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1、(10)授权公告号 CN 101559166 B (45)授权公告日 2011.09.21 CN 101559166 B *CN101559166B* (21)申请号 200910039762.1 (22)申请日 2009.05.26 A61K 36/8968(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 苏薇薇 丁林伟 冯国培 许定舟 杨翠平 王永刚 刘碧珊 梁秉中 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 CN 1244403 A,2000。
2、.02.16, CN 1943735 A,2007.04.11, CN 1504486 A,2004.06.16, (54) 发明名称 一种麦冬提取物及其制备方法与降糖应用 (57) 摘要 本发明涉及一种麦冬提取物及其制备方法与 降糖应用。取麦冬药材， 煎煮 1 3 次， 每次加水 5 20 倍量， 每次煎煮 30 120 分钟， 过滤， 合并 水煎液 ； 浓缩至密度为 1.05 1.35g/ml 后加乙 醇至含醇量为体积百分比5080， 放置过夜后 收集沉淀， 沉淀用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化， 真 空冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取 物， 其含糖量达到9098(以果糖计)， 分子量。
3、 范围为 500-2000。经动物试验证明该麦冬提取物 具有显著的降血糖作用， 通过体外实验进一步阐 明其作用机制， 结果表明该提取物能通过抑制消 化道内 - 葡萄糖苷酶的活性、 降低小肠绒毛对 葡萄糖的吸收、 以及对胰岛细胞保护作用来降低 血糖， 提示该提取物可以用于开发治疗 II 型糖尿 病的药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙镜沂 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101559166 B1/1 页 2 1. 一种麦冬提取物的制备方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 取麦冬药材， 煎煮 1 3 次， 每次。
4、加水 5 20 倍量， 每次煎煮 30 120 分钟， 过滤， 合并水煎液 ； 浓缩至密度为 1.05 1.35g/ml 后加乙醇至含醇量为体积百分比 50 80， 放置过夜后收集沉淀， 沉淀 用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化， 真空冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取物。 权 利 要 求 书 CN 101559166 B1/6 页 3 一种麦冬提取物及其制备方法与降糖应用 技术领域 0001 本发明涉及麦冬提取技术及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。 背景技术 0002 麦冬为百合科植物麦冬 Ophiopogon japonicus(Thunb.)Ker-Gawl. 的干燥块根， 具有养阴生津。
5、、 润肺清心功效。 药理及临床试验研究表明， 从麦冬中提取得到的粗多糖能有 效的降低实验性糖尿病小鼠的血糖水平， 降低 II 型糖尿病患者空腹血糖和餐后 2h 血糖水 平， 改善胰岛素抵抗。 0003 现有技术对麦冬粗多糖的纯化， 一般是选用干燥麦冬为原料， 采用 “水提醇沉” 法 制得其粗提物， 然后用三氯甲烷 - 正丁醇沉淀蛋白质， 最后用双氧水脱色。中间涉及的化学 反应较多， 步骤繁琐， 存在着周期长、 成本高、 收率低、 稳定性差等问题， 严重影响制剂的品 质。 0004 凝胶分离技术是利用不同分子量的物质在凝胶内运动的轨迹不同而将其分离的， 具有操作简便， 所需设备简单， 分离效果较。
6、好， 重复性高， 分离条件缓和等特点， 可以提高产 品品质和得率、 简化生产工艺、 降低生产成本等。目前葡聚糖凝胶应用最广， 在中药提取物 特别是粗多糖提取物的除杂、 纯化和分离等方面显示出广阔的应用前景。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种提取麦冬的新方法及其提取物在制备降糖药物中的 应用。 0006 上述发明是通过如下方式来实现的 ： 0007 取麦冬药材， 煎煮13次， 每次加水520倍量， 每次煎煮30120分钟， 过滤， 合并水煎液 ； 浓缩至密度为 1.05 1.35g/ml 后加乙醇至含醇量为 50 80 ( 体积百分 比 v/v)， 放置过夜后收集沉淀， 沉淀用葡聚糖。
7、凝胶柱进行分离纯化， 真空冷冻干燥得到白色 疏松絮状结晶， 即麦冬提取物。 0008 所制备得到的麦冬提取物中含糖量达 90 98 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0009 所制备得到的麦冬提取物体外能够抑制消化道内 - 葡萄糖苷酶的活性。 0010 所制备得到的麦冬提取物能够降低高血糖模型大鼠的血糖。 0011 所制备得到的麦冬提取物能够降低小肠绒毛细胞对葡萄糖的吸收。 0012 所制备得到的麦冬提取物能提高脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力。 0013 所制备得到的麦冬提取物能够保护链脲佐菌素损伤的 胰岛细胞。 0014 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 本发明利。
8、用葡聚糖凝胶分离技术将 麦冬经水提醇沉后所得的沉淀物进行纯化， 并将纯化后的物质用于制备治疗糖尿病药物。 动物试验证明， 本工艺制得的麦冬提取物具有显著的降血糖作用， 通过体外实验进一步阐 明， 该提取物的降糖作用机制在于抑制消化道内 - 葡萄糖苷酶的活性、 降低小肠绒毛对 说 明 书 CN 101559166 B2/6 页 4 葡萄糖的吸收、 增强脂肪细胞对葡萄糖的吸收能力， 以及对胰岛细胞保护作用。 具体实施方式 0015 以下通过具体实施例和试验例对本发明作进一步说明。 0016 实施例 1 ： 0017 取麦冬药材200克， 加水煎煮提取1次， 加水20倍量， 煎煮2小时， 水煎液浓缩。
9、至密 度为 1.05g/ml， 加入乙醇至含醇量为 80， 放置过夜， 沉淀经过滤干燥后得到淡黄色粗品。 将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-75 柱进行纯化， 水洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱 液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取物， 经分析该提取 物含糖量为 90 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0018 实施例 2 ： 0019 取麦冬药材 200 克， 加水煎煮提取 1 次， 加水 10 倍量， 煎煮 2 小时， 水煎煮提取液 浓缩至密度为 1.18g/ml， 加入乙醇至含醇量为 50， 放置过夜， 沉淀经过滤。
10、干燥后得到淡 黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-50 柱进行纯化， 水洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮 法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取物， 经 分析该提取物含糖量为 96 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0020 实施例 3 ： 0021 取麦冬药材 200 克， 加水煎煮提取 2 次， 加水 5 倍量， 煎煮 2 小时， 合并 2 次水煎 煮提取液， 浓缩至密度为 1.08g/ml， 加入乙醇至含醇量为 60， 放置过夜， 沉淀经过滤干燥 后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephade。
11、x G-35 柱进行纯化， 水洗脱 ； 硫 酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提 取物， 经分析该提取物含糖量为 94 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0022 实施例 4 ： 0023 取麦冬药材200克， 加水煎煮提取2次， 加水20倍量， 煎煮0.5小时， 合并2次水煎 煮提取液， 浓缩至密度为 1.35g/ml， 加入乙醇至含醇量为 80， 放置过夜， 沉淀经过滤干燥 后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-50 柱进行纯化， 用水洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性。
12、反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬 提取物， 经分析该提取物含糖量为 97 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0024 实施例 5 ： 0025 取麦冬药材200克， 加水煎煮提取2次， 每次加水10倍量， 每次煎煮1小时， 合并2 次水煎煮提取液， 浓缩至密度为 1.24g/ml， 加入乙醇至含醇量为 70， 放置过夜， 沉淀经过 滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-75 柱进行纯化， 用水 洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取物， 经分析该提取物含。
13、糖量为 92 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0026 实施例 6 ： 0027 取麦冬药材 200 克， 加水煎煮提取 3 次， 每次加水 5 倍量， 每次煎煮 1.5 小时， 合 并 3 次水煎煮提取液， 浓缩至密度为 1.12g/ml， 加入乙醇至含醇量为 50， 放置过夜， 沉淀 经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-35 柱进行纯化， 用水洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结 说 明 书 CN 101559166 B3/6 页 5 晶， 即麦冬提取物， 经分析该提取物含。
14、糖量为 91 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0028 实施例 7 ： 0029 取麦冬药材 200 克， 加水煎煮提取 3 次， 每次加水 8 倍量， 每次煎煮 1 小时， 合并 3 次水煎煮提取液， 浓缩至密度为 1.27g/ml， 加入乙醇至含醇量为 60， 放置过夜， 沉淀经过 滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-75 柱进行纯化， 用水 洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结晶， 即麦冬提取物， 经分析该提取物含糖量为 95 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-200。
15、0。 0030 实施例 8 ： 0031 取麦冬药材 200 克， 加水煎煮提取 3 次， 每次加水 20 倍量， 每次煎煮 0.5 小时， 合 并 3 次水煎煮提取液， 浓缩至密度为 1.31g/ml， 加入乙醇至含醇量为 70， 放置过夜， 沉淀 经过滤干燥后得到淡黄色粗品。将该粗品溶于水中， 用葡聚糖 Sephadex G-50 柱进行纯化， 用水洗脱 ； 硫酸 - 蒽酮法检测洗脱液， 收集呈阳性反应部分， 冷冻干燥得到白色疏松絮状结 晶， 即麦冬提取物， 经分析该提取物含糖量为 96 ( 以果糖计 )， 分子量范围为 500-2000。 0032 实施例 9 ： 0033 麦冬提取物对。
16、 - 葡萄糖苷酶活性的体外抑制作用 0034 取 67mmol/L 的磷酸钾缓冲液 (pH 6.8)6ml、 3mmol/L 的谷胱甘肽溶液 0.2ml、 0.04mg/ml的-D-葡萄糖苷酶溶液0.3ml， 37温孵10min后， 加入0.01mol/L的吡喃葡萄 糖苷 (PNPG) 溶液 0.5ml， 作用 20min 后， 用 0.1mol/L Na2CO3溶液 10ml 终止反应， 在 400nm 波长下测定各组样品的吸光度。麦冬提取物 ( 见实施例 2、 4、 7) 用酸钾缓冲液配制成不同 浓度的供试液。 0035 抑制率 ( ) (A对照-A样品)/(A对照-A空白)100 003。
17、6 实验显示， 240mg/ml 的麦冬提取物能使 - 葡萄糖苷酶活性的降低 76.58。 0037 实施例 10 ： 0038 麦冬提取物对高血糖模型大鼠的降糖作用 0039 1) 动物分组 0040 健康 Wistar 大鼠 (SPF 级 )， 雄性， 体重 180-220g( 由广东省实验动物中心提供 )， 自由饮水进食， 随机分为正常对照组和造模组， 造模组按如下方法建立模型， 造模成功后 再将模型组动物随机分为模型对照组、 阳性药物组、 受试药物高、 中、 低剂量组， 连续给药 1 周。 0041 2) 大鼠模型制备 0042 正常组大鼠每天灌胃普通饮用水， 高脂组大鼠每天早晚灌胃自。
18、制脂肪乳 (1ml/100gBW)。连续灌胃脂肪乳 2 周后， 动物禁食不禁水 24h， 空白对照组 10 只尾静脉注 射生理盐水， 其余大鼠均尾静脉注射 30mg/kgBW 链脲佐菌素溶液 ( 临用前配制 )。给药 48h 后， 禁食不禁水 12h， 每隔 3 小时眼眶静脉丛取血， 按照血糖测定试剂盒操作测定空腹血糖 值， 连续测定 3 次， 空腹血糖值 16.7mmol/L 的为造模成功大鼠。 0043 3) 血糖测定 0044 末次给药后， 动物禁食 12h、 不禁水， 眼眶静脉丛取血， 按照试剂盒的方法分别测定 血糖值。采用 SPSS11.0 统计软件， 分析并比较各组血糖值及给药前后。
19、血糖值的变化情况。 0045 结果见表 1 说 明 书 CN 101559166 B4/6 页 6 0046 表 1 给药后血糖值比较 0047 0048 注 ： *p 0.05 vs 模型组 *p 0.01 vs 模型组 0049 p 0.05 vs 同组给药前 p 0.01 vs 同组给药前 0050 实施例 11 ： 0051 麦冬提取物对小肠刷状缘膜囊 (BBMV) 摄取葡萄糖的影响 0052 1) 小肠刷状缘膜囊的制取 0053 家兔处死后， 迅速取出胃幽门至回盲结合处之间的小肠段， 放入冰冻的 154mmol/ LKCl 中清洗 1h。放入 -80环境中进行保存。一周之后取出小肠段。
20、， 剪成小碎段在 200mlBuffer 1(10mmol/L D- 甘露醇， 2mmol/L Tris， pH 7.1) 溶液中震动 1min。过滤除 去结缔组织和肌肉组织， 滤液用 Buffer 1 定容至 300ml。加入 0.61g MgCl2并缓慢搅拌， 在 4， 3800g 下离心 15min。收集上清液， 在 4， 43000g 下离心 30min。弃去上清液， 用 5mlBuffer 2(100mmol/L D- 甘露醇， 0.1mmol/L MgSO4， 2mmol/L Tris， pH 7.4) 悬浮沉 淀物。4， 43000g 下离心 40min。弃去上清液， 用 1ml。
21、 Buffer 3(300mmol/L D- 甘露醇， 0.1mmol/LMgSO4， 10mmol/L Tris， pH 7.4) 悬浮沉淀物， 溶液用用带 25 号针头的注射器缓 慢反复抽打 5 次， 形成 BBMV。之后分装放置于液氮中迅速冷冻 (0.26ml/ 分装管 )， 然后放 入 -80环境中保存。 0054 2)BBMV 葡萄糖摄取实验 0055 用 0.44ml Buffer 3 重新悬浮 BBMV ； 实验前将麦冬提取物 ( 见实施例 1、 3， 5) 配 制至相应的浓度。取 50l BBMV 溶液、 30l 麦冬提取物供试液和 10l radioactive glucos。
22、e 溶液 (2Ci/ml 3H-2-GD， 0.4mmol/L 葡萄糖， 400mmol/L NaSCN， 400mmol/L 甘露 醇， 40mmol/L HEPES-Tris， pH 7.4)， 在室温条件下混合反应 60s 后， 加入冰冻的 stop-wash Buffer(200mmol/L NaCl， 10mmol/L HEPES-Tris， 250mol/L 根皮苷 ) 终止反应 ； 反应液用 0.45m 的硝基纤维膜过滤， 则 BBMV 被截留在膜上 ； 用 1ml 冰冻的 stop-wash Buffer 反复 清洗硝基纤维膜 5 次后， 采用闪烁计数法测定 BBMV 中的放射。
23、性强度。实验结果以药物组的 放射性强度占空白组的百分比表示。 0056 实验结果显示， 4.5mg/ml 的麦冬提取物能使小肠刷状缘膜囊对葡萄糖的吸收减少 39.96。 0057 实施例 12 ： 0058 麦冬提取物对 3T3-L1 脂肪细胞摄取葡萄糖的影响 0059 1)3T3-L1 细胞向脂肪细胞的诱导 0060 将 3T3-L1 细胞用含 10小牛血清的高糖 DMEM， 在 37、 5 CO2的条件下培养， 细 说 明 书 CN 101559166 B5/6 页 7 胞状态良好时接种于 24 孔培养板。待细胞生长至融合 2d 后， 加含 0.5mM 异丁基 -3- 甲基 黄嘌呤 (IB。
24、MX)、 0.5M 地塞米松 (DEX)、 5M 胰岛素和 10胎牛血清的高糖 DMEM 培养 3d。 换以含5M胰岛素的10胎牛血清高糖DMEM培养液再培养2d， 随后以含10胎牛血清的 高糖 DMEM 培养液继续培养， 每隔 2d 换 1 次培养液。诱导分化 8-12d 的 3T3-L1 细胞 90以 上呈脂肪细胞表型， 即可用于实验。 0061 2) 脂肪细胞摄取葡萄糖实验 0062 3T3-L1脂肪细胞在24孔培养板中用无糖DMEM培养基培养2h后， 分为对照组(不 加药 )、 麦冬提取物 ( 见实施例 2、 7、 8) 组、 阳性药物组 ( 胰岛素 )， 加上含相应药物的无 糖 DM。
25、EM 培养基， 在 37下培养 30min。弃去培养液， 用 PBS 清洗细胞 2 次。加入含 2Ci/ ml3H-2-GD 和 0.1mmol/L 2-DG 的无糖 DMEM 培养基 300l， 在 37下作用 15min。每孔加 入 1ml 冰冻的含 2-DG(10mmol/L) 的 PBS 溶液终止反应， 并用此溶液清洗 2 次。每孔加入 0.5mol/L 的 NaOH 溶液 200l， 充分震荡使细胞破碎裂解后， 再加入 0.5mol/L 的 HCl 溶液 200l中和。 每孔取出300l的细胞裂解液， 利用闪烁计数法测定其中的放射强度以确定 3H-2-GD 的摄取量。 0063 每孔。
26、再取出 100l 的细胞裂解液， 测定其中蛋白质的含量， 并将之作为一个参数 来修正经闪烁计数法测定的 3H-2-GD 的摄取量。 0064 实验显示， 6mg/ml 的麦冬提取物能使 3T3-L1 脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力提高 46.23。 0065 实施例 13 ： 0066 麦冬提取物对链脲佐菌素致 NIT-L1 胰岛细胞损伤的保护作用 0067 本实验用链脲佐菌素 (STZ) 作用于 NIT-L1 胰岛细胞， 可引起细胞损伤。 0068 取生长良好的对数期 NIT 细胞接种于 96 孔板中， 在 37含 5 CO2的培养箱中培 养 24h 后， 按实验分为 5 组， 空白组、 STZ。
27、 模型组 (8mmol/L)， 麦冬提取物 ( 见实施例 1、 4、 6) 高、 中和低剂量组。加药后继续培养 24h 后， 每培养孔分别加入 20l 5mg/ml 的 MTT 溶液， 4h 后弃去培养基， 每孔各加入 DMSO150ul， 492nm 下测定各孔的吸光度， 计算细胞生长抑制 率。 0069 细胞生长抑制率 ( ) (A空白-A给药)/A空白100 0070 实验显示， 2mg/ml 的麦冬提取物， 能较显著地提高链脲佐菌素损伤后的 NIT-L1 胰 岛细胞活性。 0071 实施例 14 ： 0072 麦冬提取物口服制剂的制备 0073 普通片剂 ： 按实施例1制得的麦冬提取物。
28、200g， 可压性淀粉200g， 置于粉碎机中粉 碎， 细粉过 80 目筛。再加入硬脂酸镁 - 滑石粉 8g， 微粉硅胶 4g， 搅拌均匀后粉末直接压片， 即得 0074 咀嚼片 ： 按实施例 5 制得的麦冬提取物 200g， 甘露醇 100g， 微晶纤维素 100g， 置于 粉碎机中粉碎， 过 80 目筛。再加入 4g 硬脂酸镁、 4g 微粉硅胶、 4g 甜橙香精粉末和 40g 聚维 酮粉末， 搅拌均匀后粉末直接压片， 即得。 0075 颗粒剂 ： 先将辅料分别粉碎过 100 目筛， 按实施例 2 制得的麦冬提取物 200g， 羧甲 基淀粉钠 100g， 微粉硅胶 150g， 微粉纤维素 400g 混合均匀， 加淀粉 100g 制成软材， 过 20 目 说 明 书 CN 101559166 B6/6 页 8 筛， 烘干， 过 20 目筛整粒， 即得。 0076 口服液 ： 按实施例 7 制得的麦冬提取物 200g， 山梨酸钾 0.2g， 柠檬香精 0.5g， 加水 至 1L， 灭菌、 分装。 说 明 书 。