技术领域
本发明涉及一种蛋白质生物制剂，是一种用于预防母体原发性或激活性人巨 细胞病毒(HCMV)感染，阻断HCMV垂直传播的疫苗。
背景技术
人巨细胞病毒(Human Cytomeglalovirus)HCMV属疱疹病毒β亚科的双股 DNA病毒，人群中CMV感染非常广泛，初次感染通常呈隐性感染，少数有临床症 状，60-90％成人已有CMV抗体，但大多数人感染后虽产生特异性抗体，但病毒 并没有被从人体清除而转为长期带毒成为潜伏感染。在发生原发或激活性HCMV 感染的妊娠妇女，可发生宫内感染甚至导致流产、胎儿畸形以及脑神经系统损害 遗留的耳聋失明等后遗症。先天性HCMV感染主要来自于母体的垂直传播，因此 必须在损害发生之前能有效地预防母体的HCMV原发性感染是阻断先天性HCMV 感染发生的关键。
近年国外研制的两种HCMV减毒活疫苗(AD169和Townel 125)已在健康志 愿者及器官移植者中进行试验，但该疫苗保护能力有限，且不能排除由于病毒长 期潜伏体内发生激活及癌变的可能，随后有学者提取HCMV亚单位肽作为抗原进 行动物试验及人体试验中，发现由该疫苗刺激机体、诱导产生的中和抗体无论在 量及时间上都非常有限，且提取工艺复杂，价格昂贵。
发明内容
HCMVpp65蛋白质疫苗的制备方法，是利用分子生物学的技术和方法，先提 取HCMV DNA，并以其为模板扩增出带有CTL和B淋巴细胞抗原优势表位的pp65 (1006-1521nt)基因片段，克隆至PET100-TOPO原核表达载体，并在E.coli BL21细胞中进行外源目的基因的表达，鉴定其特异性及免疫原性后，大量提取 并纯化HCMVpp65目的片段蛋白质。HCMVpp65蛋白质疫苗在诱导孕期妇女机体免 疫反应中，可以打破母体生理免疫耐受状态获得较强的、特异性的体液免疫及细 胞免疫，从而阻断HCMV先天性感染，得到良好的保护效果。
人巨细胞病毒pp65蛋白质疫苗的制备方法，其特征是提取HCMV DNA，并以 其为模板扩增出带有CTL和B淋巴细胞抗原优势表位的pp65(1006-1521nt) 基因片段，克隆至PET100-TOPO原核表达载体，并在E.coli BL21细胞中进行 外源目的基因的表达，鉴定其特异性及免疫原性，大量提取并纯化pp65目的片 段蛋白质。
目前pp65蛋白质疫苗仅使用于鼠模型：实验中本发明选择的是Balb/c小鼠 (SPF级)30只、重约18-20g随机分为五组，每组六只：
A组(pp65蛋白质疫苗免疫组)每只小鼠初次分别经背部皮下多点注射50μg Tpp65蛋白，于第2、4周分别经背部皮下多点加强注射50μgTpp65蛋白；B 组(Tpp65 DNA免疫组)每只小鼠分别在第0、2、4周经股四头肌注射200μg pcDNA3.1-Tpp65质粒DNA；C组(Tpp65蛋白质和DNA联合免疫组)每只小 鼠分别在第0、2周经股四头肌注射200μgpcDNA3.1-Tpp65质粒DNA，在第四 周经背部皮下多点注射50μl Tpp65蛋白质(1μg/μl)+50μl CFA；D组(空质粒阴 性对照组)每只小鼠分别在第0、2、4周经股四头肌注射200μgpcDNA3.1空质 粒；E组(空白对照组)每只小鼠分别在第0、2、4周经股四头肌注射200μl 生理盐水。末次免疫后的第3d，采血，收集血清，检测各组小鼠血清中的pp65 抗体水平；同时，取各组小鼠脾细胞，用重组pp65蛋白质作为抗原刺激，MTT 法测定T淋巴细胞的增殖指数和脾脏的特异性杀伤细胞率；双抗体夹心ELISA 法定量检测脾细胞上清中IFN-γ的含量。
结果：Tpp65蛋白质、Tpp65DNA、Tpp65蛋白质片段+Tpp65 DNA联合免疫、 空质粒阴性对照组、空白对照组，血清抗体效价分别为：A组1∶678.81；B组 1∶67.32；C组1∶240；；D组和E组均＜1∶10。增殖指数分别为：A组6.76±1.82； B组5.43±1.56；C组7.18±1.95；D组2.74±0.95；。CTL杀伤率分别为：A组 71.00％±18.82％；B组56.86％±16.62％；C组73.58％±22.61％；D组23.58％±4.28％。 IFN-γ分别为：A组747.66±46.17ng/L；B组464.12±29.95ng/L；C组787.97±56.90 ng/L；D组100.06±9.76ng/L
pp65蛋白质疫苗显著特点就在于既可诱导细胞免疫又可诱导体液免疫，虽然在 诱导细胞免疫方面次于Tpp65蛋白质和DNA联合免疫组，但是pp65蛋白质疫 苗却能诱导机体产生很高效价的、并且特异性很强的抗体，并且针对性强，副作 用小，安全性高。该疫苗主要供预防母体HCMV原发性感染及阻断HCMV先天性感 染。
具体实施方式
1、目的基因的提取、扩增、纯化
1.1将HCMV AD169标准株病毒接种至人胚成纤维细胞中，增殖至90％的细胞出 现特征性病变时，收集破碎细胞，离心取上清，加蛋白酶K至终浓度为 500ng/L、37℃作用1小时，加入10％SDS至终浓度为1％，37℃作用1小时， 酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一 次，将抽提液加入透析袋内，用双蒸水透析48小时，每6-8小时换液一次， 用PEG(分子量20000)浓缩，4℃保存。
1.2利用PCR技术、以HCMVDNA为模板扩增pp65(1006-1521nt)基因(简称pp65)
1.3PCR产物的纯化，按商品化试剂盒说明书进行操作，并将纯化后的PCR产物 置于4℃保存。
2、pp65目的基因与原核表达载体TOPO的连接、转化、鉴定
2.1建立如下反应混合物体系：
经过PCR试剂盒纯化的pp65DNA：2μl
盐溶液(TOPO载体试剂盒配带)：1μl
无菌双蒸水：2μl
TOPO载体：1μl
2.2将上述反应混合物均匀混合，在室温下(22℃-25℃)孵育5min。
2.3将3μl的连接物(含有连接物的混合物)加入一管TOP10感受态细胞，冰上 放置5min、42℃90sec，立即冰上放置1-2min、加800μlSOC(SOC是一种公认 的培养基其成分有胰蛋白胨，葡萄糖，酵母提取物，去离子水，NaCl)，37℃缓 慢摇菌1h、涂布LB平板(含100μg/μlAmp)。室温放置15min，37℃倒置培养过 夜。
2.4阳性克隆的质粒提取
2.5PCR鉴定：将重组质粒置于沸水浴中5min，再立即置于冰上，分别以其为 模板与pp65引物进行PCR反应，然后作1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。 引物：
p1：5’-CACCATGGATATCGACTTGCTGCTGC3’，
p2：5’-TCAATTCTGACCCTGAACCGTAGCCACC-3’
由上海生工生物工程公司提供。
2.6阳性克隆的测序鉴定：进行DNA测序，测序结果见附图。
3、重组基因的转化、表达及鉴定
3.1已经过鉴定、纯化的重组质粒转化E.coli BL21宿主菌，
3.2 pp65重组蛋白诱导表达：，
3.2.1挑选阳性菌落点种于3ml Amp/LB(氨苄青霉素/LB)液体培养基中、37℃ 振荡培养过夜，
3.2.2次日取1∶50扩大培养、37℃振荡4h、待光密度吸收值OD600(指在600 个纳米处光密度吸收值)值达0.6时，留取菌液1ml，4000r/min弃上清， 为未诱导管。
3.2.3在余下的菌液中加入1ml IPTG(指异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终 浓度为1mmol/L，37℃振荡、诱导6h后分别留取菌液1ml，4000rpm离 心5min，留菌体沉淀，
3.2.4加入蛋白上样缓冲液(成份：100mmol/lTris-cl PH6.8，200mmol/l二硫 苏糖醇，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油。)100μl，置沸水中 8min裂解细菌，-20℃冻存备用。
3.3重组蛋白表达产物SDS-PAGE蛋白电泳：5％浓缩胶、80v和12％分离胶、 150v。剥胶，染色，脱色。
3.4 Western-blotting法检测表达蛋白质的免疫原性，结果见附图。
4、pp65重组蛋白的大量诱导表达
4.1菌种保存：
将目的蛋白表达量较高的菌株按1∶10(w/v)的比例接种于LB培养基，37℃、 220rpm摇床振荡培养至OD600约为0.4-0.6，加入终浓度为30％mg/ml的甘油， 混匀后分装成1ml的小管，-80℃保存，作为原始菌种。
4.2 pp65重组蛋白的诱导表达：
4.2.1将-80℃冻存已鉴定的阳性菌液接种于LB琼脂平板，37℃培养过夜。次 日，从平板上挑取单个阳性菌落。
4.2.2挑取单菌落接种于3ml LB培养基37℃，220rpm摇床振荡培养。
4.2.3再次以1∶100比例接种于50ml LB培养基37℃，220rpm摇床振荡培养， 至OD600约为0.6-0.8。
4.2.4再次以1∶100比例接种于300ml LB培养基37℃，220rpm摇床振荡培养， 至OD600约为0.4-0.6。
4.2.5加入IPTG(诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1mmol/L， 继续培养5h。
4.2.6用4000rpm离心10min，收集菌体，
4.2.7用PBS(成份：每1000ml含NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、 KCl 0.2g)缓冲液洗涤菌体两次后，称取菌体湿重，于-20℃保存。
4.3蛋白质的制备：
4.3.1大量表达菌体的破碎：采用超声破碎法超声破碎菌体，提取菌体悬液在4 ℃12000rpm离心10min、弃上清、沉淀用超声破碎液(指20mmol/LTris-clPH8.0 100mmol/l NaCl 2mmol/LEDTA)重悬，继续重复以上步骤3-4 次，至上清液离心后呈清亮为止。
4.3.2包涵体的洗涤和纯化：超声裂解后的菌体在4℃12000rpm离心10min弃 上清、并将每份沉淀重悬于1ml含2M尿素的TE(20mmol/LTris-cl PH8.0， 2mmol/LEDTA)缓冲液中，继续重复以上步骤4-5次，到出上清将沉淀重悬 于1ml水中，从沉淀中吸出10μl样品，与2XSDS-PAGE凝胶加样缓冲液混 合，通过SDS-PAGE电泳进行分析，以确定蛋白质洗涤程度。
4.3.4蛋白质定量：利用紫外分光光度计法。