转铁蛋白蛙卵核糖核酸酶偶联物及其制法和用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101450214 B (45)授权公告日 2011.10.26 CN 101450214 B *CN101450214B* (21)申请号 200710171892.1 (22)申请日 2007.12.06 A61K 47/48(2006.01) A61K 38/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 上海南方模式生物科技发展有限 公司 地址 201203 上海市浦东张江蔡伦路88号2 栋 4 楼 专利权人 上海南方模式生物研究中心 (72)发明人 王庆诚 沈如凌 许国峰 孙瑞林 费俭 王铸钢 (74)专利代理机构 上海一平。

2、知识产权代理有限 公司 31266 代理人 祝莲君 CN 1876682 A,2006.12.13,说明书第1页第 3 段 -2 页最后一段 . CN 1762489 A,2006.04.26,说明书第2页第 2 段 - 第 3 页第 1 段 . CN 1229498 C,2005.11.30,说明书第5页第 1 段 - 第 20 页第 4 段 . US 20030099629 A1,2003.05.29, 说明书第 2 页 0017- 第 5 页 0061. US 5529775 A,1996.06.25,说明书第1栏第 30 行 - 第 7 栏第 33 行 . 许国峰 . 核酸酶 Onco。

3、nase 抗肿瘤研究 .中 国优秀硕士学位论文数据库 .2004,6 8,18 22,32,43. 张桂红 等 . 牛蛙核糖核酸梅的表达和鉴定 及功能检测 . 肿瘤防治杂志 .2005, 第 12 卷 (第 23 期 ),1761-1763. (54) 发明名称 转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物及其制法 和用途 (57) 摘要 本发明属于生物制药领域， 公开了一种转铁 蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物， 所述的偶联物含 有 1 个转铁蛋白和 1-5 个蛙卵核糖核酸酶。本发 明还公开了所述偶联物的制备方法、 用途以及含 有所述偶联物的药物组合物。不少肿瘤细胞高表 达转铁蛋白受体， 而且转铁蛋白与。

4、其受体结合后 极易被内吞， 因而本发明的偶联物较游离的蛙卵 核糖核酸酶更易进入细胞浆， 从而具有更强和更 专一的杀伤肿瘤细胞的能力。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹维 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 15 页 附图 2 页 CN 101450214 B1/1 页 2 1. 一种分离的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物， 其特征在于， 所述的偶联物含有 1 个转铁蛋白和 1-5 个与所述转铁蛋白偶联的蛙卵核糖核酸酶， 所述偶联物的分子量在 89-137KD ； 所述的偶联物是用以下方法制得的 ： (a)将转铁蛋白与N-羟基。

5、琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯接触， 获得经N-羟 基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白， 其中转铁蛋白与 N- 羟基琥珀 酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯的摩尔比是 1 (5-10) ； (b) 将蛙卵核糖核酸酶与 2-IminothiolaneHCl 接触， 获得经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白， 其中蛙卵核糖核酸酶与 2-IminothiolaneHCl 的摩尔比是 1 (5-10) ； (c) 将步骤 (a) 获得的经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的 转铁蛋白和步骤 (。

6、b) 获得的经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶以摩尔比 1 (1-4) 混合， 从而使得转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 (d) 收集分子量为 89-137kD 的偶联物。 2. 如权利要求 1 所述的偶联物， 其特征在于， 所述的转铁蛋白具有 SEQ ID NO ： 2 所示 的氨基酸序列 ； 或者 所述的蛙卵核糖核酸酶具有 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序列。 3.一种制备权利要求1所述的转铁蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶联物的方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： (a)将转铁蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯接触， 获得经N-羟 。

7、基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白， 其中转铁蛋白与 N- 羟基琥珀 酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯的摩尔比是 1 (5-10) ； (b) 将蛙卵核糖核酸酶与 2-IminothiolaneHCl 接触， 获得经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白， 其中蛙卵核糖核酸酶与 2-IminothiolaneHCl 的摩尔比是 1 (5-10) ； (c) 将步骤 (a) 获得的经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的 转铁蛋白和步骤 (b) 获得的经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙。

8、卵核糖核酸酶以摩尔比 1 (1-4) 混合， 从而使得转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 (d) 收集分子量为 89-137kD 的偶联物。 4.权利要求1所述的转铁蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶联物的用途， 其特征在于， 用于制备 抑制肿瘤的组合物。 5. 如权利要求 4 所述的用途， 其特征在于， 所述的肿瘤是高表达转铁蛋白受体的肿瘤。 6. 一种抑制肿瘤的组合物， 其特征在于， 所述的组合物含有 ： (i) 有效量的权利要求 1 所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物 ； 和 (ii) 药学上可接受的载体。 7. 一种体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长的方法， 其特征在于， 所述的方法包括利用。

9、 权利要求 1 所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物处理肿瘤细胞。 权 利 要 求 书 CN 101450214 B1/15 页 3 转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物及其制法和用途 技术领域 0001 本发明属于生物制药领域， 更具体地， 本发明涉及转铁蛋白 (Tf)- 蛙卵核糖核酸 酶 (Onconase) 偶联物及其制备方法和用途。 背景技术 0002 蛙卵核糖核酸酶 (Onconase 又称 ： P30 protein， Ranpirnase， 简称 Onc) 是从豹蛙 (Rana pipiens) 卵母细胞和早期胚胎中分离的一种核酸酶， 属于 RNaseA 超家族。研究表 明， 。

10、Onc 通过胞吞作用进入细胞， 在胞浆内选择性地降解 tRNA， 抑制蛋白合成进而抑制细胞 增殖和引起细胞凋亡。 体外实验表明， Onc对多种肿瘤细胞具有抗增殖和细胞毒性作用， 如 ： 人的前列腺癌细胞、 胰腺癌细胞、 白血病细胞等。小鼠模型的体内实验证明， Onc 可以抑制 肿瘤生长， 延长小鼠存活时间， 增强多种抗肿瘤药物的效果。 0003 目前， Onc 作为一种抗恶性间质细胞瘤的药物已经进入三期临床， 可能是一种潜在 的具有良好前景的抗肿瘤药物。但由于该蛋白为非人源性蛋白， 因此在人体中使用时仍会 产生一定的免疫反应和副反应(如肾损伤)， 同时Onc对于一些正常细胞也有一定的杀伤效 果。

11、， 要克服这些缺点就需要增强Onc对肿瘤细胞的特异性杀伤作用， 提高Onc进入肿瘤细胞 的效率。因此， 仍需要提高 Onc 特异性进入肿瘤细胞的能力， 以减少其副作用。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种转铁蛋白(Tf)-蛙卵核糖核酸酶(Onconase)偶联物。 0005 本发明的另一目的在于提供所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物的制备方 法和用途。 0006 在本发明的第一方面， 提供一种分离的转铁蛋白 (Tf)- 蛙卵核糖核酸酶 (Onconase) 偶联物， 所述的偶联物含有 1 个转铁蛋白和 1-5 个与所述转铁蛋白偶联的 ( 优 选的是 2-4 个 ； 更优选 2-。

12、3 个 ) 蛙卵核糖核酸酶， 所述偶联物的分子量在 89-137KD。 0007 在另一优选例中， 所述的转铁蛋白具有 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列 ； 或者所 述的蛙卵核糖核酸酶具有 SEQ ID NO ： 4 所示的氨基酸序列。 0008 在另一优选例中， 所述的偶联物是用以下方法制得的 ： 0009 (1) 利 用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 3-(2- 吡 啶 二 硫 代 基 ) 丙 酸 酯 (SPDP) 和 2-IminothiolaneHCl( 也称为 Traut 试剂 ) 将转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 0010 (2) 分离获得所述的转铁蛋白 -。

13、 蛙卵核糖核酸酶偶联物。 0011 在本发明的第二方面， 提供一种制备所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物的 方法， 所述方法包括 ： 0012 (1) 利 用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 3-(2- 吡 啶 二 硫 代 基 ) 丙 酸 酯 和 2-IminothiolaneHCl 将转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 0013 (2) 分离获得所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物。 0014 在另一优选例中， 所述方法包括 ： 说 明 书 CN 101450214 B2/15 页 4 0015 (a) 将转铁蛋白与 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯。

14、接触， 获得经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白 ； 0016 (b) 将 蛙 卵 核 糖 核 酸 酶 与 2-IminothiolaneHCl 接 触，获 得 经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白 ； 0017 (c)将步骤(a)获得的经N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯处理的 转铁蛋白和步骤 (b) 获得的经 2-Iminothiolane HCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白混合， 从 而使得转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 0018 (d) 收集分子量为 89-137kD 的偶联物。 0019 在另一。

15、优选例中， 经离子交换去除游离的转铁蛋白和 Onc， 从而收集分子量为 89-137kD 的偶联物。 0020 在另一优选例中， 在步骤 (a) 中， 转铁蛋白与 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫 代基 ) 丙酸酯的摩尔比是 1 (5-10)。 0021 在另一优选例中， 在步骤 (b) 中， 蛙卵核糖核酸酶与 2-IminothiolaneHCl 的摩 尔比是 1 (5-10)。 0022 在另一优选例中， 在步骤 (c) 中， 步骤 (a) 获得的经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡 啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白和步骤 (b) 获得的经 2-Iminothiolane。

16、HCl 处理的 蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩尔比是 1 (1-4)。 0023 在另一优选例中， 步骤 (a) 获得的经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙 酸酯处理的转铁蛋白和步骤 (b) 获得的经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶 蛋白的摩尔比约是 1 3。 0024 在本发明的第三方面， 提供所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物的用途， 用 于制备抑制肿瘤的组合物。 0025 在另一优选例中， 所述的肿瘤是高表达转铁蛋白受体的肿瘤。 0026 在本发明的第四方面， 提供一种抑制肿瘤的组合物， 所述的组合物含有 ： 0027 (i) 有效量的所述。

17、的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物 ； 和 0028 (ii) 药学上可接受的载体。 0029 在本发明的第五方面， 提供一种体外 ( 优选非治疗性地 ) 抑制肿瘤细胞生长的方 法， 所述的方法包括利用所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物处理肿瘤细胞。 0030 本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明 0031 图 115 SDS-PAGE 凝胶电泳显示了本发明蛙卵核糖核酸酶表达纯化效果蛋白凝 胶图。其中， 0032 泳道 1 为诱导前菌体总蛋白 ； 0033 泳道 2 为诱导 2.5h 后菌体总蛋白 ； 0034 泳道 3 为诱导后菌体包。

18、涵体 ； 0035 泳道 4 为复性并纯化后 Onc( 上样量 2g) ； 0036 泳道 5 为蛋白分子量标准 ； 说 明 书 CN 101450214 B3/15 页 5 0037 泳道 6 为 RNase A 纯品 ( 上样量 1.5g)。 0038 图 2(a)15 SDS-PAGE 凝胶电泳显示了转铁蛋白与蛙卵核糖核酸酶偶联效果蛋白 凝胶图。其中， 0039 泳道 1 为非还原的 Onc 纯品 ( 上样量 2g) ； 0040 泳道 2 为非还原的 Tf 纯品 ( 上样量 2g) ； 0041 泳道 3 为非还原的 Onc-Tf( 上样量 4g) ； 0042 泳道 4 为还原的 O。

19、nc 纯品 ( 上样量 2g) ； 0043 泳道 5 为还原的 Tf 纯品 ( 上样量 2g) ； 0044 泳道 6 为还原的 Onc-Tf( 上样量 4g) ； 0045 泳道 7 为蛋白分子量标准。 0046 图 2(b)10 SDS-PAGE 凝胶电泳进一步显示了转铁蛋白与蛙卵核糖核酸酶偶联蛋 白分子量分布。其中， 0047 泳道 1 为非还原的 Tf 纯品 ( 上样量 2g) ； 0048 泳道 2 为非还原的 Onc-Tf( 上样量 4g) ； 0049 泳道 3 为还原的 Tf 纯品 ( 上样量 2g) ； 0050 泳道 4 为蛋白分子量标准。 0051 图 3 显示了 MT。

20、T 法检测采用 SPDP 和 2-IminothiolaneHCl 作为偶联剂获得的 Tf-Onc 偶联物和 Onc 对小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 细胞毒性效果图。 0052 图 4 显示了 MTT 法检测单单采用 SPDP 作为偶联剂获得的 Tf-Onc 偶联物和 Onc 对 小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 细胞毒性效果图。 0053 图 5 显示了 MTT 法检测采用 SPDP 和 2-IminothiolaneHCl 作为偶联剂获得的 Tf-Onc 偶联物和 Onc 对人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞毒性效果图。 具体实施方式 0054 针对目前现有技术中蛙卵核糖核酸酶对于肿瘤细胞的特异。

21、性不高， 造成杀伤一些 正常细胞的缺陷， 本发明人经广泛的研究以及反复的选择和试验， 首次制成了一种高度纯 化的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物。在该偶联物中， 转铁蛋白可通过转铁蛋白受体介 导的胞体转运作用进入到肿瘤细胞， 将蛙卵核糖核酸酶带入肿瘤细胞， 发挥杀伤肿瘤细胞 的作用。本发明的偶联物中， 每个转铁蛋白分子上偶联有 1-5 个蛙卵核糖核酸酶， 因此分子 大小适中， 易于穿透肿瘤细胞的细胞膜而进入到细胞。在此基础上完成了本发明。 0055 本发明的主旨在于利用转铁蛋白作为药物载体， 将 Onc 输送到这些肿瘤细胞的表 面， 可以增强Onc的内吞， 改善它的专一性， 从而扩大Onc治。

22、疗肿瘤的范围， 增强药效并减少 其副作用。 0056 本发明主要基于许多肿瘤细胞代谢旺盛， 高表达转铁蛋白受体的特点 ( 通常肿瘤 细胞表达10,000至100,000个TfR1， 而TfR1在正常细胞上低表达或者未检测到有表达， 参 见ZHONGMING QIAN等， Targeted drug delivery via thetransferrin receptor-mediated endocytosis pathway.Pharmacol Rev54 ： 561-587， 2002)， 将转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶 相偶联， 该偶联物兼具有两者的生物学功能， 既可通过转铁蛋白将该偶联物特。

23、异性地结合 到高表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞上， 通过胞吞作用进入细胞后， 该偶联物利用蛙卵核糖 说 明 书 CN 101450214 B4/15 页 6 核酸酶的细胞毒性作用， 杀死细胞。 所以该偶联物可以特异性地结合到肿瘤细胞上， 大大提 高蛙卵核糖核酸酶进入肿瘤细胞的效率和杀肿瘤细胞的特异性， 增强对肿瘤细胞的杀伤效 果、 减少蛙卵核糖核酸酶的副作用。本发明的偶联物特别适合于各种高表达转铁蛋白受体 类型的肿瘤的治疗， 例如 ( 但不限于 ) 脑瘤、 白血病等的治疗。 0057 转铁蛋白 0058 转铁蛋白 (Transferrin， 简称 Tf) 是一种分子量约为 77kD， 可与铁离子结。

24、合的 糖蛋白。结合了铁离子的转铁蛋白可特异性地与其受体 (TransferrinReceptor 1， 简称 TfR1) 结合， 介导铁离子的胞内转运。TfR1 在肿瘤细胞上高表达， 因而可转运更多的转铁蛋 白进入到肿瘤细胞。 0059 在本发明中， 所用的转铁蛋白可以是天然存在的， 比如其可被分离或纯化自动物。 此外， 所述的转铁蛋白也可以是人工制备的， 比如可以根据常规的基因工程重组技术来生 产重组转铁蛋白。 0060 任何适合的转铁蛋白均可用于本发明。 所述的转铁蛋白包括全长的转铁蛋白或其 生物活性片段。优选的， 所述的转铁蛋白的氨基酸序列可以与 SEQ ID NO ： 2 所示的序列基。

25、 本上相同。 0061 经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的转铁蛋白的氨基酸序列 也包括在本发明中。转铁蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列， 所述 经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域 的公知的技术， 所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这 些技术使本领域人员认识到， 一般来说， 在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上 不会改变生物活性。见 Watson 等 Molecular Biology of The Gene， 第四版， 1987， The Benjamin/CummingsPub.Co。

26、.P224。 0062 任何一种转铁蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里， 转铁蛋白的 生物活性片段的含义是指作为一种多肽， 其仍然能保持全长的转铁蛋白的全部或部分功 能。 通常情况下， 所述的生物活性片段至少保持50的全长转铁蛋白的活性。 在更优选的条 件下， 所述活性片段能够保持全长转铁蛋白的 60、 70、 80、 90、 95、 99、 或 100 的活性。 0063 本发明也可采用经修饰或改良的转铁蛋白， 比如， 可采用为了促进其半衰期、 有效 性、 代谢、 和 / 或蛋白的效力而加以修饰或改良的转铁蛋白。所述经过修饰或改良的转铁蛋 白或者基因可以是与天然存在的转铁蛋白或基。

27、因虽然具有一定的不同点， 但也能抑制肿瘤 细胞， 且不会带来其它不良影响或毒性。 也就是说， 任何不影响转铁蛋白的生物活性或者说 是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。 0064 所述的转铁蛋白可以是获自商业购买的途径， 作为本发明的一个实例， 所述的转 铁蛋白购自 CALBIOCHEM。 0065 蛙卵核糖核酸酶 0066 所述的蛙卵核糖核酸酶是一种对于抑制肿瘤细胞有用的酶， 其可在胞浆内选择性 地降解 tRNA， 抑制蛋白合成进而抑制细胞增殖和引起细胞凋亡。 0067 在本发明中， 所用的蛙卵核糖核酸酶可以是天然存在的， 比如其可被分离或纯化 自动物。 此外， 所述的蛙卵核糖核酸酶也。

28、可以是人工制备的， 比如可以根据常规的基因工程 说 明 书 CN 101450214 B5/15 页 7 重组技术来生产重组蛙卵核糖核酸酶。优选的， 本发明可采用重组的蛙卵核糖核酸酶。 0068 任何适合的蛙卵核糖核酸酶均可用于本发明。 所述的蛙卵核糖核酸酶包括全长的 蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段。优选的， 所述的蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列可以与 SEQ ID NO ： 4 所示的序列基本上相同。 0069 经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的蛙卵核糖核酸酶的氨基 酸序列也包括在本发明中。 蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替 代序列， 所述经氨基酸替换的序。

29、列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基 酸是本领域的公知的技术， 所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物 活性。 这些技术使本领域人员认识到， 一般来说， 在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸 基本上不会改变生物活性。见 Watson 等 Molecular Biology of The Gene， 第四版， 1987， TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。 0070 任何一种蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里， 蛙卵 核糖核酸酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽， 其仍然能保持全长的蛙卵核糖核酸 酶的全部或部分。

30、功能。通常情况下， 所述的生物活性片段至少保持 50的全长蛙卵核糖 核酸酶的活性。在更优选的条件下， 所述活性片段能够保持全长蛙卵核糖核酸酶的 60、 70、 80、 90、 95、 99、 或 100的活性。 0071 本发明也可采用经修饰或改良的蛙卵核糖核酸酶， 比如， 可采用为了延长其半衰 期、 改善其稳定性或增强其杀伤肿瘤细胞能力而加以修饰或改良的蛙卵核糖核酸酶。所述 经过修饰或改良的蛙卵核糖核酸酶或者基因可以是与天然存在的蛙卵核糖核酸酶或基因 虽然具有一定的不同点， 但也能杀伤肿瘤细胞， 且不会带来其它不良影响或毒性。也就是 说， 任何不影响蛙卵核糖核酸酶的生物活性或者说是基因的生物。

31、功能的变化形式都可用于 本发明中。 0072 作为本发明的一个实例， 所述的蛙卵核糖核酸酶是重组表达的， 所述的蛙卵核糖 核酸酶的编码基因全长 315bp， 编码 104 个 AA 的一个多肽， 该基因如 SEQ ID NO ： 3 所示， 其 编码的蛋白如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0073 所述的蛙卵核糖核酸酶可通过常规的基因工程方法生产， 一般来说有以下步骤 ： 0074 (1). 用含有蛙卵核糖核酸酶编码基因的重组表达载体转化或转导合适的宿主细 胞 ； 0075 (2). 在合适的培养基中培养的宿主细胞 ； 0076 (3). 从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。 0077 。

32、偶联物 0078 本发明提供了一种转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物， 所述偶联物的分子量在 89-137KD， 并且， 每个转铁蛋白分子上偶联有 1-5 个蛙卵核糖核酸酶。 0079 本发明人在研究中发现， 可穿过细胞膜进入到细胞的分子必需满足一定的大小， 如果转铁蛋白上偶联的蛙卵核糖核酸酶分子过多， 不仅导致分子结构过大， 还会影响到转 铁蛋白与肿瘤细胞膜上的转铁蛋白受体的结合， 效果不理想 ； 如果多个转铁蛋白偶联一个 或多个蛙卵核糖核酸酶， 则导致分子体积过大， 难以穿透血管壁而进入到肿瘤组织内。因 此， 在制备偶联物的过程中， 需要控制获得的偶联物含有一个转铁蛋白 ( 约 77KD)。

33、 以及 1 或 若干个(优选1-5个)蛙卵核糖核酸酶(约12KD)， 以使得偶联物能够顺利地进入到肿瘤细 说 明 书 CN 101450214 B6/15 页 8 胞并发挥良好的杀伤肿瘤细胞的效果。 0080 考虑到偶联物的大小以及杀伤肿瘤细胞的效力， 优选的是每个转铁蛋白分子上偶 联有 2-4 个蛙卵核糖核酸酶 ； 更优选的是每个转铁蛋白分子上偶联有 2-3 个蛙卵核糖核酸 酶。 0081 本发明还提供了所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物的用途， 用于制备抑制 肿瘤 ( 肿瘤细胞 ) 的组合物。优选的， 所述的肿瘤是高表达转铁蛋白受体的肿瘤 ； 肿瘤转铁 蛋白受体表达水平越高， 本发明。

34、的偶联物的效果越好。 0082 偶联物的制备方法 0083 本发明人在研究中发现， 单采用SPDP作为偶联剂来制备转铁蛋白-蛙卵核糖核酸 酶偶联物， 获得的偶联物随机性大、 结构不一， 分子量大小差别较大， 不利于纯化， 且偶联物 进入到肿瘤细胞的比例低。 0084 本发明人进行了长期的研究和改进， 找到了一种可制备符合要求的转铁蛋白 - 蛙 卵核糖核酸酶偶联物的方法， 所述方法包括 ： 0085 (1) 利 用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 3-(2- 吡 啶 二 硫 代 基 ) 丙 酸 酯 (SPDP) 和 2-IminothiolaneHCl 将转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和。

35、 0086 (2) 分离获得所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物。 0087 作为本发明的优选方式， 所述方法包括 ： 0088 (a)将转铁蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)接触， 获得经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白 ； 0089 (b) 将 蛙 卵 核 糖 核 酸 酶 与 2-IminothiolaneHCl 接 触，获 得 经 2-IminothiolaneHCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白 ； 0090 (c)将步骤(a)获得的经N-羟基琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯处理的 转铁蛋白和步骤 (b)。

36、 获得的经 2-Iminothiolane HCl 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白混合， 从 而使得转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶联 ； 和 0091 (d) 收集分子量为 89-137kD 的偶联物。 0092 将转铁蛋白用 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理后与经过 2-Iminothiolane 处理的蛙卵核糖核酸酶蛋白进行偶联， 其结果获得的大多偶联产物分子 量大小在 89-137KD， 也即大多数的偶联物中含有 1 个转铁蛋白分子 ( 约 77KD) 和 1-5 个蛙 卵核糖核酸酶分子(1个蛙卵核糖核酸酶分子约12KD)。 该偶联物具有良好的进入肿瘤细胞 的能力以。

37、及良好的杀伤肿瘤细胞的能力。并且， 所述的偶联物由于结构稳定且分子量较集 中地处于一定范围内， 还有利于后续的纯化。 0093 作为本发明的优选方式， 偶联剂处理时， 转铁蛋白与偶联剂 N- 羟基琥珀酰亚 胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯的摩尔比是 1 (5-10)， 蛙卵核糖核酸酶与偶联剂 2-Iminothiolane HCl 的摩尔比是 1 (5-10)， 按照该比例进行处理可在最终获得更为理 想的偶联产物。 0094 作为本发明的优选方式， 在步骤 (c) 中， 步骤 (a) 获得的经 N- 羟基琥珀酰亚胺 3-(2- 吡啶二硫代基 ) 丙酸酯处理的转铁蛋白和步骤 (b) 获得。

38、的经 2-Iminothiolane 处理 的蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩尔比是 1 (2-4) ； 更优选的摩尔比约是 1 3。 0095 作为本发明的优选方式， 在采用 SPDP 处理转铁蛋白后， 为了去除杂质并保留经处 说 明 书 CN 101450214 B7/15 页 9 理的转铁蛋白， 可采用常规的纯化方法进行纯化， 所述的纯化方法包括但不限于 ： 层析法、 透析法。此外， 在采用 2-IminothiolaneHCl 处理蛙卵核糖核酸酶后、 或在经偶联剂处理 的转铁蛋白与经偶联剂处理的蛙卵核糖核酸酶混合并发生偶联反应后也可进行纯化以获 得较纯的中间产物或产品。 0096 作为本发明的优。

39、选方式， 在步骤 (d) 中， 采用强阳离子交换层析去除游离的转铁 蛋白和 Onc， 从而收集分子量为 89-137kD 的偶联物。所述离子交换方法得率高、 纯度高。 0097 偶联产物的鉴定可采用本领域常用的技术， 例如电泳， 通过观察电泳条带的位置 和大小来判断所获得的偶联物是否是所需要的。 0098 药物组合物 0099 本发明还提供一种抑制肿瘤的组合物， 所述的组合物含有 ： (i) 有效量 ( 如 0.00001-50uM) 的本发明所述的转铁蛋白 - 蛙卵核糖核酸酶偶联物 ； 和 (ii) 药学上可接受 的载体。 0100 如本文所用，“药学上或食品学上可接受的” 的成分是适用于人。

40、和 / 或哺乳动物而 无过度不良副反应 ( 如毒性、 刺激和变态反应 ) 的， 即具有合理的效益 / 风险比的物质。术 语 “药学上可接受的载体” 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指 这样一些药剂载体 ： 它们本身并不是必要的活性成分， 且施用后没有过分的毒性。合适的 载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可 接受的载体可含有液体， 如水、 盐水、 甘油和山梨醇。 另外， 这些载体中还可能存在辅。

41、助性的 物质， 如润滑剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质和稳定剂， 如白蛋白等。 0101 可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型， 所述剂型包括但不限 于 ： 注射剂、 胶囊剂、 片剂、 乳剂、 栓剂。 0102 本发明的组合物可直接用于杀伤肿瘤细胞。此外， 还可同时与其它治疗剂或辅剂 联合使用。 0103 本发明的主要优点在于 ： 0104 (1) 本发明的偶联物中， 转铁蛋白可通过转铁蛋白受体介导的胞饮作用将蛙卵核 糖核酸酶带入肿瘤细胞， 增强了蛙卵核糖核酸酶对于肿瘤细胞的杀伤能力和特异性。 0105 (2) 本发明的偶联物中， 每个转铁蛋白分子上偶联有 1-5 。

42、个蛙卵核糖核酸酶， 因此 分子大小适中， 易于穿透肿瘤细胞的细胞膜而进入到细胞。 0106 (3) 本发明的偶联物基本不混有未经偶联的游离转铁蛋白和蛙卵核糖核酸酶， 保 证了药物的作用完全由本发明的偶联物产生。 0107 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。。

43、 0108 实施例 1 Onc 蛋白制备 0109 1. 表达 Onc 质粒的构建 0110 根据SEQ ID NO ： 3所示的序列， 全序列合成Onc蛋白的编码序列， 设计两端引物如 下 ： 说 明 书 CN 101450214 B8/15 页 10 0111 5 引物为 ： CCCAGGACTGGCTGACTTTCCA(SEQ ID NO ： 5) ； 0112 3 引物为 ： AAAGTCGACTCAGCAAGAACCAACACC(SEQ ID NO ： 6) ； 0113 以前述合成的基因序列为模板， 以SEQ ID NO ： 5和SEQ ID NO ： 6为引物， 进行PCR 扩增。

44、， 扩增产物经 SalI 酶切后克隆到 pET22b(+) 载体 (Novagen) 的 MscI 和 SalI 位点间， 得到可表达 Onc 的表达质粒。 0114 2.Onc 蛋白表达 0115 将前述构建的表达质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 隔夜挑单克隆于 50ml LB 培养 基中， 于 37培养过夜。次日按 1 20 转接 1L TB 培养基， 于 37培养至 OD600 2.0， 加 IPTG 浓度至 0.5mM 诱导 3.5 小时， 4、 6000rpm 离心 10 分钟， 收集菌体， 菌体用于下一步的 包涵体收集和纯化。 0116 3. 包涵体洗涤 0117 将收集到的。

45、菌体悬浮在缓冲液 SSB_A(20mM Tris-HCl， 10mM EDTA， pH8.0) 中， 用 超声波破碎仪破碎菌体 ； 4， 12000rpm 离心 10 分钟， 收集包涵体 ； WIBB1(20mM Tris-HCl， pH 8.0， 10mM EDTA， 2Triton X-100和2M尿素， pH 8.0)溶液悬浮包涵体， 振荡洗涤， 4， 12000rpm 离心 10 分钟， 收集包涵体， 重复该步骤三次 ； WIBB2(20mM Tris-HCl， 10mM EDTA， pH 8.0) 溶液悬浮包涵体， 振荡洗涤 ( 可用低功率超声波助洗 )， 4、 12000rpm 离。

46、心 10 分 钟， 收集包涵体 ； 重复该步骤 2-3 次。 0118 4. 包涵体溶解和复性 0119 将 1L 菌液得到的包涵体溶解于 6ml DIBB(20mM Tris-HCl， 7M 盐酸胍， 10mM DTT， 10mM EDTA， pH 8.0) 溶液中， 充氮气室温放置 5h ； 4、 12000rpm15min， 离心收集上清， 将 蛋白定量至浓度为 20mg/ml ； 将 1ml 包涵体溶液迅速稀释到 50ml DB(20mM 醋酸 ) 溶液中， 4， 12000rpm30min 离心弃沉淀 ； 用 DB 透析除去变性剂 ； 向溶液中加入 20RB(100mM Tris-A。

47、cOH， 100mM NaCl， 3.0mM 还原型谷胱甘肽， 0.6mM 氧化型谷胱甘肽， pH 8.0)， 并调节 pH 8.0， 4， 12000rpm30min 离心除去沉淀 ； 在复性缓冲液 RB 溶液中 4复性 36 48 小时， 4， 12000 转 20min 除去复性过程产生的蛋白沉淀 ； 上清透析去盐后， 蛋白溶液存于 4备用。 0120 5. 阳离子交换柱层析纯化 0121 将复性好的蛋白溶液定量后上强阳离子交换柱。 0122 (1) 层析柱为 SP Sepharose(22cm， Pharmacia)， 流动相为 LB(10mM 磷酸缓冲液 (pH6.0) 和 WB(1。

48、M NaCl， 10mM 磷酸缓冲液 (pH6.0)， 流速 1ml/min。 0123 洗脱方法 ： 100WB洗脱30个柱体积并分步收集， 考马斯亮兰G250检测含有蛋白 的样品。收集含有蛋白的样品并用透析液 10mM 磷酸缓冲液 (pH6.0) 去盐后， 备用。 0124 (2) 将去盐后的样品溶液定量过强阳离子交换柱。层析柱为预装柱 MonoS(HR5/5， 1ml， pharmacia)， 流动相为 LB(10mM 磷酸缓冲液 (pH6.0) 和 WB(1MNaCl， 10mM 磷酸缓冲液 (pH6.0)， 流速 1ml/min。 0125 洗脱方法 ： 0-100 WB 洗脱 20 个柱体积并分步收集， 收集相当于 20左右处的蛋 白峰。 0126 对制备Onc蛋白过程中各阶段的产物(包括诱导前菌体总蛋白(泳道1)、 诱导2.5 小时后菌体总蛋白 ( 泳道 2)、 诱导后菌体包涵体 ( 泳道 3)、 复性并纯化后 Onc( 泳道 4) 等 ) 说 明 书 CN 101450214 B9/15 页 11 进行常规的 15 SDS-PAGE 电泳分析， 结果如图 1 所示。 0127 实施例 2 转铁蛋白 T。