一、技术领域
本发明涉及口服疫苗的复合黏膜免疫佐剂，属生物技术领域。专用于疫苗的黏膜免 疫的免疫效果。
二、背景技术
1消化道黏膜免疫的特点
黏膜免疫系统是指机体与外界相通的腔道(包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道)黏 膜表面的免疫。该系统在体内的覆盖面积很大(超过400m2)，形成动物体防御外界病原 物的第一道屏障，因此黏膜免疫系统在机体免疫系统中占有非常重要的地位。消化道淋 巴组织亦称肠相关淋巴组织(GALT)。分泌型IgA是黏膜免疫的主要效应因子，它不仅具 有中和病毒、抑制微生物吸附的作用，还具有免疫排斥及促天然抗菌因子的功能。
黏膜免疫系统的传入诱导部位为派伊尔氏斑(Peyer’s Patches，PP)和淋巴滤泡， PP位于回肠黏膜固有层并深入到黏膜下层，鸡的PP为一粉红色椭圆形斑，位于回盲交界 处上方。PP分为三个区：①特化圆顶上皮区，②滤泡区或B细胞区，③滤泡旁区或T细 胞区。圆顶上皮区有特殊化的抗原识别细胞或称M细胞，它吞饮肠腔内多种抗原。抗原 被转运到PP，在滤泡区受到加工，引起抗原特异性B和T淋巴细胞兴奋。随后它们离开 PP，转移到黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。PP内的T细胞可激活B细胞，产生IgA。
黏膜免疫系统的传出效应部分为固有层和上皮内的淋巴细胞。正常情况时，肠黏膜 固有层持续地含有大量浆细胞，其中70％～90％分泌IgA。固有层内浆细胞的前体来自PP， 通过肠系膜淋巴和胸导管而到黏膜固有层。巨噬细胞占固有层内淋巴细胞的10％。研究 表明，上皮内淋巴细胞具有细胞毒活性和自然杀伤性淋巴细胞的活性，能分泌多种细胞 因子，参与肠道抗感染免疫和经口免疫耐受的形成，并在调节肠黏膜上皮细胞功能方面 起重要作用。微皱褶细胞(Microfold cell)简称M细胞，是一种特化的扁平上皮细胞， 与肠上皮细胞紧密排列在一起。M细胞浆具有丰富的吞饮小泡和线粒体。鸡的PP处也存 在M细胞，并具有很强的饮液活性。M细胞主要摄取和运输颗粒性抗原，如某些病毒、细 菌等抗原性物质。
黏膜免疫的效应位点也是诱导位点，消化道PP中B细胞受到抗原刺激后形成致敏的 淋巴细胞通过全身循环除再分布到消化道以外还可散布到其它黏膜效应位点(如乳腺、 支气管黏膜、生殖道黏膜等)，B细胞在这些部位进行克隆扩增，一旦再接触到相同抗原， 在Th细胞和其分泌的细胞因子的辅助下，分化为分泌IgA的浆细胞。
2黏膜免疫佐剂的研究进展
目前，黏膜免疫佐剂已成为黏膜免疫的研究热点之一，它不但能引起局部和全身的 免疫反应。研究主要类型有细菌佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂、无机成分佐剂和投递 系统。
研究发现卡介苗中含有特殊的核酸序列——CpG基序，能特异性的增加抗原的免疫原 性。目前把含有未甲基化CpG基序的DNA、细菌的质粒DNA以及人工合成的寡核甘酸统称 为CpG DNA，即核酸佐剂或具有免疫刺激作用的DNA序列(immunostimulatory sequences，ISS)，当将它们与蛋白质抗原的疫苗共同使用时，可诱导以细胞免疫为主的 免疫反应。实验证实，CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)作为黏膜佐剂能促进机体对乙型肝 炎表面抗原(HbsAg)的系统和黏膜免疫应答。CpG DNA可改进其它佐剂诱导Th2类型应 答的缺点，如把CpG-ODN与CT或氢氧化铝等佐剂联用，先诱导出混合型的Th1和Th2类 应答，然后转向Th1类型的应答。
细胞因子是机体在免疫反应时T淋巴细胞产生的免疫调节物质，细菌毒素与CpG都 是通过细胞因子发挥佐剂效应的，而大多数细胞因子又具有调整和重建免疫应答的能力， 因此可直接作为佐剂发挥作用。目前进行实验研究的主要有IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、 IFN-γ、GM-CSF等。IL-2是动物体内免疫应答的重要调节因子，具有多效性、高效性和 反应快等特点，可以改善免疫功能，对多种抗原均有增强作用。IL-2在淋巴细胞的增殖 过程中起轴心作用，可激发和维护淋巴细胞的生长，最终导致淋巴细胞的分化与增殖， 维持免疫自身稳定。
应用氟化物作为黏膜免疫佐剂的研究已有报道。Sumio等研究发现黏膜佐剂NaF能够 消除口服耐受，引起抗体反应增加。鸡同时口服抗原与NaF后，血清IgG抗体水平明显 增加。尽管鸡群有个体差异，并且抗体滴度较低，但在胆汁和泪液中均检测到IgA抗体。 氟化铝可诱导大鼠T细胞中多聚磷酸肌醇降解为磷酸肌醇，升高细胞内自由Ca2+，并使T 细胞受体的γ和ε链进行磷酸化，从而T细胞进入活化的早期阶段。另外，合成多聚体 和亲脂性季铵盐也可作为黏膜佐剂。
植物雌激素-大豆黄酮是一种存在于豆科植物中的植物异黄酮类化合物，具有雌激 素样或抗雌激素样的双重作用。研究表明，植物雌激素对机体的非特异性免疫、细胞免 疫和体液免疫均有不同程度的影响。植物雌激素可影响巨噬细胞的吞噬功能。高峰等在 雏公鸡的基础日粮中添加大豆黄酮后发现雏鸡的免疫器官胸腺和法氏囊的相对重量显著 提高，脾脏无明显变化，同时T淋巴细胞对植物血凝素(PHA)的刺激反应显著提高，说 明雏公鸡细胞免疫增强。如果大豆黄酮能用作黏膜免疫佐剂，不仅可以提高动物的生产 能力，还可以预防家禽的传染病。
3黏膜免疫佐剂在消化道黏膜免疫中的意义
动物传染病的传播大多都以消化道和呼吸道为主要途径。口服弱毒疫苗可以直接刺 激小肠黏膜内的淋巴细胞产生大量的IgA和多种细胞因子，在肠黏膜表面形成一层保护 膜，防御病原微生物的入侵。研究与实践证明消化道黏膜免疫不仅在黏膜局部和其它黏 膜组织产生免疫应答，还可引起全身性的体液免疫应答，因此黏膜免疫受到国内外免疫 学家的关注。消化道免疫(口服免疫)方法简便，省时省力，操作时不会引起动物的应 激反应，特别适用于大规模养殖的小型动物的免疫接种。但是疫苗经过消化道时常受到 消化液的降解，使黏膜免疫需要的抗原量比传统肌肉注射多。因此，如何使用少量的抗 原有效地诱导黏膜免疫反应，提高黏膜免疫力成为目前急需解决的问题。免疫佐剂是掺 入疫苗制剂后能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免疫应答的物质。近几年国外研究 发现，黏膜免疫佐剂能增强机体的免疫力，明显提高黏膜局部和系统的免疫效果。
随着养禽业的不断发展，使用安全有效的疫苗控制家禽传染病的传播和发展至关重 要。黏膜免疫与传统肌肉注射相比简单安全，省时省力，减少家禽的应激反应，避免对 增重和产蛋的影响，适于大规模养鸡。同时，由于饮水免疫时疫苗只作用于家禽的消化 道黏膜组织(这些部位在家禽肉质品加工中均被抛弃)，不会对禽类产品的质量产生较 大的影响，从而有利于我国鸡肉产品的出口。为将这一方法推广应用，有良好的免疫效 果是基本前提。复合黏膜免疫佐剂的应用可以提高免疫效果，同时降低养殖业的免疫成 本。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供使用口服疫苗免疫时用于增强机体黏膜免疫力和全身免疫力而 添加的复合免疫佐剂。
技术方案
本发明提供了口服疫苗的复合黏膜免疫佐剂为，按体重每公斤使用免疫佐剂配方为： 5mg～10mg大豆黄酮+50mg～150mg氟化钠+107CFU乳酸杆菌。雏鸡用量按每只免疫佐 剂配方为：0.4～1.4mg大豆黄酮+5～15mg氟化钠+107CFU乳酸杆菌。将乳酸杆菌制 成冻干粉剂使用更为方便。
有益效果
1、本发明在使用几种黏膜免疫增强剂(大豆黄酮、鸡宿主乳酸杆菌、寡脱氧核苷酸DNA、 重组IL-2和氟化钠)分别与新城疫IV系疫苗配合通过饮水免疫后检测鸡体内免疫反应 的基础上，筛选出免疫效果较好的黏膜免疫增强剂进行复配，复配好的免疫复合佐剂 再与新城疫IV系疫苗配合，通过饮水免疫后检测鸡小肠局部黏膜免疫反应和全身免疫 反应。通过检测黏膜免疫反应包括小肠中CD3+T细胞、上皮内淋巴细胞和IgA分泌细胞 数量，空肠干扰素-γmRNA水平变化；全身免疫反应包括血清中新城疫特异性抗体和 小肠内容物中SIgA抗体水平的变化，发现复合黏膜免疫佐剂显著提高了动物免疫力。
2、本发明复合黏膜免疫佐剂的特点在于：综合了单一佐剂的优点，增加疫苗免疫保护期 长达近3个月，简化免疫程序，将我国传统鸡新城疫预防采取饮水与肌肉注射相结合 的方法简化成只需饮水免疫，显著提高动物免疫力。
3、降低疫苗用量，将以前抗原量需2～4倍降低到1倍，免疫接种成本降低了72.4％。
四、附图说明
图1单个免疫佐剂血清中ND特异性抗体水平
图2-1单个免疫佐剂十二指肠的IgA分泌细胞数量变化
图2-2单个免疫佐剂空肠的IgA分泌细胞数量变化
图2-3单个免疫佐剂Peyer’s斑的IgA分泌细胞数量变化
图3复合佐剂血清中ND特异性抗体水平
图4-1复合佐剂十二指肠的CD3+T细胞数量变化
图4-2复合佐剂空肠的CD3+T细胞数量变化
图5-1复合佐剂十二指肠的IgA分泌细胞数量变化
图5-2复合佐剂空肠的IgA分泌细胞数量变化
图6-1复合佐剂空肠SIgA水平变化
图6-2复合佐剂粪便中SIgA水平变化
图7复合佐剂对鸡空肠IFN-γmRNA影响的PCR电泳图(a为18S，b为IFN-γ)M，DNA标 准分子量DL2000泳道1为混合样；泳道2-4，5-7，8-10为第3，5，7周样，组别依次为：对 照，ND，复合佐剂组，
图8复合佐剂空肠IFN-γ/18S PCR电泳图统计结果
图9复合佐剂免疫鸡对新城疫病毒F48E2强毒株的攻击存活率
五、具体实施方式
首先，本项目进行了第一期试验。按照计划分别应用鸡宿主乳酸杆菌(公知公用，见 参考文献：于卓腾，毛胜勇，朱伟云 鸡肠黏膜乳酸菌的抗菌能力及其对抗菌素的药敏特 性 华中农业大学学报2005 24(4)：376～379)、氟化钠、重组IL-2(公知公用，见参 考文献：李祥瑞，金红，卢景良 鸡白细胞介素-2cDNA克隆 南京农业大学学报1999，22 (2)：80～84)、寡脱氧核苷酸DNA(CpG DNA，公知公用，见参考文献：崔义邦，何孔旺， 陆承平，郭爱珍 细菌CpGDNA对鸡接种禽流感病毒H9亚型灭活苗的免疫增强作用 中国兽 医学报2005 25(2)：135～137)和大豆黄酮(购自张家口宣华化工厂)为黏膜免疫佐剂 与鸡新城疫IV系苗(JAAS牧(2000)第003号，购自江苏省农科院畜牧兽医研究所)配合， 通过饮水免疫雏鸡，在首免后第3、5、7周取材。分别检测了鸡血清中新城疫特异性抗体 水平、小肠中IgA分泌细胞数量变化、Peyer’s斑上皮内淋巴细胞数量的变化以及小肠中 肥大细胞数量的变化，肠内容物中SIgA水平。结果发现大豆黄酮、白介素和氟化钠的新 城疫血清特异性抗体水平均高于单独使用新城疫IV系疫苗的水平(图1)。乳酸杆菌、CpG DNA、大豆黄酮和重组IL-2在整个免疫期内均可显著增加各段小肠中IgA分泌细胞数量， 在免疫后第三周，乳酸杆菌和重组IL-2的IgA分泌细胞数量最多；免疫后第七周，大豆黄 酮和CpG DNA的IgA分泌细胞数量最多(图2-1，图2-2，图2-3)。大豆黄酮、CpG DNA和 重组IL-2可增加Peyer’s斑处上皮内淋巴细胞数量。大豆黄酮、CpG DNA、重组IL-2、氟 化钠和乳酸杆菌均可导致各段小肠肥大细胞数量暂时性的增加。表明所用几种黏膜免疫 佐剂可不同程度增加机体全身免疫反应、小肠局部免疫反应以及局部过敏性反应。
根据以上几种黏膜免疫佐剂的特点进行复配，配制复合黏膜免疫佐剂(每只鸡：0.4～ 1.4mg大豆黄酮+5～15mg氟化钠+107CFU乳酸杆菌)与新城疫疫苗混合，试验鸡7日 龄时第一次口服免疫，免疫剂量(106EID50/羽)为正常饮水量。7天后加强免疫，剂量同 上。首次免疫后的第3、5、7周取材。分别检测血清中新城疫特异性抗体IgG水平(图3)、 小肠中上皮内淋巴细胞数量变化、肥大细胞(甲苯胺蓝染色)数量变化、IgA分泌细胞数量 变化、小肠CD3+T细胞数量变化以及干扰素-γmRNA表达水平、和肠内容物中SIgA水平。 研究发现该复合佐剂能显著增加免疫鸡群的CD3+T细胞(图4-1，图4-2)、上皮内淋巴细 胞和IgA分泌细胞的数量(图5-1，图5-2)，提高免疫鸡血清中新城疫特异性抗体和小 肠内容物中SIgA抗体水平(图6-1，图6-2)，鸡空肠组织中干扰素-γmRNA表达水平呈 下降趋势(图7，8)。在攻毒试验中能有效保护免疫鸡群，保护率达100％(表1，图9)。 表明复合黏膜免疫佐剂能有效提高免疫鸡群局部黏膜免疫力和全身体液免疫水平，有效 保护鸡群。
1细胞免疫水平检测
1)小肠CD3+T细胞数量的变化
用ABC法检测CD3+T细胞：切片在多聚甲醛中固定10min后置入0.6％H2O2处理30min， 用0.2％Triton PBS(PH7.6)洗涤3次，每次5min；经5％正常羊血清封闭20min，室温； 弃羊血清后直接加入适当稀释的鼠抗鸡CD3，4℃过夜；洗涤同上，加入1∶1稀释的羊抗 鼠IgG，37℃作用60min；洗涤同上，加入1∶2稀释的S-A/HRP，37℃作用40min；0.2％Triton PBS(PH7.6)洗涤2次，每次5min，Tris-HCl缓冲液(0.05mol·L-1，pH7.6)洗涤3次， 每次5min，DAB(Sigma公司)H2O2显色；脱水；透明；封固。Olympus显微镜观察、拍照。 对照组用PBS替代鼠抗鸡CD3。
十二指肠、空肠的CD3+T细胞数量在整个免疫期内呈上升趋势，在第五周、第七周时 比单独使用新城疫IV系苗免疫组细胞数量极显著增加(P＜0.01)。
2)Peyer’s斑上皮内淋巴细胞的变化
用HE染色显示上皮内淋巴细胞：石蜡切片，脱蜡，脱二甲苯，苏木精-伊红染液， 脱水，透明，封固。Olympus显微镜观察、拍照。
Peyer’s斑上皮内淋巴细胞数量在整个免疫期内呈上升趋势，并有“腔排”现象。 在第五周、第七周时比新城疫单独免疫组细胞数量极显著增加(P＜0.01)。空肠干扰素- γmRNA水平变化
用相对定量RT-PCR方法测定鸡空肠中IFN-γmRNA：采用异硫氰酸胍酚氯仿一步提取 法提取空肠组织总RNA。用紫外分光光度法测定提取的总RNA的浓度和纯度(260nm)， 通过变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量。用随机引物Random hexamer primer对所有 样品的RNA进行RT，获得各样品RNA的cDNA(RT product)。RT反应总体积25μL，包括2μg 总RNA，20U RNA酶抑制剂，100U M-MLV反转录酶，5μL 5×RT buffer(含250mmol/L Tris-HClpH8.3，375mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，50mmol/L DDT)，0.4mmol/L dNTP，4μmol/L 随机引物。先加RNA模板，dNTP和随机引物，37℃变性5min后立即放在冰上冷却，再加其 余试剂37℃反应60min，95℃灭活5min。根据Genbank(Y07922)上登录的鸡IFN-γmRNA序 列设计引物。IFN-γ上游引物序列为：5’GAG CCA TCA CCA AGA AGA 3’，下游引物序 列为：5’GAG CAC AGG AGG TCA TAA 3’，扩增长度为537bp。以18SrRNA为内标，因内 标与IFN-γ扩增片断大小相近，所以采用双管扩增法。PCR反应体积25μL，含模板(RT 产物)2μL，0.1μL Taq DNA聚合酶，2.5μL 10×PCR Buffer(含50mmol/L Tris-HCl pH 9.0，100mmol/L NaCl，1.0mmol/L DDT，0.1mmol/L EDTA，500mmol/L glydcerol，10g/L Triton X-100)，0.5μL dNTP，1.6μL MgCl2，2.0μL目的基因引物，1.0μL 18S rRNA内 标。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；IFN-γ(94℃变性30s；55℃复性30s；72℃延伸 30s，共38个循环)、18S(94℃变性30s；53℃复性30s；72℃延伸30s，共24个循环)； 72℃延伸10min。18S和目的基因的PCR产物均在线性扩增范围。每个样品做两次重复，同 时用ddH2O和RNA样品分别取代RT产物做对照，以检验是否有外源基因组DNA污染。取20μL PCR产物在20g/L的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。电泳结果的图像处理及灰度分析在Kodak 1D Electrophoresis Documentation and Analysis System 120上进行，根据目的基因 IFN-γ和内标18S PCR产物的灰度比，确定样品中IFN-γmRNA表达的相对含量。
空肠干扰素-γmRNA表达水平呈下降趋势，复合佐剂组比新城疫组显著降低 (P＜0.05)。
2体液免疫水平检测
1)血清中ND抗体IgG水平变化
用血凝抑制试验检测血清中新城疫抗体IgG：用标准新城疫抗原配制4单位病毒，在 96孔反应板上依次加入生理盐水、血清倍比稀释液、4单位病毒和1％鸡红细胞。37℃15min 后读数。
复合佐剂组抗体可以在整个免疫期内保持较高水平，免疫后2～4周平均比新城疫组 高2个滴度。
2)血清中ND抗体IgA水平变化
用ELISA试验检测血清中ND抗体IgA：新城疫抗原包被过夜，脱脂乳封闭37℃2h，洗 涤后加待检血清37℃1h，洗涤加兔抗鸡IgA37℃1h，洗涤加酶标羊抗兔IgG37℃1h，OPD显 色后酶标仪检测。
血清中新城疫抗体IgA水平在整个免疫期内佐剂组与新城疫组变化不明显。
3)肠内容物中ND SIgA水平变化
用ELISA试验检测血清中新城疫抗体IgA：新城疫抗原包被过夜，脱脂乳封闭37℃2h， 洗涤后加待检内容物上清37℃1h，洗涤加兔抗鸡IgA37℃1h，洗涤加酶标羊抗兔IgG37℃ 1h，OPD显色后酶标仪检测。
肠内容物中SIgA在免疫初期显著增加，复合佐剂在空肠可极显著增加抗体分泌量。
3.攻毒保护试验
用复合黏膜免疫佐剂与新城疫疫苗免疫鸡群，共24只鸡。免疫后第67天用新城疫强 毒株F48E2对鸡群进行攻击。复合佐剂组的鸡在攻毒后第4天有2只出现轻微精神症状，其 它正常；攻毒后第7天后全部正常，存活率为100％。新城疫组的鸡在攻毒后第4天死亡3 只，存活率50％；攻毒后第5天死亡2只，存活率16.67％；攻毒后第6天全部死亡；对照组 的鸡在攻毒后第四天全部死亡。结果表明，添加复合黏膜免疫佐剂后可以有效保护鸡群。
表1免疫鸡在NDF48E2强毒株攻击后的存活情况 攻毒后天数 复合佐剂组 存活只数/试验只数 ND免疫组 存活只数/试验只数 对照组 存活只数/试验只数 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 3/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 6/6 6/6 6/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6
应用
本发明所提供的复合黏膜免疫佐剂可用于多种口服疫苗，显著提高疫苗的免疫效果。 复合佐剂中大豆黄酮和氟化钠有成品出售，乳酸杆菌只需进行培养复苏即可，方法简单 易行，适合生产应用。如将乳酸杆菌制成冻干粉剂，应用将更加方便。同时，复合佐剂 成本低廉，每只平均为0.2836分。目前生产中新城疫的免疫通常都要用IV系和I系疫苗 搭配使用，IV系疫苗口服量需加倍，成本为1.2分/只；在1月龄时用I系疫苗注射，成本 为2.0分/只。一共需要3.2分/只。但使用复合佐剂后，可以降低IV系疫苗的用量，成本 为0.6分/只。通常商品肉鸡生长周期为40天，复合佐剂组在免疫后第82天对鸡群仍有 100％的保护率，因此可以取消I系疫苗的使用，减少动物应激反应，大大降低养殖成本。 以10000只肉鸡养殖为例，按传统免疫方法成本为(1.2+2.0)×10000＝320元，如果使用复 合佐剂其成本为(0.2836+0.6)×10000＝88.36元，降低率为72.4％。