技术领域
本发明系有关于一种疫苗佐剂，且特别有关于一种含经酸水解β-葡聚糖 之疫苗油质佐剂。
背景技术
佐剂是指可增加对抗原体液及/或细胞免疫反应之任何物质。传统的疫苗 系利用被杀死的病原性微生物粗制备而成，而与病理学微生物培养相关的杂 质可作为佐剂以增强免疫反应。不过在使用病理学微生物或经纯化的蛋白质 单元均质作为抗原时，因为此抗原所引发的免疫性不良，因而需要添加额外 的外源物作为佐剂。此外，由于合成型与亚基(subunit)型疫苗生产起来都非 常昂贵，因此可藉由佐剂来减少抗原剂量，以节省疫苗的生产成本。
佐剂的作用机制极为复杂，目前尚未完全清楚，主要认为有(1)佐剂与水 溶液抗原混合后形成油包水(water-in-oil)或水包油(oil-in-water)的乳状颗粒， 以增加抗原与巨噬细胞的接触面积；(2)佐剂可延长抗原在体内的滞留时间； (3)佐剂可诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利用刺激免疫细 胞的增殖作用。
目前佐剂可分为铝胶及油质佐剂两种，而油质佐剂又可分为W/O乳液 型、O/W乳液型及W/O/W乳液型。W/O乳液型佐剂，例如，弗氏完全及不完 全佐剂，是一种常见的佐剂，其可延长抗原在组织内部的停留时间，并能持 续诱发发炎反应，但其粘稠度过高，容易产生肉芽肿或脓疡。O/W乳液型粘 稠度低，因此注射部位无严重的局部反应，且可引发短暂之免疫反应，安全 性高。然而，由于抗原处于连续水相中，因此注射后会在注射部位快速扩散， 存留时间较短，难以发挥长期免疫之效果。虽然，W/O/W乳液型兼具W/O乳 液型及O/W乳液型之优点，但其价格过高，且其所产生抗体滴度仍嫌不足。 因此，发展可提高保护效价、保护时效及安全性之疫苗佐剂为目前的重要课 题。
一般油质佐剂常需搭配价昂且具细胞毒性之免疫促进剂藉以提高佐剂 效力，如胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)，CpG及细菌核酸，细胞因子 (cytokine)，外毒素(exotoxin)、内毒素(endotoxin)等。β-葡聚糖是一种天然多 糖，广泛存在于植物之细胞壁中，取得容易。β-葡聚糖是一种高分子量之多 糖，一般从菌类或植物中萃取纯化之β-葡聚糖干燥研磨成粉状后难溶于冷 水，复水后易产生β-葡聚糖聚集体(aggregation)产生，造成β-葡聚糖使用上困 难也使免疫效果降低。本发明利用酸水解使β-葡聚糖分子降解而使分子量降 低，使β-葡聚糖易于溶解于佐剂之水相中可提高并增强其免疫效价。
发明内容
本发明提供一种疫苗佐剂，包括经酸水解的β-葡聚糖(β-glucans)，其分 散于水相溶液中，该水相溶液与乳化剂及油脂均质乳化以形成该疫苗佐剂， 其中该经酸水解的β-葡聚糖的重量平均分子量介于约10000至1000000之间， 且该经酸水解的β-葡聚糖浓度在0.1mg/ml以上。
本发明另提供一种疫苗组合物，包括至少一种水相溶液，其包含生物学 相容的有效抗原及经酸水解的β-葡聚糖；以及油脂，其中该水相溶液与该油 脂均质乳化后以形成该疫苗组合物，该经酸水解β-葡聚糖的重量平均分子量 介于约10000至1000000之间，且该经酸水解β-葡聚糖的浓度在0.1mg/ml以上。
为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特 举优选实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：
附图说明
图1显示大麦β-葡聚糖的分子量，由图1可知随着酸水解的时间增加，大 麦β-葡聚糖的分子量就愈小。
图2显示各种佐剂对小鼠免疫的影响，由图2可知，经酸水解之大麦β-葡 聚糖可增加小鼠的抗体滴度。
图3显示各种佐剂对小鼠免疫的影响，由图3可知，经酸水解之大麦β-葡 聚糖可增加小鼠的抗体滴度。
具体实施方式
本发明系提供一种疫苗佐剂，包括经酸水解的β-葡聚糖(β-glucans)，可 提升疫苗的保护效价及延长疫苗的保护时效。
本发明所述之“经酸水解的β-葡聚糖(β-glucans)”系指对β-葡聚糖进行酸 水解后所获得之分子量较小的β-葡聚糖，其重量平均分子量介于约10000至 1000000之间，优选为50000-300000之间。β-葡聚糖是一种天然的多糖，其广 泛的存在于植物或真菌的细胞壁中，取得容易。本发明所述之β-葡聚糖包括 β-1，3-葡聚糖、β-1，4-葡聚糖或β-1，6-葡聚糖。β-葡聚糖的来源包括，但不限于， 谷类(大麦、燕麦、小麦、黑麦、荞麦、玉米、稻米或小米等)、菇类(灵芝、 樟芝、云芝、冬虫夏草、桑黄、巴西磨菇、鸿喜菇、柳松菇、珊瑚菇或香菇 等)或酵母菌，优选为大麦β-葡聚糖。
在本发明中，首先将谷粒磨成粉末，将谷粒粉末以乙醇处理后，加入适 当浓度的淀粉酶、蛋白质分解酶等以去除大麦中的淀粉及蛋白质。接着利用 高浓度的乙醇使β-葡聚糖析出，并利用乙醇清洗析出的β-葡聚糖沉淀物。乙 醇的浓度可介于80％至95％(v/v)。清洗的步骤可重复2-3次。最后将β-葡聚糖 真空干燥。有关β-葡聚糖的纯化程序可参照许荣成(2004)“不同分子量大麦β- 葡聚糖对米淀粉物化性质之影响”，硕士论文，国立台湾大学等文献。
将β-葡聚糖于溶于水中，加入酸性溶液反应数十至数百分钟，例如，20 至150分钟。接着以高浓度的乙醇将β-葡聚糖沉淀析出并清洗析出的β-葡聚糖 沉淀物。乙醇的浓度可介于80％至95％(v/v)。清洗的步骤可重复2-3次。最后 将经酸水解β-葡聚糖真空干燥。有关β-葡聚糖的酸水解程序可参照Doubleier， J.L and Wood Wood，P.J.(1995)Cereal Chem.72：355-340等文献。熟悉此技艺 人士可依照β-葡聚糖的来源及含量适当改变其纯化及水解的步骤及条件。
将经酸水解的β-葡聚糖分散于水相中。水相溶液可为氨基酸、盐类、糖 类或糖醇类等一般食品或医药品级成份。例如，氨基酸或其盐类可为甘氨酸 盐、丙氨酸盐、精氨酸盐、组氨酸盐、苯丙氨酸盐、天冬氨酸钠盐、天冬氨 酸钾盐、麸酸钠盐、麸酸钾盐、或其水合物。糖类及糖醇类可选自海藻糖、 木糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇等。其它成分包括缓冲溶液之各式磷 酸盐类。此外，水相溶液(或含抗体)可为溶液或悬浮液。
将上述之水相溶液与乳化剂及油脂乳化均质后形成油质佐剂。油脂可为 轻质液体石蜡(矿物油)、食用油、鳗鱼肝油、鲨烯、鲨烷、单酸甘油酯、双 酸甘油酯、三酸甘油酯等。油相乳化剂可为Alarcel P-135、Alarcel 83、Alarcel A、Span 80、Span 83、Span 85，且其HLB值优选低于10。水相乳化剂可为 Tween 20、Tween 80、Tween 85等，且其HLB值优选大于10。本发明之佐剂 可为各种的乳化型态，例如，油包水(water in oil，W/O)型、水包油(oil in water， O/W)型或双重乳化(double emulsion，W/O/W)型等，并无特别限制。乳化的步 骤可参考Carstensen JT.Disperse systems.In：In：Theory of pharmaceutical systems II.Heterogeneous systems.New York:Academic Press；1973.文献。熟悉 此技艺人士可依照分散剂种类及乳化型改变其乳化的步骤及条件。
在另一实施例中，本发明之油脂中还包括非离子嵌段共聚物，例如，环 氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EO-PO copolymer)、环氧乙烷-苯乙烯共聚物、环氧 丙烷-苯乙烯共聚物、苯乙烯-丙烯腈共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物。非离子 嵌段共聚物可进一步促进免疫反应以增加保护效价。
本发明之疫苗佐剂可促进动物的免疫反应，以提升疫苗的保护效价及延 长保护时效，且不会对动物产生不良的影响。
本发明另提供一种疫苗组合物，包括至少一种水相溶液，其包含生物学 相容的有效抗原及经酸水解的β-葡聚糖，以及油脂，其中该水相溶液与该油 脂均质乳化后以形成该疫苗组合物，该经酸水解β-葡聚糖的重量平均分子量 介于约10000至1000000之间，优选为50000-300000之间，且该经酸水解β-葡 聚糖的浓度在0.1mg/ml以上，优选为0.3mg/ml至3mg/ml之间。
本发明之疫苗组合物为一种动物疫苗，优选为非人类之动物疫苗，例如， 家畜或家禽疫苗。家畜或家禽系为由人类饲养驯化，且可以人为控制其繁殖 的动物，用于食用、劳役、毛皮、宠物、实验等，其包括，但不限于，猪、 羊、牛、鹿、狗、大鼠、小鼠、兔、马、驴、骡、鸡、火鸡、鸭、鹅、火鸡、 鸽或鸵鸟等。
本发明之抗原可为减毒抗原、杀死抗原或重组抗原，且抗原可来自于各 种家畜或家禽之病原体，例如，猪瘟病毒(Hog cholera virus)、猪疱疹病毒 (Herpesvirus suis)、牛瘟病毒(Rinderpest virus)、马雷克氏病病毒(Marek’s disease virus)、副粘液病毒(paramyxovirus)、腺病毒(adenoviruses)、传染性粘 液囊病病毒(infectious bursal disease virus)、猫细小病毒(Feline Parvovirus)、 犬细小病毒(Canine Parvovirus)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus)、狂犬病 病毒(Lyssaviruses)、牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus)、口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus)、猪细小病毒(Porcine parvovirus)或假性狂犬病 病毒(Pseudorabies virus)等。
本发明之疫苗组合物可以肌肉注射、皮下注射或腹腔注射的方式进行动 物免疫。
本发明之疫苗组合物具有良好的保护效价及保护时效，且本发明疫苗组 合物之保护效价是一般市售疫苗的0.5至1.5倍以上。
实施例
1.β-葡聚糖的纯化
首先，将大麦谷粒磨成能通过1mm孔径筛网的大麦粉，取400g的大麦粉 置于80％(v/v)乙醇中回流30分钟，以8000g离心10分钟获得处理后之大麦粉， 将此处理后之大麦粉平铺于铁盘中，于40℃下干燥过夜。取500g处理后之大 麦粉与2000ml去离子水在于40℃下反应30分钟后，以8000g离心20分钟获得 上清液。取0.5mlα-淀粉酶(120，Cat.No.A3403，Sigma)加入上述上 清液中，于95℃下反应30分钟。反应后，将水浴冷却至50℃，并加入1ml蛋 白质分解酶(FlavourzymeTM 500L，Cat.No.P6110，Sigma)在50℃下反应60分 钟，再以沸水浴30分钟去活化酶活性。在以3000g离心10分钟后，于激烈搅 拌下缓慢加入等体积的95％(v/v)乙醇，在4℃下静置180分钟以获得β-葡聚糖 沉淀。将β-葡聚糖沉淀与2000ml的去离子水于均质机(17,000rpm，PT-3000， Polytron，Switzerland)下均质1-2分钟，使沉淀物均匀分散，接着于70℃下持 续搅拌30分钟使之完全溶解。将温度浴冷却至30℃，于激烈搅拌下缓慢加入 等体积95％(v/v)的乙醇后，于4℃下静置180分钟，以3000g离心10分钟获得 沉淀物。再将此沉淀物与800ml95％(v/v)的乙醇于均质机下均质1-2分钟使沉 淀物均匀分散，再经过滤(400目)及真空干燥后即可获得大麦β-葡聚糖。
2.酸水解β-葡聚糖
取30g的大麦β-葡聚糖于70℃溶于1500ml的去离子水中，加入70℃等体 积的0.4M HCl，于70℃下分别反应30、60、120分钟。将温度很快地降至30 ℃左右，并以1M NaOH调整其pH值至6.5-7.0。激烈搅拌下缓慢加入等体积 95％(v/v)的乙醇，于4℃下静置180分钟以获得β-葡聚糖沉淀，并以3000g离 心10分钟收集此沉淀物。接着，加入47.5％(v/v)的乙醇至沉淀物中，并以均 质机清洗后，再离心收集沉淀物。最后，加入1200ml 95％(v/v)的乙醇至沉 淀物中，于均质机下均质1-2分钟，使沉淀物均匀分散，经过滤(400目)及真 空干燥后即可获得经酸水解之大麦β-葡聚糖。酸水解的相关步骤可参考 Doubleier，J.L.and Wood Wood，P.J.(1995)Cereal Chem.72：355-340文献。
参照图1所示，随着酸水解的时间增加，大麦β-葡聚糖的滞留时间也就 愈长，表示大麦β-葡聚糖的分子量就愈小。大麦β-葡聚糖的分子量、纯度及 回收率如表一所示。
表一：大麦β-葡聚糖的分子量、纯度及回收率
未酸水解酸水解60分钟酸水解120分钟分子量280±25KD130±15KD70±33KD纯度78.4±3.4％87.5±5.6％79.5±6.2％回收率0.46％0.35％0.21％
3.W1/O/W2乳液之制备
W1/O的制作：取30％至60％之磷酸盐缓冲溶液，利用HLB值低于10之乳 化剂例如Span 80(HLB：4.3，浓度2％至10％之间)分散于70％至40％之间矿物 油中并加热至50℃。以高转速均质机(Polytron PT-MR 3000，Kinematica AG， Littau，Switzerland，6000rpm)先均质5分钟，再以微射流高压均质机(Haskel hochdruck System GmbH Model No：NJ1600P10L，10,000psi)制成W1/O型乳 剂，进行1、3、5次循环均质并取样作分析。
W1/O/W2的制作：利用Tween 80(HLB：12.1，浓度0.1％至10％之间)以 真空高转速均质机(IKA T25，Germany)二级乳化(20,000rpm；5分钟)上述之 W1/O型乳剂以形成W1/O/W2型复合乳剂。以上乳化过程均在室温下进行， 必要时使用冷水降温，各组成成分均依标准灭菌方法灭菌。
4.小鼠免疫(1)
取48只Balb/c鼠，分为8组，每组6只。各组的实验条件如表二所示。将 表二所示之各W/O/W乳化物以皮下注射的方式每二周免疫小鼠一次，共免疫 二次，每次剂量为0.3ml。在每次免疫后二周以酶联免疫分析法(ELISA)检测 小鼠血清的抗体滴度。参照图2，Ctl1及Ctl2组皆无法促进小鼠产生抗体，而 β-葡聚糖组(Lb、Hb、Lb60、Hb60)可明显提升抗体滴度，且经水解之β-葡聚 糖提升抗体滴度的能力大于未水解β的-葡聚糖。此外，与市售的206佐剂 (Seppic，France)、MVP Emulsigen佐剂(MVP，USA)相比，本发明之β-葡聚糖 更能促进抗体的产生。
表二：实施例4之实验条件
5.小鼠免疫(2)
本实施例之流程与实施例4相同，仅改变各组的实验条件，如表三所示。 参照图3，Ctl1组无法促进小鼠产生抗体。而大麦β-葡聚糖组(Lb60、Hb60) 及酵母β-葡聚糖皆可明显提升抗体滴度。
表三：实施例5之实验条件
6.猪只免疫
将8只无特定病原体的猪(SPF，specific pathogen free)分为3组，分别为负 对照组、正对照组及β-葡聚糖组。负对照组为不进行免疫，正对照组为以猪 瘟不活化疫病毒抗原混合市售MVP Emulsigen佐剂进行免疫，β-葡聚糖O/W 佐剂组为以猪瘟不活化疫病毒抗原混合本发明之(3mg/ml)酸水解β-葡聚糖 O/W佐剂进行免疫。各猪只以皮下注射的方式每二周免疫猪只一次，共免疫 三次，每次剂量为2ml。在每次免疫后二周以酶联免疫分析法(ELISA)检测猪 只血清的抗体滴度。请参照表四，本发明之β-葡聚糖组所产生的抗体已具有 保护猪只的能力，且其抗体滴度大于其它两组。
表四：各组猪只的抗体滴度
猪只编号组别P0P1P2P31负对照组<4<4<4<42负对照组<4<4<4<43正对照组<4<48324正对照组<4<4685正对照组<4<4233626β-葡聚糖组<4<4451287β-葡聚糖组<4<4112568β-葡聚糖组<4<423>724
P0：免疫前；P1：第一次免疫；P2：第二次免疫；P3：第三次免疫
7.鸡只免疫
将36只无特定病原体的来亨鸡分为3组，分别为负对照组、正对照组及β- 葡聚糖O/W型佐剂组。各组的实验条件及结果如表五所示。在对鸡只免疫后 2-3周，采血侦测鸡只血清中新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus，NDV)的 红血球凝集抑制抗体滴度(HI titer)。由表五可知，市售佐剂及本发明之β-葡 聚糖佐剂皆可促进鸡只的抗体滴度，且本发明之β-葡聚糖佐剂的抗体滴度高 于市售佐剂。
表五：各组鸡只的免疫条件及抗体滴度
负对照组正对照组β-葡聚糖组数量101616免疫内容磷酸缓冲液市售W/O弗式佐剂 +NDV抗原1 β-葡聚糖佐剂 +NDV抗原2 免疫前 抗体滴度22-2322-2322-23免疫后19天22(6只)、23(4只)29(8只)、28(4只)、210(2只)、29(6只)、
之抗体滴度27(2只)28(2只)、26(4只)、 25(2只)、
1：W/O弗式佐剂+新城鸡瘟病毒抗原，剂量：0.8ml
2：本发明之β-葡聚糖O/W佐剂+新城鸡瘟病毒抗原，比例为1:1，剂量：2ml
虽然本发明已以优选实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何 熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰， 因此本发明之保护范围当视所附之权利要求所界定者为准。