技术领域：
本发明涉及药物制剂领域，具体地说，本发明涉及含有硝酸异山梨 酯和比索洛尔作为活性成分的透皮贴剂，该透皮贴剂可用于治疗心血管 疾病。
背景技术：
心血管疾病主要包括心脏麻痹、心绞痛(心肌梗塞)、心律不齐、出 血性心脏衰竭、高血压、中风、先天性心脏缺损及风湿性心脏病等等， 而其中又以心脏麻痹、中风与高血压等三种病变最为普遍。罹患心血管 疾病可能的危险因素，经常不是单独存在，往往是数个因素共同发生作 用。
硝酸异山梨酯又名消心痛，主要用于防治心绞痛，但近年来它亦成 为治疗心力衰竭的主要药物。其作用于血管平滑肌的特异受体，释放无 机硝酸盐使平滑肌松弛。小剂量消心痛扩张静脉，大剂量可扩张动脉和 静脉。静脉系统扩张，则前负荷减轻、左室容量减少，从而使心肌收缩 力增强。同时，心腔内舒张压的减轻使心内膜下冠状动脉的阻抗也下降， 从而改善心肌本身供血，促使心肌收缩力增强，心衰得到纠正。它作用 迅速，疗效可靠，较其他血管扩张药如酚妥拉明、硝普钠等需注射给药 来得方便。因此，硝酸异山梨酯是一种治疗心力衰竭的主要药物。
然而消心痛在连续用药过程中，可产生耐受性，其疗效减弱或消失， 在高炜等主译的《心脏药物》(第四版，辽宁教育出版社，1999.9，第 48页)中就提到过，如果长时间规律使用长效硝酸酯类药物，无药物间 歇期或高峰期，这类药物很容易发生耐药性，作用效果难以持久。每日 4次，每次30mg长期服用硝酸异山梨酯治疗心绞痛的效果，因其产生 的耐药性而迅速减弱。此文献以及下文中提到的所有出版物或文献均以 引用的方式被并入本文中。
比索洛尔是一个对心脏β1受体具有高度亲和力和选择性的β1受体 阻滞剂。相对于没有选择性的β受体阻断药，比索洛尔可避免由于β2受体阻断而产生的肺功能、血脂、外周循环等方面的不良反应。
但是，口服比索洛尔会产生某些不良反应。刘国树等[“比索洛尔治 疗228例原发性高血压患者的临床观察”，心肺血管病杂志，1999年第3 期第18卷，第179-182页]报道了口服比索洛尔具有良好的降压作用， 但对心率影响较大，治疗前后平均心率下降幅度达15.1％，并且随着用 药剂量增加心率下降幅度也增大。个别病人出现窦性心动过缓、完全性 右束支传导阻滞、房性早搏、恶心乏力、短P-R综合症等β-受体阻滞剂 常见的副作用。这说明比索洛尔口服给药对心率偏慢的病人应慎重。
人们也尝试将比索洛尔与长效硝酸酯类药物联合应用来治疗心绞 痛。
Mireille C.M.Portegies等人比较了硝酸异山梨酯和比索洛尔单独和 联合口服用药对运动型心绞痛和心肌缺血治疗的结果[Mireille C. M.Portegies，Jan Brouwer，Louis L.M.V.D.Ven，Jan W.Viersma，and Kong I.Lie，“Effect of Bisoprolol and Isosorbide Dinitrate on the Circadian Distribution of Myocardial Ischemia”，Current therapeutic Research，1995， (56)，1225-1236]：在每天给药比索洛尔1次10mg，硝酸异山梨酯3次 20mg的剂量下，持续给药4周。结果表明联合用药的效果只是二药分 别作用的加和，对其所研究的症状未见明显协同作用。
O.DE Divitiis等[O.DE Divitiis，V.Liguori，S.Di Somma，et al.， “Bisoprolol in the treatment of angina pectoris：a double blind comparison with verapamil”，European Heart Journal，1987，8(suppl.M)，43-54]比较了 采用比索洛尔和硝酸异山梨酯联合用药(1∶4→1∶2)与异博定和硝酸 异山梨酯联合用药(6∶1→9∶1)治疗心绞痛的药效，发现比索洛尔在抗 心肌缺血方面与异博定一样有效，并具有良好的耐受性。
透皮贴剂是一种经皮给药的药物制剂类型，梁秉文在《经皮给药制 剂》(中国医药科技出版社，1992.9出版，第13-14页)一书中指出，经 皮给药系统与常规给药方法比较，有其自己的特点：如(1)一次用药 可以在长时间内使药物以恒定速率进入体内，类似于长时间静脉滴注； (2)避免了肝脏的首过效应和肠胃道因素的干扰与降解作用，这些因 素也是口服给药产生效应个体差异的主要原因，经皮给药系统能减少用 药的个体差异；(3)可以使药物以体内被消除的速率进入体内，维持恒 定有效的血药浓度，避免其它给药方法产生的血药浓度峰谷现象，降低 药物的不良反应；(4)使用方便，容易被病人接受，更适合于不宜口服 药物的病人以及长期用药的病人。
硝酸异山梨酯或比索洛尔单方透皮贴剂均有文献报导[日高修文等， 含硝酸异山梨酯的贴剂，中华人民共和国专利，专利号ZL 98 8 00181.0； TATEISHI TETSURO，et al.，Adhesive Patch，WO2005011662；SAEKI YUJI，et al.，BISOPROLOL-CONTAINING PLASTER，JP2003313122]。
但迄今为止，现有技术未公开任何涉及含有硝酸异山梨酯和比索洛 尔的透皮药物制剂。
本发明人发现，在含有特定比例的硝酸异山梨酯和比索洛尔的透皮 贴剂中，硝酸异山梨酯和比索洛尔产生了出乎意料的协同作用，与硝酸 异山梨酯和比索洛尔各自的单方透皮贴剂相比较，在该比例下的硝酸异 山梨酯与比索洛尔的组合对多种心脏不良事件具有优异的预防与治疗 作用，同时降压效果优于单方透皮贴剂，并对单方透皮贴剂所造成的心 率失调有所改善。因此在用于治疗心血管疾病时具有优势。
发明内容
本发明的目的就在于提供用于治疗心血管疾病的含有特定比例的 硝酸异山梨酯和比索洛尔的透皮贴剂。在该比例下，硝酸异山梨酯和比 索洛尔具有协同作用。
因此，本发明涉及一种透皮贴剂，为复合层形式，其结构包含有背 衬支持层、含有药物活性成分和药用辅料的药物储库层和覆盖于药物储 库层之上的保护层，其特征在于所述药物储库层包含，以重量计，比例 为1∶3～3∶1、优选1.2～1.8∶1、特别优选1.4～1.6∶1的硝酸异山梨酯 和比索洛尔作为活性成分。
在本发明的透皮贴剂中，背衬支持层由本领域技术人员熟知的背衬 材料铝箔、聚对苯二甲酸二乙酯、聚乙烯或无纺布构成。
在本发明的透皮贴剂中，所述药用辅料包括经皮渗透促进剂和聚合 物基质。其中所述聚合物基质选自例如丙烯酸类压敏胶或丙烯酸类压敏 胶与Eudragit类丙烯酸树脂的组合。
在本申请中，术语“丙烯酸类压敏胶”是指本技术领域公知的一类 采用丙烯酸及其衍生物共聚合生成的高分子物质，具有饱和碳氢主链和 酯基侧链，通过改变共聚单体和侧链基团可以获得具有粘性的丙烯酸类 压敏胶。常用的单体有丙烯酸、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、醋 酸乙烯酯、2-羟乙基丙烯酸等化合物。该聚合反应可以在溶液中进行。 (梁秉文，《经皮给药制剂》，中国医药科技出版社，1992.9出版，230 -232页；杨玉崑，《压敏胶粘剂》，第五章丙烯酸酯压敏胶粘剂，科 学出版社，1991年5月出版，148-210页；王树明，CN1640500A)。
所述“Eudragit类丙烯酸树脂”的非限制性的实例有德国公 司生产的L100、S100、RL 100、RS100、E100、L100-55、E PO、RL PO、RS PO等。
在本发明透皮贴剂的优选实施方案中，所述聚合物基质为丙烯酸类 压敏胶与Eudragit类丙烯酸树脂的混合物。
在本申请中，术语“渗透促进剂”是指本技术领域公知的一类能够 克服皮肤屏障作用，增加药物透皮速度或增加药物透皮量的物质，包括 表面活性剂类，有机溶剂类例如醇类例如丙二醇(PG)、酯类、二甲基 亚砜及其类似物等，氮酮类，有机酸及其酯或酰胺类，等(梁秉文，《经 皮给药制剂》，第五章经皮渗透促进剂及其应用，中国医药科技出版 社，1992.9出版，116-164页)。所述渗透促进剂的非限制性的实例有 例如肉豆蔻酸异丙酯、月桂氮酮、丙二醇等及其混合物等。
在本发明透皮贴剂的一个实施方案中，所述药物储库层由下列物质 组成：
硝酸异山梨醇酯： 1～17％
比索洛尔： 1～17％
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 0.1～30％
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 30～80％
丙二醇： 0～25％
肉豆蔻酸异丙酯： 4.5～22％
氮酮： 1.5～7％
各成分含量为基于药物储库层的总重量计，其总和为100％。
在本发明透皮贴剂的一个优选实施方案中，所述药物储库层由下列 物质组成：
硝酸异山梨醇酯： 2.5～15％
比索洛尔： 2～8％
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 0.5～25％
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 45～65％
肉豆蔻酸异丙酯： 6～10％
氮酮： 4～6％
各成分含量为基于药物储库层的总重量计，其总和为100％。
在本发明透皮贴剂的一个特别优选的实施方案中，所述药物储库层 由下列物质组成：
硝酸异山梨醇酯： 3.6～10％
比索洛尔： 2.6～6％
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 3～25％
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 45～65％
肉豆蔻酸异丙酯： 6～10％
氮酮： 4～6％
各成分含量为基于药物储库层的总重量计，其总和为100％。
在本发明透皮贴剂的另一个实施方案中，所述药物储库层由下列物 质组成：
硝酸异山梨酯： 0.5～2重量份
比索洛尔： 0.4～1.1重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS 100： 0.1～3.5重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 5～10重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 0.5～2重量份
氮酮： 0.2～0.6重量份。
在本发明透皮贴剂的另一个实施方案中，所述药物储库层由下列物 质组成：
硝酸异山梨酯： 0.5～1.3重量份
比索洛尔： 0.35～0.8重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 0.5～3.5重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 6～8重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 1～1.5重量份
氮酮： 0.2～0.6重量份。
在本发明透皮贴剂的另一个实施方案中，所述药物储库层由下列物 质组成：
硝酸异山梨酯： 0.5～0.7重量份
比索洛尔： 0.4重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 0.25-3.5重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 6～8重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 1～1.5重量份
氮酮： 0.2-0.6重量份。
在本发明透皮贴剂的另一个实施方案中，所述药物储库层由下列物 质组成：
硝酸异山梨酯： 0.6重量份
比索洛尔： 0.4重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 3重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 6～8重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 1～1.5重量份
氮酮： 0.4重量份。
在本发明透皮贴剂的另一个优选实施方案中，所述药物储库层由下 列物质组成：
硝酸异山梨酯： 1.0～1.5重量份
比索洛尔： 0.8重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 0.25-3.5重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 6～8重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 1～1.5重量份
氮酮： 0.2-0.6重量份。
在本发明透皮贴剂的另一个实施方案中，所述药物储库层由下列物 质组成：
硝酸异山梨酯： 1.2重量份
比索洛尔： 0.8重量份
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 3重量份
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 6～8重量份
肉豆蔻酸异丙酯： 1～1.5重量份
氮酮： 0.4重量份。
本发明透皮贴剂可以采用本领域已知的技术制备，例如可用诸如梁 秉文在《经皮给药制剂》(中国医药科技出版社，1992.9出版，328～ 337页)所述的生产工艺制备。例如通过将硝酸异山梨酯和比索洛尔用 有机溶剂溶解，与渗透促进剂的溶液混合，然后将所得混合物与聚合物 基质溶液混合，将其用滚轮式、刮刀式等涂布机或手工涂布至背衬材料 上，烘干。各层压合，冲切，包装。
本发明透皮贴剂的结构可以为膜-贮库型、骨架控释型、胶粘剂控释 型形式，其中药物储库层可以是单层，也可以是多层复合的形式，具体结 构例如有背衬层、药物储库层、控释膜层、压敏胶层(含少量活性药物 或不含药)、覆盖层(附图1)；背衬层、药物储库层、覆盖层(附图 2)；背衬层、药物储库层、控释压敏胶层(含少量活性药物或不含药)、 覆盖层(附图3)。
本发明透皮贴剂的动物实验证明，它可降低对动物冠脉结扎引起的 心电图T波升高、血清心肌酶升高以及心肌梗塞范围扩大，表明本发明 的透皮贴剂对多种心脏不良事件具有良好预防与治疗作用；另外动物实 验还证明其降血压效果不仅要好于仅施用单方贴剂的效果，同时对单方 贴剂所造成的心率失调有所改善或没有增强。表明本发明的透皮贴剂中 的药物硝酸异山梨酯与比索洛尔在治疗心血管疾病方面具有相当的协 同作用，该比例下的硝酸异山梨酯和比索洛尔药物组合在用于治疗心血 管疾病方面有一定的优势。
本发明的透皮贴剂适用于经皮外敷用治疗或预防哺乳动物高血压、 冠心病、动脉粥状硬化、心肌缺血或心绞痛等心血管系统疾病，其日剂 量，按硝酸异山梨酯和比索洛尔的总量计，通常为0.05～20mg/kg体重， 优选0.5～10mg/kg体重，特别优选1～5mg/kg体重。
附图说明：
附图1为膜-贮库型经皮给药贴剂示意图。
附图2为骨架控释型经皮给药贴剂示意图。
附图3为胶粘剂控释型经皮给药贴剂示意图。
实施例：
下面通过实施例对本发明进行举例说明，但这些实施例对本发明范 围并不构成任何限制。显而易见的是，本技术领域的技术人员可根据本 发明的精神对本发明实施方案中涉及的技术特征作出许多改进、改变和 替换。所有这些改进、改变和替换应包括在本发明的精神和范围内。
实施例1～7和比较实施例1和2
实施例1-7：硝酸异山梨酯和比索洛尔复方透皮贴片。
比较实施例1：仅含硝酸异山梨酯的单方透皮贴片。
比较实施例2：仅含比索洛尔的单方透皮贴片。
上述透皮贴片每单位面积含硝酸异山梨酯和比索洛尔总共1mg/cm2(低剂量贴片)或2mg/cm2(高剂量贴片)，按制备1000cm2的量投料。
(1)处方：
具体药物剂量组合如表1所示：
表1：比索洛尔和硝酸异山梨酯剂量组合的实施例编号
实施例 硝酸异山梨酯/比索洛尔 硝酸异山梨酯/比索洛尔 (g/g) 实施例1 1∶3 0.25/0.75(或0.5/1.5) 实施例2 1∶2 0.33/0.67(或0.66/1.34) 实施例3 2∶3 0.4/0.6(或0.8/1.2) 实施例4 3∶2 0.6/0.4(或1.2/0.8) 实施例5 1∶1 0.5/0.5(或1.0/1.0) 实施例6 2∶1 0.67/0.33(或1.34/0.66) 实施例7 3∶1 0.75/0.25(或1.5/0.5) 比较实施例1 1∶0 1/0g(或2/0) 比较实施例2 0∶1 0/1g(或0/2) 空白对照 0∶0 0/0g
药物储库层中其它药用辅料按制备1000cm2的量投料，处方如下：
丙烯酸树脂Eudragit RS100： 3g
丙烯酸树脂压敏胶(干胶基)： 8g
氮酮： 0.4g
肉豆蔻异丙酯： 1.5g
乙酸乙酯： 适量
制成： 1000cm2
(2)贴剂制备：
(i)药物储库胶浆配制
称取处方量的硝酸异山梨酯(山东博山制药厂生产，批号：010124) 和比索洛尔(由富马酸比索洛尔(北京联苯化学技术有限公司生产，批 号050401)水溶液用碳酸钠(北京世纪红星化工有限责任公司生产，分 析纯，批号：011213)水溶液中和碱化去除富马酸根，用乙酸乙酯(北 京化工厂生产，分析纯，批号：20020531)萃取后，将有机相减压蒸馏 (170-175℃/0.005-0.01Kpa)而得)，加入适量的乙酸乙酯，搅拌至药 物溶解，得一澄清溶液，然后加入处方量的氮酮(北京第二制药厂生产， 燕晶牌，批号041201)和肉豆蔻异丙酯(浙江省海盐县精细化工有限公 司生产，批号25484958-1)，搅拌5min，得澄清料液A。
称取处方量的丙烯酸树脂RS 100(德国GmbH公司 生产，批号8310808118)加入适量的乙酸乙酯中，搅拌至完全溶解，然 后加入处方量的丙烯酸压敏胶(由丙烯酸2-乙基己酯(上海富蔗化工 有限公司生产，工业级)、丙烯酸丁酯(北京市兴津化工厂生产，分析 纯，批号：20011110)、乙酸乙烯酯(北京化学试剂公司，化学纯，批 号：050422)单体，按照《压敏胶粘剂》(科学出版社1991.5，杨玉崑 编著，187页)中所述方法以乙酸乙酯作为溶剂制备而成，固含量为40 ％)，混合搅拌5min，得澄清料液B。
搅拌下，将料液A加入料液B中，加入适量的乙酸乙酯调整混合液 体积至60mL，搅拌均匀，得澄清料液C，静置以除去气泡。
(ii)涂布
待料液C中气泡消失后，将料液C以手工方式涂布于聚对苯二甲酸 二乙酯背衬材料(江阴宝柏包装有限公司生产)上，涂布速度约10m/min， 涂布厚度0.60毫米。
(iii)干燥
将涂好的贴片移入烘箱中经40℃(0.5小时)→60℃(1.5小时)程 序升温，烘去溶剂，降温冷却后得透明粘性贴片。
(iv)复合
将烘制完毕的贴片与防粘纸复合。
(v)冲切、包装
将复合完的透皮贴剂冲切成相应面积的方形贴剂，用纸铝塑袋塑封 保存。
动物药效研究实例：
下面用空白对照贴片以及实施例1～7和比较实施例1和2的透皮 贴片进行动物实验。
选择肾血管狭窄(二肾一夹)型高血压大鼠(RHR)及自发性高血压大 鼠(SHR)两种动物模型，并分别在两种动物模型使用清醒急性降压及在 自发性高血压大鼠上的治疗性降压两种实验方法，观察实施例1～7和 比较实施例1和2的透皮贴片对两种高血压动物的急性降压及对SHR 的治疗性降压作用。
采用对SD大鼠动物冠脉结扎，观察本发明透皮贴片对其心电图T 波升高、血清心肌酶升高以及心肌梗塞范围扩大的影响。
实验一：对肾性高血压大鼠的急性降压作用研究
1.实验目的
观察实施例1～7和比较实施例1和2透皮贴片对肾性高血压大鼠 (RHR)的急性降压作用。
2.动物及分组
2.1.实验动物
SD大鼠：复旦大学实验动物科学部提供。许可证： SCXK(沪)2002-002。体重：180～220g。性别：雄。
2.2.动物分组
按血压高低平均分配原则将RHR随机分为10组，每组动物数：7～ 10只。分别为空白贴片对照组，实施例1～7和比较实施例1和2透皮 贴片组。
3.实验主要步骤
3.1.实验仪器
BESN-II多通道动物无创测压系统，南京德赛生物技术公司制造。
3.2二肾一夹型肾性高血压大鼠(RHR)模型的制备
取健康雄性SD大鼠，体重180～220g，在乙醚麻醉下，背位固定 于一泡沫塑料板上暴露腹部，手术器械及纱布棉花等经煮沸或105℃烘 箱消毒。于动物左侧腹部肾脏位置纵向剪去长2.5～3.5cm宽1.5～2cm 皮肤部位毛，用碘酒及75％酒精消毒皮肤，纵向切开长2～2.5cm切口， 用止血钳钝性分离肌肉暴露肾脏。用沙氏镊夹住肾脏拉出体外，然后小 心用玻璃分针找出肾动脉并分离之，在肾动脉上套一内径0.20mm、厚 0.5mm的不锈钢U型夹，将肾脏放回体内，这样就完成了狭窄肾动脉的 过程。分别仔细缝合肌肉和皮肤，伤口用碘酒棉球消毒并用消毒纱布包 扎。术后腹腔注射青霉素钠(0.48g(80万单位)，山东鲁抗医药股份有限 公司生产，国药准字H37020079，产品批号：B030605)2万单位/只鼠， 以防止感染。
手术后动物喂以1％盐水，连续2周，再喂0.5％盐水缓冲1周后停 止喂饲盐水，约3～5天后即可测量血压。首先连续测压三次，凡是收 缩压(SAP)高于160mmHg(21.3kPa)即认为已形成肾性高血压，否则淘 汰动物。制作该肾性高血压大鼠模型成功率在80％以上，形成肾性高血 压后血压稳定，通常可使SAP达160～200mmHg(21.3～26.7kPa)左右。
3.3.清醒大鼠血压测量方法
无创血压测量使用“BESN-II多通道动物无创测压系统”。测量结 果获得收缩压(SAP)、舒张压(DAP)及心率(HR)数据。
急性降压实验时，首先测压7天以上(至少测压三次)，使动物适应 测压环境，然后进行急性降压作用实验。给药前测压一次，记录血压及 心率。给药后第4～6，9～11，14～16，19～21，27～29，34～36，44～46，50～ 52，59～61小时分别测压，获得给药前后血压、心率的变化情况。
4.剂量设置
实施例1～7和比较实施例1和2透皮贴片给药剂量为：10.0mg/kg 体重。
空白对照：选用空白贴片，贴剂使用面积：10.0cm2/kg体重。
5.给药方法
给药前一日以10％硫化钠脱去大鼠背部毛，面积约5×5cm2。给药 时先于大鼠裸露皮肤表面贴上受试贴剂，然后再用医用胶布将其固定。
6.实验结果
观察实施例1～7和比较实施例1和2的透皮贴剂对肾性高血压大 鼠的降压作用。由于施药后15～28小时药效最稳定和最大，因此选择 15～28小时的实验结果，实验结果以均值±标准差(X±SD)表示，统计 学处理采用组间student-T检验。如表2～4所示：
表2：肾性高血压大鼠施药后收缩压变化值
*：P＜0.05；**：P＜0.01；，与空白对照比较
$：P＜0.05；$$：P＜0.01；，与比较实施例2比较
#：P＜0.05；##：P＜0.01；，与比较实施例1比较
表3：肾性高血压大鼠施药后舒张压变化值
*：P＜0.05；**：P＜0.01；，与空白对照比较
$：P＜0.05；$$：P＜0.01；，与比较实施例2比较
#：P＜0.05；##：P＜0.01；，与比较实施例1比较
表4：肾性高血压大鼠施药后心率变化值
*：P＜0.05；**：P＜0.01；，与空白对照比较
$：P＜0.05；$$：P＜0.01；，与比较实施例2比较
#：P＜0.05；##：P＜001；，与比较实施例1比较
由以上实验结果可见，硝酸异山梨酯与比索洛尔以一定比例组成复 方的本发明透皮贴剂可明显增强硝酸异山梨酯和比索洛尔各自的降压 作用，同时能够增加心率抑制作用。
实验二：对自发性高血压大鼠(SHR)的急性降压作用研究
1.受试药物
11.实施例4透皮贴片，规格：1.0mg/cm2，2.0mg/cm2。
1.2.比较实施例2透皮贴片，规格：1.0mg/cm2。
1.3.其它药物
富马酸比索洛尔片(博苏)：北京四环医药科技股份有限公司，批号： 0501133，规格：5mg/片。
羟甲基纤维素钠(CMC)：中国医药(集团)上海化学试剂公司，批 号：F20020928，规格：500g/包。
硫化钠：上海凌峰化学试剂有限公司，批号：041115，规格：500g/ 瓶。
2.动物及分组
2.1实验动物
自发性高血压大鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司提供， SPF/VAF级。许可证：SCK(京)2002-0003。体重：180～220g。性别：雄。
2.2动物分组
按血压高低平均分配原则将自发性高血压大鼠随机分为5组，每组 动物数：9～10只。分别为空白贴剂对照组，实施例4贴片高、中、低剂 量组，阳性对照博苏组。
3.实验主要步骤
3.1实验仪器
BESN-II多通道动物无创测压系统，南京德赛生物技术公司制造。
3.2清醒大鼠血压测量方法
无创血压测量使用“BESN-II多通道动物无创测压系统”。测量结 果获得收缩压(SAP)、舒张压(DAP)及心率(HR)数据。
急性降压实验时，首先测压7天以上(至少测压三次)，使动物适应 测压环境，然后进行急性降压作用实验。给药前测压一次，记录血压及 心率。给药后第4～6，9～11，14～16，19～21，27～29，34～36，44～46，50～ 52，59～61小时分别测压，获得给药前后血压、心率的变化情况。
3.3.剂量设置
实施例4透皮贴片的剂量选择为：20.0mg/kg体重(高剂量组)、 10.0mg/kg体重(中剂量组)、5.00mg/kg体重(低剂量组)。其中高剂量组 选择2.0mg/cm2规格的贴剂，贴剂使用面积：10.0cm2/kg体重。中、低 剂量组选择1.0mg/cm2规格的贴剂，贴剂使用面积分别为：10.0cm2/kg 体重、5.0cm2/kg体重。
空白对照：选用空白贴片，贴剂使用面积：10.0cm2/kg体重。
阳性药博苏给药量选择：10.0mg/kg体重，与实施例4透皮贴片中 剂量组相同。博苏片用0.5％CMC配制成混悬液，药物浓度：1.0mg/ml。
3.4给药方法
受试药物为贴剂，给药方法采用经皮外敷给药。给药前一日以10％ 硫化钠脱去大鼠背部毛，面积约5×5cm2。给药时先于大鼠裸露皮肤表 面贴上受试贴剂，然后再用医用胶布将其固定。
博苏采用经口给药方法(p.o.)，给药容积1.0ml/100g体重。
4.实验结果
观察受试药剂对自发性高血压大鼠的降压药效作用。实验结果以均 值±标准差(X±SD)表示，统计学处理采用组间student-T检验。如表5 所示：
表5：SHR给药后各时间段血压及心率变化值(X±SD)
*：P＜0.05；**：P＜0.01，与对照组比较
结果表明，实施例4透皮贴片高、中、低剂量组对自发性高血压大 鼠有明显的急性降压作用。高、中剂量组给药后4～6小时已产生明显 降压作用，至给药后59～61小时仍有较明显降压作用，低剂量组降压 作用时间可达到27～29小时左右。博苏组降压作用持续时间约27～29 小时。
实施例4透皮贴片高、中、低剂量组对HR有明显的抑制作用。博 苏给药组也对HR有明显抑制作用。相同给药剂量下，实施例4透皮贴 片与博苏对自发性高血压大鼠心率的抑制作用接近，但实施例4透皮贴 剂的降压作用明显大于博苏。
5.实验结论：
本发明透皮贴片对自发性高血压大鼠具有良好的降压作用，急性降 压作用强度较大，且降压作用维持时间长。相同给药剂量时，本发明透 皮贴片的降压作用强度明显大于博苏，且降压作用维持时间也长于博 苏，但对心率的抑制作用与博苏相似。
实验三：对自发性高血压大鼠(SHR)治疗性降压作用研究
1.实验目的
观察长期给药时，本发明透皮贴片对自发性高血压大鼠的治疗性降 压作用。
2.动物及分组
2.1.实验动物
SHR：同实验一所述。
2.2.动物分组
按血压高低平均分配原则将SHR随机分为6组，每组动物数：9～10 只。分别为空白贴剂对照组，实施例4透皮贴片高、中、低剂量组，比 较实施例2透皮贴片组，口服博苏给药组。
3.实验主要步骤
3.1.实验仪器
同实验一。
3.2.清醒大鼠血压测量方法
慢性治疗性降压实验，给药前至少测量血压10天以上，测压次数 不少于3次，使动物适应测压过程，获得可靠的血压、心率结果。以给 药前数次测压结果SAP、DAP、HR的平均值作为给药前血压及心率数 据，然后在给药期间的2、4、6、8天分别记录血压。其中给药期间血 压记录时刻选择在每次给药后约48小时，即下一次给药前进行。每组 动物每次记录血压尽量在相同时刻进行，时间差异不超过2小时。
3.3.药物与剂量设置
参考SHR急性降压实验给药剂量，将SHR治疗性降压实验的剂量 设置为：实施例4透皮贴片20.0mg/kg体重(高剂量组)、10.0mg/kg体重 (中剂量组)、5.00mg/kg体重(低剂量组)。其中高剂量组选择2.0mg/cm2规格的贴剂，贴剂使用面积：10.0cm2/kg体重。中、低剂量组选择1.0 mg/cm2规格的贴剂，贴剂使用面积分别为：10.0cm2/kg体重、5.0cm2/kg 体重。
比较实施例2透皮贴片使用面积：10.0cm2/kg体重，给药量： 10.0mg/kg体重。
空白对照：选用空白贴剂，贴剂使用面积：10.0cm2/kg体重。
博苏给药量选择：10.0mg/kg体重(p.o.)，两天给药一次。博苏片用 0.5％CMC配制成混悬液，药物浓度：1.0mg/ml。
4.给药方法
实施例4及比较实施例2透皮贴片、空白贴片为经皮外敷给药，博 苏为p.o.给药。根据急性降压实验结果，实施例4高、中剂量组一次给 药后降压作用持续时间可达到44小时以上，故治疗性降压实验选择两 天给药一次。比较实施例2也采用两天给药一次，而博苏采用两天p.o. 给药一次。
5.实验结果
实验结果以均值±标准差(X±SD)表示，统计学处理采用组间 student-T检验。如表6～8所示：
表6.连续给药对SHR的SAP的影响
注：1.*：p＜0.05；**：p＜0.01与空白对照组比较
2.#：p＜0.05；##：p＜0.01与自身给药前比较
3.给药后血压变化值(Δ)＝给药后血压-给药前血压
表7.连续给药对SHR DAP的影响
注：1.*：p＜0.05；**：p＜0.01与空白对照组比较
2.#：p＜0.05；##：p＜0.01与自身给药前比较
3.给药后血压变化值(Δ)＝给药后血压-给药前血压
表8.连续给药对SHR HR的影响实验结果
注：1*：p＜0.05；**：p＜0.01与空白对照组比较
2.#：p＜0.05；##：p＜0.01与自身给药前比较
3.给药后心率变化值(Δ)＝给药后心率-给药前心率
由表6～8所示结果可看出，连续给药4天后降压幅度达到平稳。 本发明透皮贴剂对HR有明显的抑制作用，表现为中、高剂量组给药期 间可明显使HR减小。
博苏片给药后也有一定降压作用及抑制心率作用，但作用强度较 小。比较实施例2透皮贴片有明显降压作用及抑制心率作用。
相同给药剂量下本发明透皮贴片的降压作用明显大于比较实施例2 透皮贴片及博苏给药，而抑制心率作用三者接近。
对照组在整个实验期间血压，心率变化不明显。
实验四：抗心肌缺血药效的研究
1.实验目的：
观察本发明透皮贴片对心肌缺血的影响，并与口服消心痛片剂进行 对照。
2.实验材料：
动物：SD大鼠(二级)，雄性，体重180～200g，购自中国医学科 学院实验动物所，合格证号：SCXK11-00-0006。
器材：心电图仪(ECG-6511上海光电医用电子设备有限公司)。
试剂：硝酸异山梨酯片(山东博山制药有限公司产品，临用时加水 配制成混悬液，浓度0.1042mg/mL)。
3.实验方法：
按体重平均将大鼠分为5组：正常组、模型组、消心痛片剂对照组、 实施例4透皮贴片高剂量组(3.8mg/kg体重)和低剂量组(1.9/kg体重)。 给药组和模型组动物于实验前背部剃毛，然后将贴剂紧贴于背上，并用 胶带固定边缘。记录时间，模型组动物贴空白贴片。片剂对照组在实验 前1小时灌胃给药(0.1042mg/mL)，贴片组于贴片15小时后，将大鼠 称重，用15％乌拉坦(成都化学试剂厂，批号：030706，以蒸馏水加热 溶解后配制成15％溶液)腹腔麻醉，测手术前心电图，开胸，做冠脉结 扎手术。正常组动物同样进行麻醉开胸，但不进行结扎手术。分别测量 手术后即刻、手术后2小时、4小时和6小时的心电图。描记6小时心 电图后，打开腹腔，自腹主动脉取血2mL，血样离心，取上清液，测量 血清乳酸脱氢酶、天冬氨酸转移酶、肌酸激酶。取出心脏，冷冻至变硬， 切下心尖至结扎处，再切成3～4片，NBT染色，然后用滤纸吸干，将 染色部位剪下，该部位是缺血区，其余部分为未缺血区，称量缺血区及 未缺血区的重量，计算缺血区/(缺血区+未缺血区)比值，可得到心肌梗 塞百分数。
分析给药前及给药后不同时间的心电图T波的升高值，计算各组的 心肌酶，进行统计学处理，评价药物的抗心肌缺血作用。
4.药效研究结果：
观察本发明透皮贴剂对大鼠冠脉结扎引起的心电图T波升高(mV) 影响、血清心肌酶升高的对抗作用以及心肌梗塞范围的影响，同时与施 用消心痛片剂的大鼠比较，结果如表9～11所示：
表9：对冠脉结扎大鼠引起的心电图T波升高(mV)影响
未结扎 结扎即刻 2小时 4小时 6小时 正常组 0 0.03±0.11 0.01±0083 0.06±0.069 0.04±0092 模型组 0 2.45±2.07## 1.68±1.84## 1.50±1.33## 1.67±1.6## 消心痛片剂组 (1.9mg/kg体重) 0 1.39±0.72 0.53±0.49 0.45±0.70* 0.23±05 ** 实施例4 低剂量贴片组 (1.9mg/kg体重) 0 0.46±0.047 0.20±0.096 0.10±0.067 ** 0.04±0.094 ** 实施例4 高剂量贴片组 (3.8mg/kg体重) 0 0.35±1.08 0.00±0.105* 0.00±0.075 ** -0.10±0.025 **
##：P＜0.01与正常组比较；
*：P＜0.05，**：P＜0.01与模型组比较。
表10：对冠脉结扎大鼠引起的血清心肌酶升高对抗作用
乳酸脱氢酶 天冬氨酸转移酶 肌酸激酶 正常组 502.7±183.6 170.3±28.4 1155.1±385.6 模型组 891.1±108.8## 339.3±40.84## 1982.2±730.6## 消心痛片剂组 (1.9mg/kg体重) 682±132.1* 256±29.9** 1348.7±555.1* 实施例4 低剂量贴片组 (1.9mg/kg体重) 819.1±131.9 268.6±59.4* 1344.1±438.9* 实施例4 高剂量贴片组 (3.8mg/kg体重) 796.9±178.4 281.3±74.4* 1324.6±557.3**
#：P＜0.05，##：P＜0.01与正常组比较；
*：P＜0.05，**：P＜0.01与模型组比较。
表11：对冠脉结扎大鼠引起的心肌梗塞范围的影响(％)
组别 剂量 梗塞范围％ 模型组 10.9±2.2 消心痛片剂组 1.9mg/kg体重 7.2±1.7** 实施例4 低剂量贴片组 1.9mg/kg体重 6.0±1.88** 实施例4 高剂量贴片组 3.8mg/kg体重 6.2±1.49**
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较。
实验结果显示：本发明透皮贴剂给药后21小时(结扎后6小时) 模型组动物心肌梗塞范围约11％，两个剂量的透皮贴片组动物心肌梗塞 范围均明显减少，与消心痛片剂组的效果相似或更低，模型组动物的血 清心肌酶显著升高，提示结扎后心肌细胞损伤，心肌酶外漏，给药后血 清的天冬氨酸转移酶和肌酸激酶显著下降，表明对心肌损伤有明显的保 护作用。结扎冠状动脉2小时后，模型组动物心电图T波明显升高，直 至实验结束仍未下降。本发明透皮贴剂和消心痛片剂组动物结扎冠脉2 小时后(给贴剂17小时后)，T波开始明显降低，这一作用持续至实验 结束(结扎后6小时)。
结果表明本发明透皮贴剂在结扎冠状动脉引起的心肌缺血模型上 显示出与消心痛片剂相当或更好的药效。
以上实验结果表明，本发明的透皮贴剂对多种心脏不良事件具有良 好的预防与治疗作用。