围内，例如糖脂、脑苷脂、硫 脑苷脂或半乳糖苷。可使用的脂质的典型代表为例如磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘 磷脂、缩醛磷脂、甘油糖脂、神经酰胺、鞘糖脂、中性鞘糖脂。
一种改善对于经皮施用来说重要的膜流动性的可能性在于减少脂 质体双层膜的相转变，其尤其由磷脂的酰基链的长度、胆固醇的量和 磷脂的饱和度确定。出于这一原因，将DPPC，一种酰基链长度为16 个碳原子的磷脂，用DMPC(链长为14个碳原子)替代，其将熔点TM 从大约45℃降低至31℃。
图10显示这样的脂质体悬浮液的包封率，所述脂质体悬浮液借助 于3.5-7.5和4.0-7.5的pH梯度来制备。在获得令人满意的包封率(与 在使用DPPC时的包封率相当)之后，获取样品并检测其稳定性(图 10)。
第二种降低膜刚性和增加流动性的可能性在于减少膜中的胆固醇 含量。从55∶45Mol％的DPPC∶胆固醇比例(如在文献中对于脂质体加 载所描述的)开始，将胆固醇的量连续地减少至38或30％，基于总脂 质含量。在图11中，可以看到，与具有更高胆固醇含量的以前的数据 相比，加兰他敏加载具有轻微的减退。但是，这些脂质体显示出改善 的皮肤渗透特性，如下文中还将进行描述的。此外，图11还显示了加 载的脂质体在长时间试验中保持稳定并且没有丢失加兰他敏。
与从以前的工作中获得的认识相反，还可以稳定地制备无胆固醇 的脂质体，并成功地用活性物质进行加载，从而根据本发明，胆固醇 含量在0-50Mol％的范围内，基于总脂质含量。
第三种使得脂质体膜更柔韧的可能性在于用鸡蛋磷脂酰胆碱 (E-PC)，一种具有不饱和磷脂的天然脂质混合物，来代替完全饱和 的DPPC-或DMPC-脂质。除了在使用这些天然脂质时的稳定性问题之 外，还需要在氮气气氛下制备脂质体。尽管如此，这些小泡既没有显 示出在小泡大小和均一性方面的良好结果，也没有显示出皮肤渗透特 性方面的改善，如在实施例3-10中所描述的。
除了用于产生pH梯度的柠檬酸/碳酸钠技术之外，通常还可以采 用硫酸胺梯度方法。使用该方法，在硫酸胺缓冲液(125mmol)存在 下形成脂质体。在小泡形成之后，借助于渗滤将脂质体外部的硫酸胺 溶液用5％葡萄糖溶液替代，由此可以将小的两亲性分子加载入脂质体 中并在那里质子化，同时与此相反地，NH3从脂质体中逸出。众所周 知，该过程是比柠檬酸/碳酸钠方法更温和的方法。
然而，在使用加兰他敏作为用于加载脂质体的活性物质的情况下， 这些试验无论如何都没有给出令人满意的结果。在图12中的数据表 明，加兰他敏的包封失败了，因为在保留物中和在滤液中能够发现相 同量的活性物质。因此，对于将加兰他敏包封入脂质体中，优选用于 外部主动加载的柠檬酸/碳酸钠方法，但其中在本发明的范围内，还可 以使用可选择的、技术人员已知的、在功能上等价的酸/碱-系统来形 成所希望的pH梯度。因此，可以用其他合适的、制药上允许的酸来代 替柠檬酸，例如无机酸如磷酸，或者优选有机酸，特别是选自可食用 的有机酸的那些，如苹果酸、富马酸、酒酸，可选地还有抗坏血酸。 同样地，还可以用另一种碱来代替碳酸钠，特别是另一种碱金属或碱 土金属的碳酸盐或者碳酸氢盐。
在本文中，“在功能上等价的”涉及这样的能力，即能够越过脂 质双层膜形成pH梯度并且在那里并不破坏膜的完整性，从而被包封 的、特别是质子化的活性物质稳定地(在此处公开的稳定性标准的意 义上)滞留在脂质体中。
加兰他敏-脂质体凝胶的制备和稳定性检测：
为了将脂质体的加兰他敏组合物用作待局部使用的治疗剂，优选 地将脂质体混合入水凝胶中，其比纯悬浮液更易于涂覆在皮肤上。但 是，在本发明的范围内，还可以制备和局部使用对于加兰他敏-脂质体 的其他盖伦氏制剂，特别是溶液、洗液、乳液、酊剂、喷雾剂、软膏、 霜剂形式的制剂，或者可选地还有经浸渍的纺织织物或者绷带材料的 形式的那些。本领域技术人员相信有其他的可能性，如用于制备各种 不同的盖伦氏制剂的、为此所需的、制药上允许的伴生物质和添加剂 一样。
在以前的实验中，已经验证了例如Carbopol 981NF，一种水凝胶， 其可以在非常低的浓度下使用。其允许用于药物应用，能够以相对便 宜的价格买到，和有大量的可动用。
制备下列脂质体凝胶，以用于使用Franz-扩散池的渗透研究：
DPPC∶胆固醇＝55∶45/pH3.5
DPPC∶胆固醇＝62∶38/pH3.5
DPPC∶胆固醇＝70∶30/pH3.5
DMPC∶胆固醇＝55∶45/pH3.5
E-PC∶胆固醇＝63∶38/pH3.5
E-PC∶胆固醇＝70∶30/pH3.5。
为此目的，将小泡悬浮液通过超滤进行浓缩，并随后在搅拌下与 预制的无菌凝胶基材混合。在这种方法中，可以通过超滤或者通过用 小泡悬浮液稀释至0.5％的Carbopol-浓度的凝胶基材的初始浓度来改 变脂质体的加兰他敏浓度。
根据标准，就可能的活性物质损失进行测试，其可以是由于在盖 伦氏生成操作过程期间的膜损伤和/或长时间储存而引起的。为此目 的，用缓冲液将凝胶稀释并过滤。在膜受损的情况下，可以在滤液中 检测到更大量的释放出的加兰他敏。如可从图13A和图13B中所见的， 既没有在盖伦氏配制过程期间，也没有在随后的19周4℃下的储存期 间释放出显著份额的活性物质。在用Carbopol-水凝胶进行盖伦氏配 制之后活性物质仍然还保留在脂质体中，并且其在皮肤测试中显示出 依然如故的渗透特性，这证明在凝胶基质中，不仅脂质体而且pH梯度 保持完整。
为了就皮肤渗透特性方面进行比较，还以同样的类型和方式将游 离的加兰他敏与水凝胶混合并进行测试。结果呈现在实施例3-10中。 可选择的方案：
除了脂质体之外，对于确定的活性物质的局部应用，微乳液近来 也引起了越来越大的对于它的注意力。微乳液是两种互不相溶的组分 的分散体，其通过第三种两性的组分来进行稳定。但是，由于存在表 面活性物质如乳化剂和共乳化剂，以类似的类型和方式如经皮的膏药， 微乳液可能损伤皮肤。
根据在前的文献研究，用制备了多种具有加兰他敏作为活性物质 的微乳液(表1)，并随后用Franz-扩散池进行渗透测试(结果请参 见实施例3-10)。
表1：微乳液 卵磷脂ME W/O ME O/W ME 10ml IPM 1.9g SPC 135μl H2O 10mg Gal 7.2ml IPM 0.2g Chol 0.5g H2O 2g Tween/Span20 10mg Gal 5.5g H2O 2.5g IPM 2g Tween/Span20 11mg Gal-HBr 5mg Gal
ME＝微乳液；W/O＝油包水；O/W＝水包油
在所有与此处所描述的试验中均表明，仅仅降低脂质体膜中胆固 醇的含量就因此改善了经皮的渗透特性。制成的脂质体悬浮液和脂质 体的凝胶制备物自从超过半年的时间以来一直是稳定的，并且没有显 示出产品特性的改变。
实施例3-10：各种不同的基于脂质的加兰他敏制备物的皮肤渗透测试 Franz-扩散池：
扩散池来自PermGear，USA。该设备包括三个扩散池，每一个装 配有位于搅拌器支架长的充满水的双层夹套，并连接有水浴以便控制 温度。池本身具有各8ml的容积，表面积为0.78cm2的皮肤固定夹， 和容积为2ml的给料室。
皮肤完整性测试：
对于在Franz-扩散池中的测试，可以使用猪皮。为了保证完整的 皮肤表面，在实验之前和之后测试每块皮肤。在将皮肤固定在扩散池 的皮肤固定夹上之后，将2ml缓冲液涂覆在皮肤上，并将温度调节至 32℃±1。30分钟后，测量电导率，其是皮肤电阻和皮肤质量的量度。 测量值取决于皮肤的来源、其厚度、所使用的缓冲系统和用于测量的 设备。基于多个基础实验，确定在涂覆样品之前完整皮肤的电导率的 阈值为≤1mS/cm2。不满足该要求的皮肤样品不允许进行渗透实验。
渗透缓冲液：
在0.3M柠檬酸缓冲液(用1M碳酸钠溶液调节至pH 7.5)中制 备根据本发明的脂质体，在这之后，也将同样的缓冲液用于所有的渗 透试验。
渗透试验后的样品处理：
在每个结束的实验之后，通过用缓冲液洗涤表面来去除过量的加 兰他敏样品。之后，再次测量电导率，并将皮肤样品从固定夹上取下。 为了分离表皮和真皮，将皮肤样品放在电热板上，并于60℃加热30 秒。在这样的热处理之后，可以借助于镊子容易地将表皮完全揭下。 在这之后紧接着将各自相互分开的表皮和真皮转移入塑料小管中，并 在-20℃下冷冻。为了提取加兰他敏，在液氮存在下向冷冻的样品中加 入300μl缓冲液，并随后在低温研磨机中将深度冻结的样品磨成粉 末。将粉末立即转移入离心管中，并在4℃下离心，接着将澄清的上 清液转移入干净的小管中，并在-20℃下重新冷冻直至开始进行分析。 加兰他敏-上清液的定量：
为了测定少量的加兰他敏，建立了经修饰的、灵敏的并且快速的 rp-HPLC方法：
HPLC：Agilent 1100
柱：Thermo Hypersil Keystone
150×4.6mm，5μm，190A
梯度：线性梯度
溶剂A：H2O/0.1％TFA
溶剂B：ACN/0.1％TFA
检测：DAD，230nm
定量范围：30-1000ng/ml
注射体积：100μl
测试材料：
用多种不同的加兰他敏制剂对多个样品进行测试。改变给料体积 和渗透设计，这些改变概括在结果中。
材料：
-脂质体加兰他敏悬浮液：
C16/3.5/(55/45)
C14/3.5/(55/45)
-脂质体加兰他敏凝胶：
C16/3.5/(55/45)
C16/3.5/(62/38)
C16/3.5/(70/30)
C14/3.5/(55/45)
E-PC/3.5/(62/38)
E-PC/3.5/(70/30)
-游离的加兰他敏凝胶：
2-20mg/g凝胶
-加兰他敏-微乳液：
卵磷脂-ME(1mg/ml)
水/油(W/O)-ME(1mg/ml)
油/水(O/W)-ME(1.6mg/ml)。
借助于叉流注射技术来制备不同的脂质体加兰他敏制剂。不仅在 悬浮液中，而且在Carbopol(981NF)-凝胶基材中测试材料。通过使 用不同的脂质和不同的胆固醇含量(参见实施例1和2)来获得脂质 体膜组成的变化。
以不同的样品体积、单次和多次样品给料来进行下文中的渗透研 究，其中以一定的时间间隔获取用于加兰他敏测定的样品。在图14 和21中所描述的结果各基于一个一式三份的渗透研究。所述图显示了 以“绝对ng加兰他敏/分析的样品”表示的结果。
结果分成从接受液体REZ(＝在接受容器中收集的、渗透过皮肤 的液体)中测定的值，和从表皮(EP)和真皮(DER)中测定的值
实施例3：
在实施例3中，将具有不同胆固醇含量的不同的DPPC(C16)-脂 质体的结果与DMPC(C14)-脂质体和E-PC-脂质体的结果进行了对比。 一次涂覆50μl的样品体积，并让其渗透4个小时的时间。所有经测 试的制备物显示出相当的包封的加兰他敏的量，并将这些制备物悬浮 在0.5％Carbopol 981NF中。在该试验中最有效的制剂具有C16/70/30 (酰基链长度/Mol％磷脂/Mol％胆固醇)脂质组成的样品。在该凝胶中， 脂质体中的胆固醇浓度为30Mol％。其他两种制备物具有显著更高的 胆固醇份额(38或45Mol％)，因而是明显更为刚性的。从该试验中 测定的数据证实了这一理论，即流动性更强的脂质体，也就是刚性较 小的膜，能够更有效地渗透(图14)。
在图14中：
1＝C16/55/45；2＝C16/62/38；3＝C16/70/30；
4＝C14/55/45；5＝E-PC/62/38；6＝E-PC/70/30。
实施例4：
在实施例4中，在皮肤上反复涂覆之后，研究了凝胶样品的渗透 特性。比较了两种具有不同脂质组成但胆固醇含量相同的不同的凝胶。 样品各以50μl涂覆3次，每次间隔4小时。过量的材料各在涂覆下 一次样品之前去除。
如可从图(图15)中所见的，虽然最后达到了加兰他敏浓度的提 高，但是似乎在三次涂覆材料的情况下不知怎么地妨碍或阻止了渗透 进表皮中。在此，可能涉及某一类型的饱和，其是由于所装入的皮肤 块的小表面积以及高使用剂量而引起的。对于两种样品得到了相当的 结果，从而不能明显地看出来脂质组成的影响(图15)。
在图15中：
(链长/磷脂/胆固醇/总的样品量)
1＝C16/55/45/50μl；2＝C16/55/45/100μl；3＝C16/55/45/150μl；
4＝C14/55/45/50μl；5＝C14/55/45/100μl；6＝C14/55/45/150μl。
实施例5：
在实施例5中，在一次涂覆之后相互比较有着具有高和低胆固醇 含量的C16-脂质体的凝胶。让150μl和50μl的样品体积渗透4或 10小时。再次在使用具有低胆固醇含量的脂质体时发现了最高的皮肤 中的加兰他敏量。在此，看起来也是低剂量是有利的。如果使用50μl， 则在4和10小时后，在表皮中发现了高加兰他敏量。这些结果证实了 在实施例3和4中获得的值，即在同时采用低的总施用量的情况下给 予具有低胆固醇含量的脂质体，可能是在预防或治疗应用中当局部使 用本发明的制备物时的一种有利的策略(图16)。
在此，在图16中：
(链长/磷脂/胆固醇/样品量/渗透持续时间)
1＝C16/55/45/150μl/4h；2＝C16/70/30/150μl/4h；3＝C16/55/45/50μl/4h；
4＝C16/70/30/50μl/4h；5＝C16/55/45/150μl/10h；6＝C16/70/30/150μl/10h；
7＝C16/55/45/50μl/10h；8＝C16/70/30/50μl/10h。
实施例6：
在实施例6中，研究了与游离的、悬浮在凝胶中的加兰他敏的三 种不同浓度相关的凝胶浓度的影响。一次涂覆50μl每种制剂，开进 行渗透实验4或10小时(图17)。图17中的前三个柱表示用1％ Carbopol 981NF在4小时后的结果，紧接着的三个柱表示用0.5％ Carbopol 981NF在10小时后的结果。4小时后的结果表明，游离的加 兰他敏相对较快地扩散入皮肤组织中。然而，如可从10h-值中看出 的，在接受液体中也发现了高浓度的游离活性物质，因而预期只有不 大的贮存效果(图17)。
实施例7：
在实施例7中，测试了不同的施用策略。从文献中已知，作为载 体系统的微乳液是用于给予小的两亲性分子的有利工具。为了检查这 一观念，制备每ml各具有1mg加兰他敏的微乳液(卵磷脂；油包水； 水包油)(见实施例1和2)。
每一次涂覆50μl的样品体积，并进行渗透4h的时间。如可从 图(图18)中看出的，绝对的皮肤中的加兰他敏量比在使用具有脂质 体的水凝胶时的低。此外，活性物质同样地分布在真皮和接受液体中， 从中可推断出，当在最好的情况下存在皮肤组织中的临界(marginal) 贮藏时发生了快速渗透(图18)。这些结果与其他作者的结果一致， 并表明与在使用经皮的加兰他敏膏药时类似的渗透机制。
实施例8：
在实施例8中，比较了用在水凝胶和微乳液中的游离加兰他敏获 得的结果与优选的脂质组成(具有低胆固醇含量的C16-磷脂)的结果。 在所有的试验中，在类似的条件下研究了相当的加兰他敏浓度。
如可从图(图19)中看出的，在使用具有游离的加兰他敏的水凝 胶制剂的情况下，在皮肤中发现了相当大的加兰他敏量。用脂质体制 剂也获得了可接受的值，而用微乳液获得的较小。但是，如在前面的 实施例中已经解释的，新的局部活性物质制剂的目标首先不是快速的 皮肤渗透而是形成皮肤中的活性物质贮存的能力，从该皮肤中可以延 缓释放活性物质。这样的贮存一方面可以减少使用的频繁程度，另一 方面可以引起更均匀的、受控的活性物质的给予，这将会增强治疗效 果。如果活性物质贮藏在上部的皮层中而不是更深的区域中，如在根 据本发明的脂质体制剂的情况下，则可以获得这样的效果。
在图19中：
1＝脂质体(C16/70/30)；
2＝1.8mg在水凝胶中游离的加兰他敏；
3＝1.8mg在卵磷脂-微乳液中游离的加兰他敏；
4＝1.8mg在W/O-ME中游离的加兰他敏；
和5＝1.8mg在O/W-ME中游离的加兰他敏。
实施例9：
在实施例9中，相互比较了在悬浮液中和在水凝胶中的脂质体制 剂。在至少24小时的时间内给予过量的1ml脂质体悬浮液仅导致低 的渗透效果(图20)。因此，看来似乎证实了，合适的凝胶基质不仅 稳定脂质体和使得涂覆更适意和更舒适，而且使得脂质体更接近皮肤， 从而增强了渗透作用。
在图20中：
(链长/磷脂/胆固醇/样品量/渗透持续时间/类型)
1＝C16/55/45/1ml/24h/悬浮液；2＝C14/55/45/1ml/24h/悬浮液；
3＝C16/55/45/100μl/8h/凝胶；4＝C14/55/45/100μl/8h/凝胶。
实施例10：
总的看来，借助于Franz-扩散池的体外测试为用于对不同的脂质 体制剂进行渗透研究的有利方法，即使当确定的该方法的可用性的界 限涉及天的时候，特别是在使用脂质体凝胶制剂的情况下。从以前的 在体内使用不同脂质体凝胶的经验开始，对于此处描述的体外渗透测 试还期望，每种凝胶能够完全渗透入皮肤中而没有剩余的量滞留在皮 肤表面上。但是，在使用Franz-扩散池的实验中没有能够以相同的效 果给予凝胶。在所有的试验，显著过量的样品材料滞留在皮肤表面上。 这一缺点可能不利地影响渗透效率。因此，期望体内更多量的脂质体 加兰他敏渗透入皮肤中。
但是，即使在此处描述的用各种不同的脂质体制剂进行的体外实 验之中，根据换算，毕竟还是有至多1.8×1016活性物质分子/0.78cm2皮肤表面转运入了表皮中。
为了检验具有皮区(Dermatom)的皮肤提取或者皮肤的预处理是 否可能是造成所观察到的施用问题的原因，测试了不同的皮肤样品(图 21)。然而，根据结果，确定没有明确的影响。因此，推测皮肤本身 并不显著地对所获得的结果产生负面影响。
在图21中：
1＝未处理的皮肤；脂质体：70/30(磷脂/胆固醇)；
2＝用乙醇洗净的皮肤；脂质体：70/30；
3＝用脂肪纱布(Fettgaze)处理的皮肤；脂质体：55/45；
4＝用乙醇洗净并用脂肪纱布处理的皮肤；脂质体：55/45。
不管怎样，可以概括地说，当治疗位点在皮肤组织(真皮)中时， 甚至当活性物质只是每天两次涂覆在皮肤上时，在亲水性凝胶中的脂 质体加兰他敏制剂是有利的剂型。通过根据本发明地、温和地、非侵 入性地且非皮肤刺激性地使用包封在脂质体中的活性物质，能够获得 显著的在表皮中的贮存效应，和活性物质缓慢而均匀地释放入位于其 下的皮肤组织中。
缩写：
ACN 乙腈
DAD 二极管阵列检测器
DER 真皮
DMPC 二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱
DPPC 二棕榈酰基磷脂酰胆碱
E-PC 来自鸡蛋的天然磷脂酰胆碱
E-PG 来自鸡蛋的天然磷脂酰甘油
EP 表皮
IPM 肉豆蔻酸异丙酯
NGF 神经生长因子
PBS 磷酸缓冲盐水
REZ 接受器皿(接受容器)
rp-HPLC 反相高效液相色谱
TFA 三氟乙酸